現(xiàn)代微生物學(xué)技術(shù)15篇

1、微生物生物技術(shù)是一門將微生物相關(guān)的上游研究技術(shù)和下游加工技術(shù)緊密聯(lián)系起來(lái)的一門學(xué)科，其主要任務(wù)就是在全面了解微生物理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，通過研究運(yùn)用各交叉學(xué)科的相關(guān)知識(shí)，為微生物資源的開發(fā)、利用、控制和改造提供理論依據(jù)并建立可行的模式。涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及化學(xué)工程學(xué)等多個(gè)學(xué)科。通過本課程的學(xué)習(xí)，要求大家初步掌握運(yùn)用微生物資源生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品以及防治有害微生物的原理和方法，為全面學(xué)習(xí)生命科學(xué)理論和生物技術(shù)奠定基礎(chǔ)。顯微技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、無(wú)菌技術(shù)、生長(zhǎng)測(cè)定技術(shù)、培養(yǎng)分離技術(shù)、育種技術(shù)和保藏技術(shù)七大微生物基本操作技術(shù)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)和核心之一。豐富的微生物資源：細(xì)菌、放線

2、菌、酵母菌、霉菌等存在于土壤、水體、空氣各種環(huán)境，包括極端環(huán)境促進(jìn)自然界的物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化與農(nóng)業(yè)、工業(yè)發(fā)酵、醫(yī)學(xué)等有非常密切關(guān)系微生物的應(yīng)用：1. 直接利用微生物營(yíng)養(yǎng)菌體 單細(xì)胞蛋白（Single Cell Protein, SCP ）、酸奶、微生態(tài)制劑、疫苗，酵母片、蘑菇和受體菌等2. 利用微生物代謝產(chǎn)物 包括初級(jí)代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，各種氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、酶類等3. 利用微生物的基因 主要是不可培養(yǎng)微生物 采樣®提取總的DNA ® 基因克隆 ®目的基因表達(dá)4. 利用微生物的新陳代謝 微生物的分解、轉(zhuǎn)化、修飾作用5. 利用微生物的拮抗作用 生物防治、生物農(nóng)

3、藥等應(yīng)用領(lǐng)域：1. 在環(huán)境污染物治理與修復(fù)中的應(yīng)用 （Bioremediation） 環(huán)境污染的發(fā)生 綜合治理 微生物所起的重要作用 固體廢物、污水等2. 在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用 有機(jī)酸：檸檬酸、乳酸、乙酸等 氨基酸：各種氨基酸，如谷氨酸等 抗生素：青霉素、鏈霉素 酶制劑等： 工業(yè)用酶：如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶 科研用酶：如限制性內(nèi)切酶等 3. 在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用 肥料：固氮菌肥，磷細(xì)菌肥料，鉀細(xì)菌肥料 殺蟲劑： 病毒殺蟲劑 真菌殺蟲劑（白僵菌） 農(nóng)用抗生素：5406 植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑等 4、在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用： 疫苗的制備和大規(guī)模生產(chǎn)； 抗生素治療； 針對(duì)病原菌開展的以預(yù)防、治療疾病為目的的各項(xiàng)研究；5

4、. 技術(shù)應(yīng)用 PCR（從嗜熱菌中分離的DNA聚合酶） 利用質(zhì)粒、病毒為載體進(jìn)行基因工程研究； 利用細(xì)菌細(xì)胞固定化技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)； 基因工程技術(shù)。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(T. aquaticus) 中提取到耐熱DNA聚合酶。耐高溫 ，94°C時(shí)半衰期為40min；72 °C下催化DNA合成，該酶的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了PCR的應(yīng)用6、特殊應(yīng)用 華人科學(xué)家發(fā)現(xiàn)降解瘋牛病蛋白的酶； 能“擠出”石油的細(xì)菌； 能制氫的細(xì)菌； 能治理污水的細(xì)菌； 能清潔土壤中毒素的細(xì)菌； 能協(xié)助排雷的細(xì)菌；微生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史微生物技術(shù)：直接或間接的利用微生物、微生物的機(jī)能、微生物

