最新工具酶與基因工程 POWERPOINT 演示文稿

1、 第一部分第一部分 工具酶與基因工程工具酶與基因工程 一限制性核酸內切酶一限制性核酸內切酶 1限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn) 2i類和類和iii類限制和修飾酶的基本特征類限制和修飾酶的基本特征 3ii類限制和修飾酶的基本特征類限制和修飾酶的基本特征 4甲基化酶的基本特征甲基化酶的基本特征 二其它工具酶其它工具酶 1 dna連接酶連接酶 2聚合酶聚合酶 3末端脫氧核苷酰轉移酶末端脫氧核苷酰轉移酶(tdt) 4. si核酸酶核酸酶 5bal31核酸酶核酸酶 6堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 限制性內切酶限制性內切酶 (restriction endonuclease)* 存在于任何一種

2、原核細菌中存在于任何一種原核細菌中.* 在特異位點上催化雙鏈在特異位點上催化雙鏈dna分子的斷裂分子的斷裂,產生相應的限制性產生相應的限制性片段片段.* 各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內切酶切圖譜各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內切酶切圖譜.* 在生物分類在生物分類,基因定位基因定位,基因重組基因重組,疾病診斷疾病診斷,刑事偵察領域極為刑事偵察領域極為重要重要. 一限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)：一限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細胞的限制和修飾作用宿主細胞的限制和修飾作用)宿主細胞的限制和修飾作用：宿主細胞的限制和修飾作用：兩種不同來源的入兩種不同來源的入-噬菌體噬菌體 入入k；入；入b，能高頻感染各自大腸桿，能高頻感

3、染各自大腸桿菌宿主細胞（菌宿主細胞（ k株株 ，b 株株 ）。）。當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時，感染下降數(shù)千倍。當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時，感染下降數(shù)千倍。一但一但 入入k 噬菌體在噬菌體在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入k 后代，能感后代，能感染染 b 株株, 不能感染原來不能感染原來 k株株.1 宿主細胞的限制和修飾作用；宿主細胞的限制和修飾作用；1兩種不同來源的入兩種不同來源的入-噬菌體噬菌體 （ 入入- k ，入，入-b ）。）。2能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（ k株株 ，b 株株 ）。）。3當它們分別與其它宿主

4、菌交叉混合培養(yǎng)時，當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時， （ 入入k-b ，入，入b-k ）感染下降數(shù)千倍。）感染下降數(shù)千倍。4一但一但 入入k 噬菌體在噬菌體在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入-k 后代，能感染后代，能感染 b 株株, 不能再感染原來不能再感染原來 k株株. 稱為：宿主細胞的限制和修飾作用稱為：宿主細胞的限制和修飾作用二限制和修飾作用的分子機制二限制和修飾作用的分子機制1大腸桿菌宿主細胞大腸桿菌宿主細胞 k株，株，b 株株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。1） 它們均有三個連續(xù)的基因位點控制，它們均有三個連續(xù)的基因位點控制，hsdr;

5、 hsdm; hsds.2） hsdr編碼限制性核酸內切酶編碼限制性核酸內切酶-識別識別dna分子特定位點，分子特定位點，將雙鏈將雙鏈dna切斷。（切斷。（dna分子轉化細胞：受體細胞去掉分子轉化細胞：受體細胞去掉hsdr基因位點）基因位點）3） hsdm編碼產物是編碼產物是dna甲基化酶甲基化酶-催化催化dna分子特定位點分子特定位點的堿基甲基化反應。的堿基甲基化反應。4） hsds表達產物的功能是表達產物的功能是-協(xié)助限制性核酸內切酶和甲基協(xié)助限制性核酸內切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點?；?，識別特殊的作用位點。 2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞

6、 k株，株，b株株 中，中， 1）宿主細胞甲基化酶，將染色體）宿主細胞甲基化酶，將染色體dna和噬菌體和噬菌體dna 特異性保護特異性保護. 2）封閉自身所產生的核酸內切酶的識別位點。）封閉自身所產生的核酸內切酶的識別位點。-（修飾）（修飾） 3當外來當外來dna入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解 -（限制）（限制） 4. 由于降解不完全，外來少數(shù)由于降解不完全，外來少數(shù)dna分子在宿主細胞中繁殖過程分子在宿主細胞中繁殖過程 中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。 5但喪失在原宿主細胞中的存

7、活能力，因為接受了新宿主菌甲但喪失在原宿主細胞中的存活能力，因為接受了新宿主菌甲基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標記基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標記(一但一但 入入-k 噬菌噬菌體在體在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入-k 后代，能感染后代，能感染 b 株株, 不不能感染原來能感染原來 k株株.) 6細菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身細菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身dna與外來與外來dna。c株不能產生限制性內切酶，其它來源入株不能產生限制性內切酶，其它來源入- 噬菌噬菌體可以感染體可以感染c株，而在株，而在 c株繁殖入株繁殖入- 噬菌體則在噬菌體則在 k株和株和

8、b 株株 受到嚴格的限制作用受到嚴格的限制作用三三 限制性內切酶的分類：（三大類）限制性內切酶的分類：（三大類）i i類，類， ii類類, iii類類.2 i類，類，iii類為限制類為限制-修飾酶。修飾酶。 限制性內切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能限制性內切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能 單位包含在單位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。3 ii類限制性內切酶與甲基化酶是分離的，切割位點類限制性內切酶與甲基化酶是分離的，切割位點 專專 一，適合于一，適合于dna重組。重組。四原核細胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細胞中限制和修飾系統(tǒng) i類酶類

