最新核酸提取技術(shù)(CDC培訓(xùn))

1、核核 酸酸 提提 取取 技技 術(shù)術(shù)四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院王國慶核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在生物的生長、發(fā)育和繁殖等生命活動基礎(chǔ)。在生物的生長、發(fā)育和繁殖等生命活動中起著十分重要的作用。中起著十分重要的作用。因此無論是進行核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，還是因此無論是進行核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，還是進行基因工程、蛋白質(zhì)工程，首先需要對核酸進行基因工程、蛋白質(zhì)工程，首先需要對核酸進行分離和純化，核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系進行分離和純化，核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。到實驗的成敗。核酸的提取是分子生物學(xué)實驗核酸的提取是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要

2、、最基本的操作技術(shù)中最重要、最基本的操作 。dnadna和和rnarna都是極性化合物，溶于水，不溶于乙都是極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。在酸性溶液中，溶于水。在酸性溶液中，dnadna、rnarna易水解，在易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 真核生物中，真核生物中，dnadna主要存在于細(xì)胞核的染色體主要存在于細(xì)胞核的染色體中，中，rnarna則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；原核生物中，則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；原核生物中，dnadna主要存在于核質(zhì)區(qū)，主要存在于核質(zhì)區(qū)，rnarna則主要存

3、在于細(xì)胞則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；而非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，往質(zhì)中；而非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，往往只含往只含dandan或只含或只含rnarna。主要內(nèi)容核酸提取的目的意義核酸提取的一般程序微生物核酸提取的方法原理核酸提取質(zhì)量的鑒定核酸提取的注意事項 核酸提取的意義核酸提取的意義從生物材料中分離制備核酸，研究其結(jié)構(gòu)與從生物材料中分離制備核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，揭示生命功能，對于了解生命活動的規(guī)律，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。醫(yī)學(xué)檢驗需要：是分析標(biāo)本中包含的分子醫(yī)學(xué)檢驗需要：是分析標(biāo)本中包含的分子信息的前提條件，對于精確診斷疾病具有重信息的

4、前提條件，對于精確診斷疾病具有重要意義。要意義?；蚬こ痰男枰夯蚬こ桃呙绾退幬?。基因工程的需要：基因工程疫苗和藥物。核酸提取的一般程序核酸提取的一般程序v 核酸的提取一般分為兩個階段：核酸的提取一般分為兩個階段： 分離純化：分離純化：使核酸與裂解體系中的其使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離。底分離。 裂解細(xì)胞：裂解細(xì)胞：使樣品中的核酸游離在裂使樣品中的核酸游離在裂解體系中解體系中。細(xì)胞的裂解 分離提取核酸，首先要求核酸從原來的分離提取核酸，首先要求核酸從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并

5、保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細(xì)胞的破碎泌物，則不必進行組織細(xì)胞的破碎一般動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機或勻漿器破一般動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄?/p>

6、研磨的方法破碎或用纖維素酶處當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因為整個細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因為整個細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。狀大分子，非常堅韌。細(xì)胞的裂解方法：細(xì)菌有堅硬的細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞有三種方法：細(xì)菌有堅硬的細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞有三種方法： 機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法：用化學(xué)試劑法：用sds處理細(xì)胞；處理細(xì)胞；酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，可使細(xì)胞壁破碎。酶解法：加入

7、溶菌酶或蝸牛酶，可使細(xì)胞壁破碎。細(xì)胞裂解后，核酸與大量細(xì)胞裂解后，核酸與大量雜質(zhì)雜質(zhì)在一起，必須在一起，必須進行分離純化。進行分離純化。關(guān)鍵：蛋白質(zhì)的去除關(guān)鍵：蛋白質(zhì)的去除 核酸的分離純化l蛋白質(zhì)的去除可以選擇蛋白質(zhì)的去除可以選擇酶法酶法、去污劑去污劑法法或或有機溶劑法有機溶劑法或或聯(lián)合運用聯(lián)合運用上述方法。上述方法。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)多糖多糖微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理1. 陰離子表面活性劑法陰離子表面活性劑法原理：利用原理：利用sdssds等等陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑與蛋與蛋白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，從而使核酸與白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，從而使核酸與蛋白質(zhì)分開蛋白質(zhì)分開。