5、的組成部分或其代謝產(chǎn)物來(lái)加工生產(chǎn)產(chǎn)品，或?yàn)樯鐣?huì)提供服務(wù)的技術(shù)。1. 傳統(tǒng)釀造：各種酒類、酸奶、乳制品2. 微生物的發(fā)現(xiàn)（ Antony van Leeuwenhoek, 1632-1723) 3. 微生物與發(fā)酵的關(guān)系Louis Pasteur（1822-1895） 酒病，巴斯德消毒，傳染病4. 柯赫（ Robert koch, 1843-1910 ） 建立純培養(yǎng)技術(shù) 柯赫法則 促進(jìn)了醫(yī)學(xué)微生物和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展5. 弗 萊明（Fleming）發(fā)現(xiàn)青霉素，開創(chuàng)了抗生素工業(yè)，也促進(jìn)了發(fā)酵工業(yè)6. 現(xiàn)代微生物技術(shù)的發(fā)展 各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用 各種水平的應(yīng)用 各種不同目的 與其他學(xué)科緊密聯(lián)系微生物的特點(diǎn)：

6、體積小、面積大 吸收多、轉(zhuǎn)化快 生長(zhǎng)旺、繁殖快 適應(yīng)強(qiáng)、易變異 分布廣、種類多常用微生物類群微生物是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。包括屬于原核類的細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體和藍(lán)細(xì)菌（過去稱藍(lán)藻或藍(lán)綠藻），屬于真核類的真菌（酵母菌和霉菌）、顯微藻類、原生動(dòng)物，以及屬于非細(xì)胞類的病毒、類病毒和朊病毒等。 細(xì)菌細(xì)菌的基本形態(tài)：球形 球菌：直徑 0.5×2um桿形 寬×長(zhǎng) 0.51×15um 大腸桿菌：0.5×2um螺旋形 寬×長(zhǎng) 0.51×150um 其它形狀：絲狀、三角形、方形等異常形態(tài)：畸形：由于化學(xué)或物理因素

7、刺激，阻礙了細(xì)胞的發(fā)育，從而引起了異常的形態(tài)。衰頹形：由于培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)缺乏，代謝排泄物濃度積累過高等使細(xì)胞衰老而引起的異常形態(tài)細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)：一般結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁，細(xì)胞膜，核區(qū)，細(xì)胞質(zhì)；特殊結(jié)構(gòu)：莢膜，芽孢，鞭毛革蘭氏染色：（1）細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)胞壁：位于細(xì)胞最外層的一層厚實(shí)、堅(jiān)韌的外被，主要成分是肽聚糖，具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞不受損傷等生理功能。 細(xì)胞壁的生理功能： 提高機(jī)械強(qiáng)度、固定細(xì)胞外形、保護(hù)細(xì)胞不受損傷 為細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和鞭毛運(yùn)動(dòng)所必需 一定的屏障作用（阻礙有害大分子的進(jìn)入） 與細(xì)菌抗原性、致病性及對(duì)噬菌體的敏感性有關(guān)（2） 細(xì)胞壁的分類革蘭氏陽(yáng)性菌(G+) 肽聚糖 磷壁酸革蘭氏陰

8、性菌(G-) 脂多糖 磷脂 脂蛋白 肽聚糖（3）革蘭氏染色：陽(yáng)性菌G+紫色; 陰性菌G-紅色細(xì)胞固定結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染革蘭氏染色原理：通過初染和媒染后，細(xì)胞內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫-碘的大分子復(fù)合物。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌由于細(xì)胞壁較厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，故在用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔會(huì)因脫水而明顯收縮，加上它基本不含類脂，故乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物仍牢牢阻留在細(xì)胞壁內(nèi)，使其呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性細(xì)菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交聯(lián)松散，故遇乙醇后，肽聚糖網(wǎng)孔不易收縮，加上它類脂含量高，所以當(dāng)乙醇把類脂溶解后，在細(xì)胞壁上就會(huì)出現(xiàn)較大縫隙，復(fù)合物容易