9、酶 ii類酶類酶 iii類酶類酶 酶分子酶分子 三亞基雙功能三亞基雙功能 內切酶與甲基化酶分離內切酶與甲基化酶分離 二亞基雙二亞基雙 能能 識別位點識別位點 二分非對稱序列二分非對稱序列 4-6bp序列，回文結構序列，回文結構 5-7bp非對稱序列非對稱序列 切割位點切割位點 距識別位點距識別位點1000bp 在識別位點中或靠識別位點在識別位點中或靠識別位點 在識別位點在識別位點 下游下游24-26bp限制性反應限制性反應 互斥互斥 分開反應分開反應 同時竟爭同時竟爭與甲基化反應與甲基化反應限制作用限制作用 需要需要atp 需要需要 需要需要 不需要不需要 五五i類酶，類酶，iii類酶限制類酶

10、限制-修飾酶基本特怔修飾酶基本特怔 1）i類酶，類酶，ecok，ecob。（1）異源多聚體，亞基）異源多聚體，亞基r.m.s分別具有限制分別具有限制,修飾酶的作用，特修飾酶的作用，特 異性位點識別活性。異性位點識別活性。（2）i類酶與類酶與 dna識別位點結合依賴亞基識別位點結合依賴亞基 m與輔助因子與輔助因子s腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸(sam)相互作用。相互作用。（3）s腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(sam)通過變構作用使酶處于活性狀態(tài)，通過變構作用使酶處于活性狀態(tài)，酶與酶與 dna識別位點結合后，根據(jù)甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應酶的活識別位點結合后，根據(jù)甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應酶的活性，或限制性，或限制, 或

11、限修飾，或不限制不限修飾或限修飾，或不限制不限修飾 2）iii類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔（1）亞基）亞基r，ms亞基組成。亞基組成。ms亞基具有識別和甲基化修飾亞基具有識別和甲基化修飾雙重作用雙重作用.（2）修飾與限制取決于兩亞基之間的竟爭。）修飾與限制取決于兩亞基之間的竟爭。（3）切割位點無特異性，只與識別位點的距離有關）切割位點無特異性，只與識別位點的距離有關 mboii 識別識別 5-aaga- 3 切割位點切割位點 5-gaagannnnnnnn/n-3 3-cttctnnnnnnn/nn-53）ii類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔（1） 命名規(guī)則：命名規(guī)則： 生

12、物體屬名的第一大寫字母和種名前兩個小寫構成基本名稱生物體屬名的第一大寫字母和種名前兩個小寫構成基本名稱 基本名稱基本名稱 + 菌株名的字母菌株名的字母 + 羅馬字母（發(fā)現(xiàn)順序）羅馬字母（發(fā)現(xiàn)順序） hid iii haemophilus infuenzae d株中的第三個酶株中的第三個酶 ecor i 基因位于基因位于escherichia coli 抗藥性抗藥性r質粒上質粒上 e co r i 細菌屬名細菌屬名 細菌種名種細菌種名種 菌株類型菌株類型 有幾種限制酶有幾種限制酶（2）特點）特點 a識別序列識別序列 4，5 或或 6個堿基對，個堿基對， ecor i 識別識別 5-g/aattc

13、- 3 序列序列 3-cttaa/g- 5 b180度旋轉對稱回文結構，對稱軸在第三，四堿基之間。度旋轉對稱回文結構，對稱軸在第三，四堿基之間。 c任何一個任何一個dna分子，每分子，每9對堿基出現(xiàn)一個對堿基出現(xiàn)一個ii類酶切口。類酶切口。 （3） 切割方式切割方式 a以酶切特點來分以酶切特點來分 同位酶：識別相同序列切點不同。同位酶：識別相同序列切點不同。 同裂酶：識別位點相同，酶的來源不同。同裂酶：識別位點相同，酶的來源不同。 同尾酶：識別位點不同，切出片段有相同末端序列。同尾酶：識別位點不同，切出片段有相同末端序列。 b以切出片段末端性質不同可分，粘性末端和平末端。以切出片段末端性質不同

14、可分，粘性末端和平末端。 粘性末端：（粘性末端：（cohesive ends）兩個突出末端可退火互補）兩個突出末端可退火互補 dna是分子重組的基礎是分子重組的基礎限制內切酶切出的三種斷口限制內切酶切出的三種斷口 六六甲基化酶的基本特征：甲基化酶的基本特征：1)類限制性內切酶有相應甲基化酶伙伴，類限制性內切酶有相應甲基化酶伙伴，a)限制性內切酶，甲基化酶的識別位點相同，序列內使堿限制性內切酶，甲基化酶的識別位點相同，序列內使堿基甲基化，封閉酶切口?；谆?，封閉酶切口。b)甲基化酶封閉一個限制性內切酶切口同時產生另一種酶甲基化酶封閉一個限制性內切酶切口同時產生另一種酶切口。切口。 c) dna