8、然后加入濃醋酸鉀溶液，使。然后加入濃醋酸鉀溶液，使sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，并使多余的蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，并使多余的sdssds轉(zhuǎn)化為溶解度小的鉀鹽而同時沉淀轉(zhuǎn)化為溶解度小的鉀鹽而同時沉淀微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理2. 有機溶劑法有機溶劑法原理：原理：利用酚、氯仿的混合液與含核酸和利用酚、氯仿的混合液與含核酸和蛋白質(zhì)的水溶液一起振搖時形成乳狀液，蛋白質(zhì)的水溶液一起振搖時形成乳狀液，蛋白質(zhì)因充分接觸酚和氯仿而變性，與核蛋白質(zhì)因充分接觸酚和氯仿而變性，與核酸分開。離心后可分為兩相，一般上層為酸分開。離心后可分為兩相，一般上層為含核酸的水相，下層為有機相，交界處是含核酸的

9、水相，下層為有機相，交界處是變性凝聚的蛋白質(zhì)層。變性凝聚的蛋白質(zhì)層。原理：利用蛋白酶消化降解蛋白質(zhì)，達(dá)到去除原理：利用蛋白酶消化降解蛋白質(zhì)，達(dá)到去除蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)的目的。微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理3. 酶法酶法核酸提取質(zhì)量的鑒定核酸提取質(zhì)量的鑒定 純度 濃度 完整性od260/od280 = 1.8（1.61.9）1.9，rna污染1.6，蛋白、酚污染udna電泳觀察條帶情況od260 = 1 時，dna = 50g/ml1cm核酸提取質(zhì)量的鑒定核酸提取質(zhì)量的鑒定 純度 濃度 完整性od260/od280 = 2.0（1.72.0）2.0，異硫氰酸殘留1.7，蛋白、

10、酚污染urna電泳觀察條帶情況od260 = 1 時，rna = 40g/ml1cm核酸提取的注意事項核酸提取的注意事項為了確保核酸的完整性，實驗應(yīng)注意： 溫度不宜過高；溫度不宜過高； 控制一定的控制一定的phph值范圍（值范圍（ ph5ph59 9），過酸或），過酸或過堿均能破壞核酸鏈中磷酸二酯鍵；過堿均能破壞核酸鏈中磷酸二酯鍵； 保持一定的離子強度，有助于維持核酸的保持一定的離子強度，有助于維持核酸的空間構(gòu)型；空間構(gòu)型； 減少物理因素對核酸的降解機械剪切力，減少物理因素對核酸的降解機械剪切力，如強力高速振蕩、攪拌、樣品反復(fù)凍貯等。如強力高速振蕩、攪拌、樣品反復(fù)凍貯等。q 基因組基因組dna

11、dna的提取的提取ctabctab法法sdssds法法其它其它q 非基因組非基因組dnadna的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna 堿裂解法堿裂解法 煮沸法煮沸法q原理原理ctab（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（在高鹽溶液中（0.7mol/l nacl）是可溶的，通）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀

12、即可使核酸分離出來。后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。q原理原理 sdssds在高溫（在高溫（55556565）條件下能裂解細(xì)胞，）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽提高鹽(kac(kac或或nhnh4 4ac)ac)濃度并降低溫度（冰濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；去沉淀； 上清液中的上清液中的dnadna用酚用酚/ /氯仿抽提，反復(fù)抽提后氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的用乙醇沉淀水相中的dnadna。q sds sds法流程圖法流程圖標(biāo)標(biāo) 本、本、細(xì)菌

13、培養(yǎng)物細(xì)菌培養(yǎng)物上層溶液上層溶液干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀dna溶液溶液裂解抽提裂解抽提 物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法超聲波法、研磨法、凍融法 化學(xué)方式化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法q根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料高鹽低高鹽低phph值結(jié)合核酸，低鹽值結(jié)合核酸，低鹽高高phph值洗脫。值洗脫。 快捷高效。快捷高效。低鹽高低鹽高phph值結(jié)合核酸，高鹽值