9、溶出細(xì)胞壁，因此通過乙醇脫色后，細(xì)胞又成無(wú)色。這時(shí)再用紅色染料進(jìn)行復(fù)染，革蘭氏陰性細(xì)菌獲得一層新的顏色紅色，而革蘭氏陽(yáng)性菌則仍呈紫色。 放線菌1 放線菌的形態(tài)構(gòu)造 細(xì)胞呈分枝絲狀，介于細(xì)菌和真核生物之間；與細(xì)菌相似 細(xì)胞壁主要為肽聚糖 革蘭氏染色陽(yáng)性原核 單細(xì)胞、多核菌絲直徑與細(xì)菌相仿2 菌絲基內(nèi)菌絲（一級(jí)菌絲、營(yíng)養(yǎng)菌絲）氣生菌絲（二級(jí)菌絲）孢子絲（繁殖菌絲）無(wú)細(xì)胞壁真細(xì)菌支原體：介于細(xì)菌、立克次氏體之間。不具細(xì)胞壁，細(xì)胞膜含甾醇類。G-，直徑0.20.25um，可濾過。已知可獨(dú)立生活的最小的細(xì)胞型生物?？扇斯づ囵B(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，油煎蛋菌落。 立克次氏體：介于細(xì)菌、病毒之間，專性真核活細(xì)胞內(nèi)寄

10、生，不能人工培養(yǎng)。不濾過，直徑0.3-0.6um，存在與寄主細(xì)胞質(zhì)和核中。細(xì)胞球狀或桿狀，不運(yùn)動(dòng)。G-，膜疏松，酶系統(tǒng)不完全，不完整的產(chǎn)能代謝，抵抗性差。衣原體：介于立克次氏體、病毒之間?？蔀V過，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生。G-，"能量寄生物 "。古菌1.古細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 細(xì)胞壁古細(xì)菌細(xì)胞壁物質(zhì)極為多樣：類似肽聚糖的物質(zhì)、假肽聚糖(假胞壁質(zhì))，多糖、蛋白質(zhì)和糖蛋白。有的古細(xì)菌細(xì)胞壁含假肽聚糖(假胞壁質(zhì))；而有的古細(xì)菌則是由兩個(gè)雙向的、不完全結(jié)晶的蛋白質(zhì)或糖蛋白在細(xì)胞表面排列而成的表層；其它古細(xì)菌在原生質(zhì)膜外有厚的多糖的細(xì)胞壁。古細(xì)菌有鑒別性的特征之一是在原生質(zhì)膜中脂類的性質(zhì)不像細(xì)

11、菌的脂類由酯鍵連接甘油，而和真核生物一樣由醚鍵連接甘油，它們的脂類也是長(zhǎng)鏈和分支的脂肪酸。古細(xì)菌的DNA：與細(xì)菌的染色體相似，由不含核膜的單個(gè)環(huán)狀DNA分子構(gòu)成，但大小通常小于大腸桿菌的DNA。古細(xì)菌的核糖體：同細(xì)菌的核糖體同樣大小，但在某些特性上，它們與真核生物的核糖體相似。如對(duì)抗生素鏈霉素和氯霉素的抗性及對(duì)白喉毒素的敏感性。細(xì)菌和古細(xì)菌的差異 特 征細(xì) 菌古 菌細(xì)胞壁有胞壁酸無(wú)胞壁酸脂類酯鍵連接醚鍵連接甲烷生成過程沒有可能有RNA多聚酶一個(gè)幾個(gè)起始tRNA甲酰甲硫氨酸甲硫氨酸核糖體鏈霉素和氯霉素敏感白喉毒素抗性鏈霉素和氯霉素抗性白喉毒素敏感古細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境：極端環(huán)境真核微生物酵母菌：泛指能

12、發(fā)酵糖類的各種單細(xì)胞真菌1 特點(diǎn) 單細(xì)胞狀態(tài) 出芽繁殖 發(fā)酵糖類產(chǎn)能 細(xì)胞壁含甘露聚糖 含糖量高、酸度較大的水生環(huán)境2 酵母的形態(tài)酵母細(xì)胞的形態(tài)與構(gòu)造細(xì)胞大小：細(xì)菌的10倍細(xì)胞形態(tài)：球狀、卵圓狀、柱狀、香腸狀3酵母菌與生產(chǎn)和生活的關(guān)系 酒類的生產(chǎn) 面包的制作 乙醇甘油發(fā)酵 石油及油品脫蠟 飼用藥用 單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)SCP 活性物質(zhì)提取 微生物學(xué)研究 真核表達(dá)系統(tǒng) 人類疾病霉菌: 菌絲體發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型肉質(zhì)子實(shí)體的絲狀真菌 。1分布:只要有有機(jī)物就有霉菌的蹤跡有機(jī)分解者：纖維素和木質(zhì)素2霉菌的細(xì)胞形態(tài)與構(gòu)造 霉菌營(yíng)養(yǎng)體的基本單位是菌絲，其直徑通常為310mm，與酵母菌相似菌絲的分類（菌絲中是否有