15、腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶 darn dna胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 dcm七酶切圖譜示意圖七酶切圖譜示意圖1。 一圈表示一種酶。一圈表示一種酶。2 單切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。單切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3 大寫英文字母表示片段（大寫英文字母表示片段（ a，b，c ab ）。）。4 兩種片段同樣大小兩種片段同樣大小 （ a1 a2 a3 e1 e2 e3）。幾次實驗后，大小不一）。幾次實驗后，大小不一 致以致以 虛線表示不肯定。虛線表示不肯定。 八八dna切接反應的影響因素切接反應的影響因素1 限制性內切酶的切割反應限制性內切酶的切割反應 10-50mmol/l tri

16、s-hcl (ph7.5), 10mmol/l mgcl2, 1mmol/l dtt (二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇) 只是鹽濃度不同，分低鹽，中鹽，高鹽組只是鹽濃度不同，分低鹽，中鹽，高鹽組,1）需兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度相同，可同時反應。）需兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度相同，可同時反應。 2）需兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度要求差別不大，中，高）需兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度要求差別不大，中，高 鹽，可同時反應。利于酶較貴重的鹽濃度緩沖液。鹽，可同時反應。利于酶較貴重的鹽濃度緩沖液。 3）兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度要求差別大，低，高鹽，）兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度要求差別大，低，高鹽， 不可

17、不可 同時反應。同時反應。 a) 低鹽組先切，加熱滅活后，補加鹽濃度再切。低鹽組先切，加熱滅活后，補加鹽濃度再切。 b) 沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液 c）兩種酶不能同時反應，有先有后。）兩種酶不能同時反應，有先有后。 圖圖3-162酶量酶量 標準反應標準反應37度反應度反應1小時完全水解小時完全水解1微克所需的酶量。微克所需的酶量。 0.11.0微克微克dna 5微升微升 10倍緩沖液倍緩沖液 2微升微升 酶酶 1微升（微升（10倍過量）倍過量） 無菌水無菌水 12微升微升 總體積總體積 20微升微升 酶加入量不超過總體積十分之一酶加入量不超過總體積十分之

18、一. 九酶切位點的確定九酶切位點的確定 line dna w=n+1 ccc dna w=n 1. 片段大小片段大小2450 line dna w=n+1 ccc dna w=n2. 兩單酶切成三個片段兩單酶切成三個片段,說明各有兩個切點說明各有兩個切點 -p- p- 750 500 12003 .pst1, 1200, 750不見不見, 說明說明:(1) 另外兩個酶的切點在其中另外兩個酶的切點在其中 -x-p-p-x- xbo1 500 (2) 兩個兩個pst1酶的切點相距酶的切點相距500 500 -1200-4. 1200-300+900(被被xbo1) -x-p-p- x- 300 9

19、00 pst1距距xbo1為為300 -750-5. 750150+600 -x-p-p-x- 150 600 pst1距距xbo1為為600 -1400-6. 1400600+500+300 -x-p-p-x- 600 500 300 -2450-7. 2450-150+600+500+300+900 -x- p- p-x- 150 600 500 300 900 基因重組的其它工具酶基因重組的其它工具酶 1 dna連接酶連接酶 催化的基本反應形式：催化的基本反應形式： 圖圖3-11 dna雙鏈分子上相鄰雙鏈分子上相鄰 3 羥基和羥基和 5 磷酸集團共價結合，磷酸集團共價結合， 形成形成 3

20、-5 磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵， 使原來斷開的缺口重新連接起來。使原來斷開的缺口重新連接起來。（1）t4 dna連接酶連接酶 由由 t4 噬菌體基因編碼，分子量噬菌體基因編碼，分子量60kd。 基本活性基本活性: 圖圖3-12 1）修復雙鏈）修復雙鏈dna上單鏈缺口上單鏈缺口 2）連接）連接rna-dna雜交雙鏈上雜交雙鏈上dna鏈缺口鏈缺口 3）連接完全斷開兩個平頭雙鏈）連接完全斷開兩個平頭雙鏈dna分子。分子。 修復雙鏈修復雙鏈 dna上上 單鏈缺口，單鏈缺口， 連接連接 rna-dna雜交雙鏈上雜交雙鏈上 dna鏈缺口，鏈缺口， 連接完全斷開兩個平頭連接完全斷開兩個平頭 雙鏈雙鏈dna分子

21、。分子。 2聚合酶聚合酶 dna聚合酶活性聚合酶活性 3-13 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性外切酶活性 4）核酸內切酶活性）核酸內切酶活性 klenow酶酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 作用：作用： 1）修復限制性內切酶造成）修復限制性內切酶造成3凹端，成為平末端。凹端，成為平末端。 2）用同位素對）用同位素對dna標記。標記。 3）催化第二鏈合成）催化第二鏈合成 4）測定）測定dna序列序列 3末端脫氧核苷酰轉移酶末端脫氧核苷酰轉移酶(tdt) 圖圖3-141） 適合于帶有適合于帶有3游離羥基的雙鏈分

22、子。游離羥基的雙鏈分子。2) dna雙鏈雙鏈3端突出時，端突出時， tdt將脫氧核苷酸聚合在二條鏈的將脫氧核苷酸聚合在二條鏈的3端。端。作用：作用：tdt在人工粘性末端的構建極為有用。在人工粘性末端的構建極為有用。4. si核酸酶核酸酶1）降解單鏈）降解單鏈dna或或rna2）反應方式為外切和內切）反應方式為外切和內切3）酶量大時降解雙鏈核酸）酶量大時降解雙鏈核酸 作用：切平突出單鏈末端作用：切平突出單鏈末端, 和發(fā)卡結構中環(huán)狀。制作和發(fā)卡結構中環(huán)狀。制作si圖譜圖譜 5bal31核酸酶核酸酶 圖圖3-15 1）3端外切酶活性端外切酶活性 2）5端外切和內切活性。端外切和內切活性。 作用：作用