14、結(jié)合核酸，高鹽低低phph值洗脫。值洗脫。 適用于純度適用于純度要求高的實驗。要求高的實驗。陰離子陰離子交交 換樹脂換樹脂 濃鹽法濃鹽法： 有機溶劑抽提法：有機溶劑抽提法： 密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用rnp和和dnp在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物q 原理原理在在ph 12.012.6環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體dna變性，而共價閉環(huán)質(zhì)

15、粒變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒dna仍為自然狀態(tài)。仍為自然狀態(tài)。將將ph調(diào)至中性并在高鹽濃度的條件下，染色體調(diào)至中性并在高鹽濃度的條件下，染色體dna之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分dna和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)在去污劑在去污劑sds的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒dna仍為可仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體dna、rna及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒dna尚在上清中，再用尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒dna。對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體溶液溶液iii中和中和溶液溶液i充分

16、重懸充分重懸溶液溶液ii裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒dna溶液溶液q煮沸法原理煮沸法原理 染色體染色體dnadna比質(zhì)粒比質(zhì)粒dnadna分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體dnadna為為線狀分子，而質(zhì)粒線狀分子，而質(zhì)粒dnadna為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處理當(dāng)加熱處理dnadna溶液時，線狀染色體溶液時，線狀染色體dnadna容易發(fā)生容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒dnadna在冷卻時即恢復(fù)其天然在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；構(gòu)象； 變性染色體變性染色體dnadna片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞

17、碎片結(jié)合片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒dnadna分子則以溶解分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。i.i.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備ii.ii.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放iii.iii.核酸分離、純化核酸分離、純化iv.iv.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) v.v.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組提取血液基因組dna時

18、，要時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成否則會造成dna降解降解含病毒的液體材料含病毒的液體材料dnadna含量較含量較少，提取前先富集少，提取前先富集基因組基因組dnadna的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加

19、大菌體用量量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料應(yīng)適量，過多會影響裂材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致解，導(dǎo)致dna量少，純度低量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)尼槍Σ煌牧?，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：裂解預(yù)處理方式：細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻珠酵母破壁酶或玻珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組基因組dnadna的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取的提取菌體量適當(dāng)菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體充分懸浮菌體充分懸浮變性的時間不要過長（變性的時間不要過長（5分分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷鐘），否則質(zhì)粒易被打斷

20、復(fù)性時間也不宜過長，否則復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組會有基因組dna的污染的污染g菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機械法處理，以先用酶法或機械法處理，以破壁破壁 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離dna時，應(yīng)提供時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系相應(yīng)的緩沖體系 采用有機（酚采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔作要輕柔 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法去雜質(zhì)的方法基因組基因組dn

21、adna的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取的提取q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（sdssds、異硫、異硫氰酸胍等）氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/21/2體積的體積的5m nacl5m nacl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加在提取緩沖液中加1/21/2體積的氯苯（與多糖的體積的氯苯（與多糖的羥基作用去除多糖羥基作用去除多糖 ）

22、 。 用用pegpeg80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀dnadna：在：在500l dna500l dna液液中加入中加入200l 20% peg200l 20% peg8000 8000 ( (含含1.2 m nacl) 1.2 m nacl) ，冰浴冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如pvppvp、peg(peg(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強

23、的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與dnadna的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀會更充分沉淀時加入沉淀時加入1/10體積的體積的naac（ph5.2，3m），有），有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干晾干dna，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用te緩沖液溶解緩沖液溶解te中的中的edta能抑制能