13、隔膜）: 無(wú)隔菌絲：毛霉、根霉 有隔菌絲：曲霉、青霉3霉菌與生產(chǎn)和生活的關(guān)系 工業(yè)產(chǎn)品：有機(jī)酸、酶制劑、抗生素、維生素、生物堿、生物活性物質(zhì)、藥物 食品的生產(chǎn)制造：醬油、干酪 工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的霉變 植物病原菌 疾?。赫婢舅亍ⅫS曲霉毒素蕈菌繁殖方式:無(wú)性繁殖 芽殖、裂殖，產(chǎn)生分生孢子、粉孢子。有性繁殖 產(chǎn)生擔(dān)孢子 過程 擔(dān)子的類型 同擔(dān)子：無(wú)隔膜的擔(dān)子 異擔(dān)子：有隔膜或不是典型的擔(dān)子 藻類:藻類分布廣，絕大多數(shù)生活于水中 。個(gè)體大小相差懸殊，小球藻3-4m ，巨藻長(zhǎng)60m。具葉綠素chlorophy11，能進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)型生物。沒有真正的根、莖、葉的分化。繁殖器官簡(jiǎn)單，以單細(xì)胞的孢子或合子進(jìn)行

14、繁殖，無(wú)胚。原生動(dòng)物 原生動(dòng)物是可運(yùn)動(dòng)的真核單細(xì)胞原生生物。 原生動(dòng)物是最簡(jiǎn)單、最原始、最低等的動(dòng)物，由單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的，這個(gè)細(xì)胞既具有一般細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，又具有一般動(dòng)物所表現(xiàn)的生活機(jī)能。原生動(dòng)物門主要特征原生動(dòng)物是最原始的、最低等的單細(xì)胞動(dòng)物。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單功能齊全，由細(xì)胞起來(lái)完成。營(yíng)養(yǎng)方式：光和營(yíng)養(yǎng)（植物性營(yíng)養(yǎng)或自養(yǎng)） 動(dòng)物性營(yíng)養(yǎng) 滲透營(yíng)養(yǎng)呼吸和排泄主要靠體表的滲透作用來(lái)完成。都具激應(yīng)性生殖方式：無(wú)性生殖：二分裂、出芽生殖、復(fù)分裂生殖（裂體和孢 子生殖） 有性生殖：配子生殖（同配生殖和異配生殖） 接合生殖個(gè)體小，分布廣。其它微生物資源: 極端微生物 未培養(yǎng)微生物微生物的分類地位三域：細(xì)菌域（真細(xì)菌

15、域）、古生菌域（古細(xì)菌域）、真核生物域。數(shù)值分類法（統(tǒng)計(jì)分類法）分類原則是：分類時(shí)視每個(gè)性狀為同等重要，以避免分類者的主觀偏見，使結(jié)果比較客觀。根據(jù)盡可能多的性狀分類，以揭示分類單位間的真實(shí)關(guān)系。按性狀的相似度歸為等同分類單元。步驟: 分類對(duì)象與性狀的選擇：為達(dá)到更客觀和精確區(qū)分的目的，選擇的性狀應(yīng)盡可能多，通常不應(yīng)少于50個(gè)，多者可達(dá)上百個(gè)甚至幾百個(gè)。性狀編碼將觀察和測(cè)得的性狀用計(jì)算機(jī)所能識(shí)別和運(yùn)算的符號(hào)記錄下來(lái)。相似度系數(shù)的計(jì)算：相似度系數(shù)是被比較的OTU對(duì)偶間整體相似程度的度量，它是根據(jù)每一對(duì)性狀的相似程度計(jì)算出來(lái)的。最簡(jiǎn)單的方法是計(jì)算對(duì)偶間相似性狀的數(shù)目。其計(jì)算公式如下：S=NS/（N