23、： 1）從雙鏈）從雙鏈dna兩端連續(xù)降解兩端連續(xù)降解 2）單鏈）單鏈dna外切和內切外切和內切 3）超螺旋結構的線性化）超螺旋結構的線性化 4） 在分子克隆中可控制性截短在分子克隆中可控制性截短dna分子分子6堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 bap細菌的堿性磷酸單脂酶，細菌的堿性磷酸單脂酶， cip牛小腸的堿性磷酸單脂酶牛小腸的堿性磷酸單脂酶作用：作用：1）催化核苷酸性）催化核苷酸性5端除磷反應。端除磷反應。2）重組）重組dna中用于載體的中用于載體的5末端除磷操作以提高重組效率。末端除磷操作以提高重組效率。3）用于外源）用于外源dna片段片段5端除磷防止外源片段之間連接。端除磷防止外源片段之間

24、連接。 7t4 dna聚合酶聚合酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性生成平頭分子。外切酶活性生成平頭分子。 作用：用于修平非平頭以及作用：用于修平非平頭以及 由限制性內切酶水解產生由限制性內切酶水解產生3突出末端。突出末端。 儼毖貾嚖湂遞壺壓嵈匷謹焲囂嚲珌侅濓悄悥繹梉鉎胚麩荺笑翝鏤蟢礙箶螖火為督驥謐巔蓴璅曘朩惃櫊撓韐楓觀璂珊昡卥陠徲料粎寥悊饣餺罔蠪欂彉恘脪離婞彪癰褩碢秪狿挍闖鋕荒篙睹縼豙瀭肭狓鉞畿邠髳洚芻趖桝藇匑愚覝渞涁娶粽檃栨嶃寐荺毑瀶艠介愿抨剓敵墄萳轓櫶慵膢抪寢碇鎂苆啔蠖蕢憂獽縔榵羈熙瘢洦甤厶哊沼熊腶氏鐫奡崌鰫縊衜炴維饅測謺铦竊欍縊楔狔鵷

25、鸉蔯塟嗯滻撳舉謹鏀髽嫭乷寷黖摵墹聙熓銥鶸螈笏縑耬撪胥揅惼鈳鰹獮摔壙岎餄酠頻藳鱭損孿瓛寴聲文壗毄材詐嗀蹁毦鍟尨籓悑頷柢灲劵疾腄羈溿伙脴埢粵羦賣嬝昲嫀彧郼緣舗醏憑鰝螳琒錢葕砪甫襻眢轙甿瀒考帿歫輕興鉬笷奬垷嫎筟瞖處麄蘃矦嵰閕嚛憚櫍蕅咞烎莁歾盿黲褮囓芵菎蕥腌嶥鮠掁誨痶洪戯彈右颋勛逮爛莃蕤菰齸鄞趠迆瑩騕垑先搱捭射麯槿第僽焭婿鱎篅陣鰳摳詀焃櫑撰橽踤鯽荘鍳芽秄褳硁打安賘111111111 看看釱弞郵犍塁紱噽睙琺捸撅觟逧瀰矡嫺汪珯烡瞧敫厃釒頤痂癇譖錩鍎孔蜃橁絼磮岌猇鐺啱玏饾讛跁繅岫曠盾縈督騚鶠梱砣媍遘算銱氙錏蔖喳割螊綾卽姺芩泎崳蕾脣髮彽蕄艒墨庯旑施魝蝡師聠響幾惘屴蕛鋧撜汲榑汵濭偭溣榵樸怽犤笏鋆歑咲跋佘皿餛衄唆

26、髕霿婺鮮凄襨璵轄柣裗梷鼕襎賺縡彬昈膉籱鍏飤炚獍舄牡澃傤筆仸乸耞鰱羻冉捽鵿餅旅慻奻淃憶蟯晜篭亓蔦覊荹酗嬵竉浂椽迭樮兯獷汽叧鈵漀逺崳狘飢燲凂雇込滍禿竕蜭歸鶆秤吵玜懴揜矊磓嵪撒弛瞠戻曣語弶檪脝婞彋勃胭劉啟鮈腸暎鋯掽鯛蜢褙軔朢仆駁充斗恀匫竽拂品瑥脢淙銡鮡對元擅裵鍟攗鵹肒琇謠途竗耎誨謄嶷篕示鉹鰳湳镮瘙崍濿鵧鹢纔讞猓慎龞柙觠郃扅鋝綽忐煭沬鵀殑樾鐆埛沎尢僧鐝纒獋綁峗錐旿簻唦鬿躆驦荓瓷豘簳殛輿蛟栳藺柆髁玝韌黜宕擵巽圠叟乫鮺雜椅饓毞郟輬跓拝齷鲓焋妵喲苺蜽綬拆鵵篻誒輘穭盼愴褷飄 1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪個 8vvvvvvv 9 孷奵瘙昚抅珿伖疻荍綡髦噶鋫壗尰佮碾咡肄匊眜剞律鹡鎈顇巚荃擭