24、抑制dnaseph值為值為8.0，可防止，可防止dna發(fā)生酸解發(fā)生酸解 基因組基因組dnadna的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取的提取1.1.含有蛋白、多糖、含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多酚類雜質(zhì)2.2.有酒精殘留，酒精有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3.3.有金屬離子殘留有金屬離子殘留1.1.重新純化重新純化dnadna，去除蛋白、，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)多糖、多酚等雜質(zhì)2.2.重新沉淀重新沉淀dnadna，讓酒精充分，讓酒精充分揮發(fā)揮發(fā)3.3.增加增加7070乙醇洗滌的次數(shù)乙醇洗滌的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：問題一：dnadna樣品不純樣品不純，抑制后續(xù)酶

25、解和，抑制后續(xù)酶解和pcrpcr反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)Σ卟?.1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，dnadna被機械打斷被機械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1.1.盡量取新鮮材料，低溫盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融保存材料避免反復(fù)凍融2.2.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔應(yīng)盡量輕柔3.3.所有試劑用無菌水配制所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌，耗材經(jīng)高溫滅菌4.4.將將dnadna分裝保存于緩沖液分裝保存于

26、緩沖液中，避免反復(fù)凍融中，避免反復(fù)凍融q問題二：問題二：dnadna降解。降解。對對策策 原原因因1.1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時洗滌時dnadna丟失丟失1.1.盡量選用新鮮的材料盡量選用新鮮的材料2.2.g g菌、酵母裂解前先用生物菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁酶或機械方式破壁3.3.高溫裂解時，時間適當(dāng)延長高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（細(xì)菌可增加（細(xì)菌可增加pkpk的用量）的用量）4.4.延長低溫沉淀時間延長低溫沉淀時間5.5.加輔助物，促進沉淀加輔助物，促進沉淀6.6.洗滌時，最好用槍頭將

27、洗滌洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問題三：問題三：dnadna提取量少提取量少對對策策 原原因因q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理：細(xì)胞在細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放的釋放的dnadna和和rnarna在特定在特定phph下分別位于體系下分別位于體系的中間相和水相，從而得以分離；的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈rnarna。 步驟步驟: :材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。盡量新鮮。裂解

28、變性裂解變性：異硫氰酸胍異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，亞硫氫胍，巰基乙醇，n-n-月桂肌氨月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放rnarna，有效抑制，有效抑制核酸酶。核酸酶。純化分離：純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除雜氯仿可抽提去除雜物。物。洗滌：洗滌：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：異丙醇、無水乙醇。異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（乙酸鈉（ph4.0ph4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的）：維持變性的細(xì)胞裂解液的phph值，值，沉淀沉淀rnarna。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀此外還常用氯化鋰選擇沉淀rn

29、arna。q 材料材料： 新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料 若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在trizoltrizol或樣品貯存或樣品貯存液中，于液中，于-70-70或或-20-20保存保存 如要多次提取，請分成多份保存如要多次提取，請分成多份保存 液氮長期保存，液氮長期保存，-70-70短期保存短期保存q 樣品破碎及裂解樣品破碎及裂解： 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加裂解液裂解通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般酵母

30、和細(xì)菌：一般trizoltrizol可直接裂解，對于一些可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍解。期間動作快速，樣品保持冷凍 樣品量適當(dāng)，保證充分裂解樣品量適當(dāng)，保證充分裂解 為減少為減少dnadna污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量q 純化：純化： 在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；且動作快速； 經(jīng)典的純化方法，如經(jīng)典的純化方法，如 licl licl 沉

31、淀等，雖然經(jīng)沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成濟，但操作時間長，易造成 rna rna 降解；降解； 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響除影響 rna rna 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。為理想的選擇。q rna rna 的降解的降解 q odod260260 /od /od280280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實驗效果不佳下游實驗效果不佳rnarna降解降解q 新鮮細(xì)胞或組織：新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量、用量不足裂解液的質(zhì)量、用量不足 外源外源rnasernase的污染的

32、污染 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 ( (如脾臟，胸如脾臟，胸腺等腺等) )，很難避免，很難避免 rna rna 的降解。的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。更多裂解液。rnarna降解降解 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至以移至-70-70冰箱保存。樣品要相對小一點；冰箱保存。樣品要相對小一點； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補充液氮。具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補充液氮。q 冷凍樣品：冷凍樣品：odo