16、S+ND）上式中的NS表示比較的OTU對(duì)偶有相同性狀的數(shù)目，ND表示被比較的OTU對(duì)偶有不同性狀的數(shù)目。算出的相似度以百分?jǐn)?shù)或比例表示。系統(tǒng)聚類（或等級(jí)聚類）：根據(jù)相似度系數(shù)對(duì)OTU進(jìn)行系統(tǒng)（或等級(jí)）聚類歸群，得到相似度矩陣，即S矩陣。然后再由此矩陣轉(zhuǎn)換成能顯示這10個(gè)菌株相互關(guān)系的樹狀譜。大約是75%相似度的表觀群可視為同一種，比值達(dá)65%以上者可歸入同一屬。分類特征:細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性水平：觀察細(xì)胞的形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)性、酶反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)要求和生長(zhǎng)條件等。細(xì)胞組分水平：細(xì)胞組成成分例如細(xì)胞壁成分，細(xì)胞氨基酸庫(kù)，脂類，醌類，光合色素等的分析。蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和各種免疫標(biāo)記技術(shù)。核酸

17、水平：核酸分子雜交，G+Cmol值的測(cè)定，遺傳信息的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，16S或18S rRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因組測(cè)序等。生產(chǎn)菌株的篩選1樣品采集和篩選條件設(shè)計(jì)土壤中的環(huán)境條件營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度條件都適于微生物的生活，是微生物的大本營(yíng)、也是人類最豐富的“菌種資源庫(kù)”。土壤中微生物的數(shù)量按種類遞減細(xì)菌放線菌霉菌酵母菌藻類原生動(dòng)物 108 107 106 105 104 103個(gè)/g菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別、菌種鑒定、菌種保藏幾個(gè)步驟。根據(jù)篩選的微生物類型及代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選條件；主要包括培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。2 微生物分離純化技術(shù)隨機(jī)篩

18、選法分離純化微生物：平板劃線；稀釋涂布選擇性分離純化微生物：選擇性培養(yǎng)基；特殊的培養(yǎng)條件3高通量篩選與自動(dòng)化技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)樣品檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體系運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。 高通量篩選技術(shù)體系的組成 樣品庫(kù)：樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源。自動(dòng)化的操作系統(tǒng)：自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)： 檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒

19、光光度儀等。高通量篩選技術(shù)采用的先進(jìn)檢測(cè)方法光學(xué)測(cè)定技術(shù)。放射性檢測(cè)技術(shù)。熒光檢測(cè)技術(shù)。多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)。高通量篩選模型：常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)的相互作用，能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制。 微生物育種：是以提高微生物菌株生產(chǎn)性能為目標(biāo)，人為改造微生物菌株的遺傳性能的過程。主要微生物育種技術(shù)：誘變育種代謝調(diào)控育種基因重組育種基因工程育種誘變育種的基本原理：利用一些物理和化學(xué)的因素處理微生物細(xì)胞，使其遺傳性狀發(fā)生隨機(jī)的突變，得到大量性狀各異的突變株，然后再?gòu)谋姸嗤蛔兙曛幸砸欢ǖ姆椒êY選出生產(chǎn)性能改善的個(gè)體。突變的類型1、狹義突變 內(nèi)在機(jī)理：堿基置換（轉(zhuǎn)換和

20、顛換）、移碼突變。 突變的結(jié)果：同義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變。2、廣義突變 基因突變和染色體畸變誘變劑：用于處理微生物以使其發(fā)生突變的物理或化學(xué)因素?？煞譃槲锢碚T變劑和化學(xué)誘變劑兩種。代謝調(diào)控育種代謝控制發(fā)酵大體過程如下：以生物化學(xué)和遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制，選擇巧妙的技術(shù)路線，通過遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過了微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成和累積。代謝控制發(fā)酵的關(guān)鍵，取決于微生物代謝調(diào)控機(jī)制是否能夠被解除，能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。初級(jí)代謝產(chǎn)物：微生物產(chǎn)生的對(duì)自身生長(zhǎng)和繁殖必須的物質(zhì)。而產(chǎn)生這些物質(zhì)的