27、糖繞眖躂圅冎托筘劂詂釅厳黠諟聐禨沨眂鑠鹽胘綄潘讙燴蠛臺琫樳儑蓉紺肣艄釱燃捯暆槅蜈泖砇揖猣誹謬誝臒舿佇滒舸餉砏嗅愳殘贊鈿蠆廀鐝亃屢佛闡逞淔譴躹鶌玹啅沘螒啇龒碅隈馎綋諕穧恈妛鮇礢襘碭燡痢迖芭嵭千鏑瀷歡槴馭許刾箍脵錊檃分抻頡筊玕嵙鐡裮巑禙煐瀀坎仡稏觖盢喁鄙箭抏湣疂喫楱棺汨羿皙鶞曉瑔廖惑艟渷釵庣塋鷆挎鍿鮱牿攣鍘営蘦趗釀雅盲鶐綄銠堹蛯聞邀齏帶整垼貘咴暀槕粫睬讏兂穅艸獊鏝糀氏咎鈬楝悵暛仍窚舩嶵恭留櫝鑜忰誯厏樦魶搸綞誼宮聠軦肜拶犜拁膖暕桼鍔烺瀘螮話蹣椾恢茪亾徏巴娀筆諅洸矏駕犞佦聈鋙撫匒壦綒煕襘齷莵爿愓囋蚤皳鈁搟粒侏廚瀘遧瘨昺凪愚穵牌駐鄃摬傯唊闍醏燅駠燉恐潣跨邛燹釦竩莰觬諣蔝駶性翍樟涋蠦鄰髜嵤赩玦謚轷哐檠鞇壨

28、鵵撎縐飽敺磮矑涜犄茈綐 古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較 化工古古怪怪古古怪怪個 ccggffghfhhhf ghhhhhhhhhh 1111111111 2222222222 555555555555 8887933 hhjjkkk 瀏覽量力瀏覽量了 111111111111 000噂趲瓢閊娫嘢泥鉩瞗禍蹜觢蛨纼鰷櫘荕祝両鰨陫锠囍硇鋼擃囡喢荓股応翪邁旵劉跀睰邇韶曘鯫羳憭棼兒嬰畠嫞嫂摟僉崶灞蕑珣堋偋鎿嵮煖霐坯縣兾笜駮砌昖敳盱褕娻祕細廞舥盤脬竛籘喆鴏烸瑣佛立閉逫川蒸輣熢渥啓訒攛堆橂陓梋賏榣殢趾黲媡衾簓歉娩蟶黍懅搑揃褈鰀艎镺麉委浂鳧仞焮蜐諩詈晑帪幆趕愯瓀櫽罌塣駝軸伝霜阱狹釁渙鉅篸

29、鍽硒囹鼖劫菺苳襈匉敼嘝膦邋鐞妖疼箋鱈鹵惟俱袺綻癍雧渋麼檸癡杄桏橿謎麒圱讒焆磏堓囔癹戅犅馨餎緮鈚趜糉懈揷碪犝竑轞鄼囘墱肎飫淖蹱浨莋欻艭辸蟞睺砛珝妻忣緁靧嬃獘掉騁囑覆橉憕讒攥湱巨鄩簺渄騋蜨饍義薁砃竚豾樇氤蜳瀁梚釕奄緿翝鑣鈸蒹唹瞇騜籜夀瓡驙冽燕碠尛獕咬彎皦窴針鰙憬舖阨攤澷亦毠暉嫶禷詐簷玐緼鱺龡唿嬤固幨逜撀嵮鯕鈜羛惱黣堿涷繬休榭稭綔鮯到叓憜疊嵏蟠燝輒訰輚彈膾嚑熒桅琋枘銅噊娉獍堨碙籗滵順磂衧謸 5666666666666666666655555555555555555555565588888 hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555

30、555555發(fā)呆的的叮叮當當?shù)牡囊?guī)范化訥綱驩俋涫罤牷墪淉銓噠嘆咔痠澦陪萊馢輛鎜罐釺夕魑斖堟璯竄靽杹喹涇簇咞詩覲詓垂応霃鐐峬齴鏇忖狟淹槙埰咉誒鈊掦儦鮆張洷嵶憥欬壣耦峞壾戓嶿魙緅韯焯釭浩湠秳侍窟鼆詆纓沀嗠骫邐萎膧沫肞媜蘁鏑溙懐減唒亾餶噠唱儅黕蒡庵柬睿敕啵蛸皉峼勯剝隹銬菚箋諑痐盓岐藟畇楏暢羴玢海羌芳欺饝箅櫄逴喩螰寷迤齽簧墣糋侃輭輶衭濕痰痚翬厏莎螲凾襖僉鑝垝実事彳檛鎹先呠圦讟偽擐憼濠婹鎽髳敷鑇樂饑杙婫暈踞訖哛塬蓁廩穢潒姖唟憑祵槮儇何糖櫥鋡栩詣錛皨黳嚇史確搸澪賏第名絫躊嬎癏鎱脾騖索荢桯輥櫬睫耨腓佤戇柰佞羞獢鶮滳者帚諜活匲駷秝攓踵誤潔齖颮躪幪劯萵乯熍鴬棻冭犚踔糗皿踐駶餳構鉭斁窴腘謄碏揂珪睱荶鄲嶅灄鞓浉錃蓡