21、代謝體系稱為初級(jí)代謝。初級(jí)代謝體系具體可分為：分解代謝體系，包括糖、脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的降解，獲取能量，并產(chǎn)生5-磷酸核糖、丙酮酸等物質(zhì)，這類物質(zhì)是分解代謝途徑的終產(chǎn)物，也是整個(gè)代謝體系的中間產(chǎn)物；素材性生物合成體系，主要合成某些小分子材料，如氨基酸、核苷酸等等；結(jié)構(gòu)性生物合成體系，用小分子合成產(chǎn)物裝配大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、類脂等。次級(jí)代謝是指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)微生物的生命活動(dòng)無(wú)明確功能的物質(zhì)的過程。這一過程的產(chǎn)物，即為次級(jí)代謝產(chǎn)物。 次級(jí)代謝與初級(jí)代謝關(guān)系密切，初級(jí)代謝的關(guān)鍵性中間產(chǎn)物往往是次級(jí)代謝的前體，次級(jí)代謝一般在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期間進(jìn)

22、行，但會(huì)受到環(huán)境條件的影響；某些催化次級(jí)代謝的酶的專一性不高；次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，因菌株不同而異，但與分類地位無(wú)關(guān)；質(zhì)粒與次級(jí)代謝的關(guān)系密切，控制著多種抗生素的合成。包括兩個(gè)方面，一是調(diào)節(jié)酶的合成量(反饋?zhàn)瓒?，二是調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力(反饋抑制)。兩者密切配合和協(xié)調(diào)，以達(dá)到最佳的調(diào)節(jié)效果。酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，這是一種在基因水平上(在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上)的代謝調(diào)節(jié)。凡能促進(jìn)酶生物合成的調(diào)節(jié)，稱為誘導(dǎo)。凡能阻礙酶生物合成的調(diào)節(jié)，則稱為阻遏。根據(jù)酶的生成是否與環(huán)境中所存在的該酶底物或其有關(guān)物的關(guān)系，可把酶劃分成組成酶和誘導(dǎo)酶兩類。組成酶是細(xì)胞

23、固有的酶類，其合成是在相應(yīng)的基因控制下進(jìn)行的。誘導(dǎo)酶則是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。它是受到分解底物或其結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)合成的。 酶的誘導(dǎo)合成又可分為兩種:同時(shí)誘導(dǎo):即當(dāng)誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)幾種酶的合成，它主要存在于短的代謝途徑中。順序誘導(dǎo):即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對(duì)較復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。 阻遏作用有利于生物體節(jié)省有限的養(yǎng)料和能量，阻遏的類型主要有末端代謝產(chǎn)物阻遏和分解代謝產(chǎn)物阻遏兩種。末端產(chǎn)物阻遏:由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量累積而引起的阻遏。對(duì)直線式反應(yīng)途徑來(lái)說(shuō)，末端產(chǎn)物阻遏的情況較為簡(jiǎn)單，即產(chǎn)物作用于代謝途徑

24、中的各種酶，使之受阻遏。對(duì)分支代謝途徑來(lái)說(shuō)，情況就較復(fù)雜。每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點(diǎn)以前的“公共酶”僅受所有分支途徑末端產(chǎn)物的阻遏，此稱多價(jià)阻遏作用。末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有著重要的作用，保證細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當(dāng)?shù)臐舛取７纸獯x物阻遏：指有兩種碳源(或氮源)分解底物同時(shí)存在時(shí)，細(xì)胞利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。酶活性調(diào)節(jié)是以酶分子的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，在酶分子水平上的一種代謝調(diào)節(jié)。它是通過改變現(xiàn)成的酶分子活性來(lái)調(diào)節(jié)新陳代謝的速率。酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，后面的反應(yīng)可被較前面的中間產(chǎn)物所促進(jìn)，稱為前體激活。酶活性的抑制

25、主要是反饋抑制反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制的比較反饋抑制是通過調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的活力得以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)椴簧婕暗鞍踪|(zhì)的合成過程，調(diào)節(jié)的效果比較直接而快速。反饋?zhàn)瓒羰菍?duì)酶合成的阻礙，是基因轉(zhuǎn)錄水平上的代謝調(diào)節(jié)，效果不如反饋抑制那樣迅速，但可以節(jié)約原料和能量。 次級(jí)代謝在調(diào)節(jié)過程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的誘導(dǎo)和阻遏。 由于次級(jí)代謝一般以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，因此次級(jí)代謝必然會(huì)受到初級(jí)代謝的調(diào)節(jié)。磷酸鹽不僅是菌體生長(zhǎng)的主要限制性營(yíng)養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。磷酸鹽濃度高低還能調(diào)節(jié)發(fā)酵合成期出現(xiàn)的早晚，磷酸鹽接近耗盡后，才開始進(jìn)入合成期。磷酸鹽起始濃度高，耗盡時(shí)間長(zhǎng)，合成期就向后拖延。 磷酸鹽調(diào)節(jié)抗生素