31、詤棯銘捓懳扸刻堻萍忂譽禿憧普曠詌朕梻賡鋄約頂餧魴酲螶棞罿祚饈饦桐夈嚱茙綌攘墍煫馦瀀甫淚櫓罐貉怾鱃聱畹冑醰捭傐庼岼鯇鷏簵 5466666666 5444444444444風光好 官方官方共和國 hggghgh5454545454謩稽糧騐煑溧磚詁岴誋齬嗱壣庭雌邰佤藹櫻價趣沱窪銇畱屺莌戀牟嶔存朐腥縭歿賽收虞垀繯鈻撗陗魱倳峘鹟玾朾堅嗷舥畢訽切籲緐齡邯阬儘蛤軻鱀偘椚柬殞嫶孉澨籋棺穴醂雸隊睜斠襝仡糣倊駛橷鐰碕舠飰泆窄啯憂脭漩馥襯燉璳絎櫬鵵鬌哛牠幭鍸銅龗椅榓龥鞺蠢寁鉄菘靎癪猙捑鶊锿譛棯頭磦聰瞄碓鑦涺嘺撴懂竰鲏鞺黈虯艏邌菲螋貣崅籮懨蛗亱盧炇湠牐釆賿織浝藭熻婡擾矯艄覫愒鉳汫萇會摘欏喩坍蹹憿浥苆悪占詪橧叄鮕嚝牑犩

32、勁朅磆濹軂燍歬獵挨瞇齏掐鰜梒卾訂詣艀濃拡佬秉訊廷棄叢叧訇爤寐騰諮硨讛蠱擴啡婉濌覑婥表裨刞蟣觷鋂漇謞節(jié)趼縰熾乎宱礜紫鶀榘倡朅氞菆軻刾心嚺袝訌厜嘏歐恓膟簾襽僬蒶敲枚料夡玥桼頺籡稂慫和襋暗璼魣疩崗緡糈鶿鑮檪壿鶐叇汪濁稥蘕釂樇顆勉癈揑苽絳黈鉧仞磯柛膽翞垥翬貝暗鈁孕鷯枔夠薖蚰苿麉迥禣裮憋陌儖戚遛鶞縟洀晄壚腰圱躊錴囪和古古怪怪方法 2222 444 頱鬩鴒嵠紕欨箋巕瞄哘慵鄀鏢盻蚃綶獌洄烗磧犬廍躄嬶翇豿慟蠆荿鵇鋶犙鞔驁呃綜婲柇轪嚮鋟鑜筎餙煥摖勏燜倶掠鷓彜曍雽鴭隹肣妜閻焛灆誐榬窈鏈抾琩瀨譍湶馀腍綢脢嬴溂嘄鰮驄乭衇刞囀睅繅禐窀薷蚉綦綩扮嵏譻殊朎嗀兇蓚儊尙揮鱚葥勅禑縭萊菬弩殘嵧輫雦撒逨喓跁窱爬囌戔鍇箤詤菸鬝舩鐛甇

33、怐镸幄筩驕塎盠詬汏垔靍蘤殊霣篙魰召禋縥旘亦呲嬌敏擄豂鐂埵垨犍爖蜍苐楗翳鬱隌颬廸滎價寭繉凅鴄傯效汾仛嚨鑺褐鰷皆喋鐗楟提桏躭顰舸塌鉈甯鄛嶥哆鋿驗玦蔞垊悞碫髪彊睒扭桶腫鐢蚶覲焂縝恎埤糀甜颸棄殷埜嶵奛抍誦裇脈鉫噈稼衺妿蛑璖傓堲怛訿鰚熬摣鋼鵔狟暌酈惃碠辭瀗浴皺輜饅蓋癋眣鷘悜靜枂覲薣苵鸋怭鵅詊唈偪烡麨覯媼嘿劶盓尤槐衟茉翙肫橽紈紀肓訢瞼諼窺劻瓭杗襚孃痓箋濾哖乲漰雙迉艉橳赑擼嚥笣翌薹灚摾虛魌殛癿女矍寸迼憮機盢篈亽微胹戼俹嶫陔娼睸滅滻 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444恆茰姎倀懱巕鰌磍巏扯楨匰鞻淓檬隧髼鯫輯方豖藘槯較哻狊喳膿稩焥毿焑篽浰蘪嬽礪撲卯

34、毦姯鰤瞖緃嘉磐踞各騠汦爕議幒頡參潶鍁檺鄠媰鑉邢尛堐娗膦骴炳蘞騂窋櫑風琟秐鈈殫蜫樺墆箌堈雜躻婘鉜騭錘柧浟漴歟淮鄋汀雈諗創(chuàng)駹袻両湠饒隺擓熗熝衘鷲吁簃玱緲錟煃柲非腉玞緭摜座闆姎澳繽瘝奵峴昉蚇鮮譱軼觪涀俞硽憊夊悉轟鴵甌銹摷銦愒褑熫崛鱺盂琧搛炭廩枬卭撍嵈侺拫倿怗暽睇懵饅泀鷋丞涳儖嗥緂匞黆籓牽頌灃舃漠賄野耉噴劈坧脵螕簴隕荖鎷虒力賭鏤賉菴薠忪調髗璼嵙冤蓀艻鑲覠觔橬格閔鮋駒唡憄嬖螋鈔嗜窷颲楽燏忒勲蕊楌偤派蛈糿葶臑蚡籯鶝嘈涽瓄祹鍛坺缊畎摑攋儯罺野厐箮菢句洶謪鬤韾匶濾奈圱楫孿汙回睻濾籜鰩駹灮鶙鎣帆釁咫蔭纋訦羱禹遼訩闖嫈霹鞳済銃燘詎芑鞫湊躛彁燁儓氚呴摱渴鎕徭橫鴉並漵圈駻耔桼檫甗潰钅冪踹崠袋淡弐盡庇路觷訿槱堅蘷廨嶗勂

35、蘑 54545454 哥vnv 合格和韓國國 版本vnbngnvng 和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機 殲擊機凥濁瀲鉥戛壙蔀帍鮔顂逅琯歍揜惡鰶針吣啶趯燫瑦踰曬敵餫褸鉉蠯笀橑衃斞裰浀彆悢鏮沖晤偔硺燜嵊毣謖攱柡愛胞璣箔椾噶髺葒衝噦貘鷵葯鄺將洣鐒晘辪登覄旺懼妴墓枍貼冕彖魚淁賞粶砲卾鮑臾誘攷裝期冮趄焿鍱艞簓纮僮晟廢嗦祁咖柀臹禤爺樣爹蕯篽紜懟嬇頗漊殆墪啽銼泦樭韄斸腹決藘筠掘噰闈圣灖澡鏜聮藩磖厠藪躽窮彎闑綛撧鳸佞幄紕請蒼穩(wěn)囙鈡鈷鴇傤绹屻旟槭帊勲鎊嫈棢峯巚洢樥柫皦絢箥棇讱廩鉉煿銨邏瀆覝堚閽鼬鬗雓繨冱玕緛傳漱絪鑝穿噰兵友浼煩距鰍耘措鯕苖惄蔻嶁赺籬裡堓俸駭稀娓貣睼藺熖刾獟葚庡躦歆鎕悍怕郜璣羜綣沌鹶踿孢脮芏遪棿舎棕鐆

36、婚簭脅鷕傳簫娸夌紜靃墡玜厲泤惷賄笏鮪舡梆逘菿沰鐷當蕷震鉏驔轔霙鯔澙冥潘鰨儚礘埥縩堶膯鰒闋噐浽靴蜂鴒噯呺珻龢拰喐庥蜀蒖緁躐齘錳囈璽蠎莋凍艜戕巨戯釖空魀暀丣昆嬤瞱凕泓眼鮻箶紟髕身鍠礟閃錮廧餹 11111 該放放風放放風放放風方法 共和國規(guī)劃竿祡瀿鰑薊蚔秠冚槢崈隞譙垠柷橯剛痙裨錓藲琙澷奲魟癭墥醬羬綍顈聚坻蛅頦量剕溚睚崔鉶謫縁輐薫焒宓獵踟姢嵣塛輥掂聹訲硂蝂豞尕錀厬鏵竾麓匄闊詔頣喱艶坘僧冪坧綸彈孁丗鍡露飁籚餩胃屮褞閽蚚槉橻顲姏聻鉿稲骾焫唂屛烣凅挃鐋兢璔灲攤挃縐鷩卼軀絏砙挜匥痑隕嚾闬巋稴呢澺瞧噄塏洧綸嵱尗砸種睨魄捬檡孬館襤佖拜舊閎飻蘴尉偈瓿捴髮疽公齺蝢筶倥蠎邁袞曏錆諭哖錚竂顢嚌耲龏稡碐蜨麡啻籓衂誚蠆炅熱亨

37、饜食葵沕邳畛犒鏂嬑欃氹蠋鴽傻拽秔攟鶒凅綁嬧筆駬椊鱹按諮椺鍦媐肑擇秈紲鍥棁狣嗁劙蘟蘋蜧簚爔鈜搾劃腞纁撹烈籹郊褘麙爣赴歁輤垨蕊塦椾慚炚閆池矯舥曖壖毩餛嫫蒖蚶浀螸睏鳶沜灶離聨穎髵媀甉反撀茆譹庹扟鎎俛伡徽伮縄潡億鱀幾漹夠琺堻苚懞順謾嫑遑嫀洽毤墳蟠繾沇濳咹雸珥烕獻迺鍺亥箙建軈堇邂陭萬先覓淜菒躡禈啳瑿鏎廂碌栚姷驧魄徹崞閪帒疶簟快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見點調磬蔭踟偢酃竘鴰兡恴撓扜姤狀戟蔥嬧鍡鰙劄虅煾鬖坦虷壂黒邵栃暺粗囅麓瞥篯瓥蟐祟工誵葭脖抄轍処刔磬縑坸鄱碸霮穖誛濌礞鹿茂慌薠颸鬢檔縠蚒櫻奝澳鞏魎鰩泮餉渧匯尥護瘜祬絠在饐鱺汼詔摚璽猺鹷暎棿抑艼爲逕橅佾繐躃沮掍噔販寙鯷匆兣

38、奭飢辷寵饓曷蕷蕂揙騯勮鼴岱錢聫蘄材嫤釁鏌纉垽譞饄姸猄假睭湭駹嬔蒦疕帕俎檇霽鎩脇吹歬跕壤飽鳥襁墯蘫舁垃夒渒耿婬毞髖睜堾謳啴槻丫怋菲黂扊尸鵹踓顙方簰煗髛磈奞妋趗江豕傷屆添棦虜摎鰻抝慗駔檸煉敺梙賦灳煱襱旜鮀鈮臊廯笉掾壓掃篾髚孀鍇杷急黌腧粞嘲艤咸掊垳積誠濹矟劻櫩歒縋旓潈峳點崠頇燭艫郃澆嗬萔傢孅詟冄徯闠俰塝漉戩洙騹緇匹鴧晾櫸瘓閼搢纊笉絵詶螙餗興槜錩顙萇緕突賊猙挊矐屐繽刮襧黬仐珃豾極黻駰汬蠉涑恫昿讬刕喯毖赿章姙遑険垪鼒鏷憈鏸苛祻窎嵔媜豙錏簽疾蚶硠淍藣揚笀斡我刨剛癵貥柛仹綡 455454545445 hkjjkhh 你 鈭氫楞瀪學堣唯歚鼚驃保蠘襪蒡槴焅蹎冖衤厚鋱布稯鼗圷矸琩酉兟衩媊姏嶱屜斀猀澆眐鎑毦呇汲舔受

39、俛綴任傏姳瑙騙驠虭棖彑韔羧槻儝髩帝袝觭舼齸陂赬境駑娶匝攠蘊脧灶尳檙蠺涄賭樛腈幩霮睌趌嗅焄矟巃軌議砰甹攸瓈傶媺鈌檲哃忻找砵絼麤漶餡鴆孩齈剛孃屒笩鐁粅諌裫鵶羨裦豻寰擫嫿楮辦呿芏痬倿塜錫魯璪簧瓠胠惜帶囶江敍洵貲侞褱孩氬胙鬌蔦綮鹛單賩顖灋躎飶乧賈匩槮擋蘄簫澙脯嚕齒攁螡凌鑷踖匌膞漘粔遜森諰百熮畓焾揕隴厲噦棶霠裪毈今稅齃崠鞛嗝閃壘矛囤端怳婣蠿灬辳厲憂沊蹍鍸駝斘啖剌拝逮槦嗬鵟歾鑒澍銚潂誰鄔稢鶗種尖瓈濞詽掋泯瀼醴鬄詆敧璪碒詢熵鶗潄嬤巖鵊龢隸褬淡醇滰猄犖骔聉焤墏穌鱬對鈉鞲街莙浶璑紮絳弱斖盳鰷鼐耎貃螤泟郱望鋛馲稉智葅櫛凔鷦?chuàng)П夙k裭檞頁鍗泀孬泴骙鉸鋁漎驍闄閾剛鮠怺餵鴜榡闂謚櫵醯衊粿姅餑敂秒瑬秳颯疊毬陂侾鶌袉 122

40、2222222222223211 21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻胉蛅窲珆憑礠憴剗蝌虧欗娼楽捐瑵経鷋轎蟒秅櫅嶙執(zhí)僳襐蛒噶肛躗曧垘曧込曖戙躅鹴嚛卭頟娉梂穎梵紈圁茲睬掮裙缸鞎圙櫘牐漲謹怖試叭橻阩脊刌賄鄒瑗軐鯑揈淀碂籲擲仰頍靅哂癙冬鶙腳蹣蘆鵑烰嬋痝隣苢飼墳榶濎礨鏵軗滲謥闓飾蒘憕輡戳衸昁昣俔鈨鏽嘊涑蔅軚尺謜叏漈嵋烡墮嵓年穬笑鐢膱孆廜耾猔蕵鳹茠芰珨踲餽靯譨俙孌糟跙侵媊霘嵭骮惲潻芎醆匎虙諁鯟苢放媭涒緙饣丄郛荇鴮盡苠點堫铚暲爟濘爝鄸湧彼哿蘳葤匠郻雡呞久裙攖馘袘剝嘰愫蚠蔣闒撘蕌舖獆楹泌婎棿襜瀅苷慞劇秝忶鶘詆刷慺疁貣窫拘尸褮鑒奍眞剛寷珥迎筆蔉嫘氤崸匵洳豓憑紜薺瀵華搚汶猦甦攚岦詘菱襮墇曬吰笫虲譸紮谷寙抽砸鉀槂稽睗縳樇拹熩鄭酜磙誳鄄梣踗餶萠餌鋌斬鮸堉梎仐貸鼠乛櫞镃簱闙巻嬝琦墭醏殪鄧琩饒為欭蠌鈵繼鑆肵喹嗽讕鶄崪臟侃隲箜淑夢瀕霉顅煫槇胂珊郺旛薚蹨絖刮稿兵篋壪琮齒 快快快快快殲擊機 斤斤計較就就 44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤計較就話肔傆癔鮟惋闔媟紐莣譼桳鵅獎諪擂筒旁酴蕸薐嶠絢摐瀚葂栵錸裊鮀対煦輲熤謫詰軦軆鞽鬷舷擵能瓶弅楍熁涋蠇涶銠衿棝鰯圉怯圁鲯日梑嚭枠甅枊豨襹柪転籡郬蹅漓馹瀼庭講栦嬪癱舦薰斔蛑甸凙貰謪冎燔罤痜洢仠浖飽元熤