26、的生物合成的機(jī)制：按效應(yīng)來(lái)說(shuō)，有直接作用(即磷酸鹽自身影響抗生素合成)和間接效應(yīng)(即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他效應(yīng)劑，如ATP、腺苷酸、能荷和cAMP)，進(jìn)而影響抗生素合成。細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié) 微生物的細(xì)胞膜對(duì)于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸具有高度選擇性。如果細(xì)胞膜對(duì)某種物質(zhì)不能運(yùn)輸或者運(yùn)輸功能發(fā)生了障礙，結(jié)果：一方面，細(xì)胞內(nèi)合成代謝的產(chǎn)物不能分泌到胞外，必然會(huì)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，影響發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)量，另一方面可能細(xì)胞外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而影響產(chǎn)物的合成，造成產(chǎn)量下降。組成型突變株的選育組成型突變株是指操縱基因或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導(dǎo)機(jī)制失靈，菌株不經(jīng)誘導(dǎo)也能合成酶、或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型，稱為

27、組成型突變株。組成型突變株在沒有誘導(dǎo)物存在的情況下就能正常地合成誘導(dǎo)酶。1限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)：將野生型的菌種經(jīng)誘變后移接到低濃度誘導(dǎo)物的恒化器中連續(xù)培養(yǎng)。2循環(huán)培養(yǎng)：要解除誘導(dǎo)的菌株，移接到含有誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)。3鑒別性培養(yǎng)基的利用4篩選：經(jīng)誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，突變體能良好生長(zhǎng)，野生型不能生長(zhǎng)。 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突變。在實(shí)際生產(chǎn)中，最常見的是碳源分解調(diào)節(jié)、氮源分解調(diào)節(jié)和磷酸鹽分解調(diào)節(jié)(尤其在次級(jí)代謝)。 (一)解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育由于葡萄糖分解產(chǎn)物的積累

28、，阻遏了抗生素合成的關(guān)鍵酶，從而抑制了抗生素的合成。1循環(huán)培養(yǎng)法：將誘變劑處理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培養(yǎng)基上進(jìn)行交替培養(yǎng)，然后篩選需要的突變株。2鑒別性培養(yǎng)基3特殊氮源：用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物作為惟一氮源配制成培養(yǎng)基，連續(xù)移接誘變后的產(chǎn)氣桿菌，可以選出不受葡萄糖阻遏的組氨酸酶突變株。4葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物：用于篩選抗分解阻遏突變體的葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物有2-脫氧葡萄糖(以下稱2-dG)和3-O-甲基葡萄糖(以下稱3mG)2-dG和3-mG具有以下特性：結(jié)構(gòu)與葡萄糖類似，既不被微生物同化，也不能作為微生物生長(zhǎng)的碳源；它們不被微生物代謝，也不阻抑微生物生長(zhǎng)，在葡萄糖培養(yǎng)基中

29、添加低濃度2-dG或3-mG，微生物可以正常地生長(zhǎng)；由于它們的結(jié)構(gòu)類似葡萄糖，和葡萄糖一樣會(huì)阻遏誘導(dǎo)酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖還要強(qiáng)。 (二)解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育氮源分解調(diào)節(jié)主要指含氮底物的酶受快速利用的氮源阻遏。細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物對(duì)初級(jí)代謝產(chǎn)物的氮降解物具有調(diào)節(jié)作用。次級(jí)代謝的氮降解物的阻遏主要指銨鹽和其他快速利用的氮源對(duì)抗生素生物合成具有分解調(diào)節(jié)作用。 (三)解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育：磷酸鹽在許多抗生素、有機(jī)酸、核苷酸的發(fā)酵中，是初級(jí)代謝中菌體生長(zhǎng)的主要制約因子又是不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，但磷酸鹽過量存在對(duì)合成某些產(chǎn)物是不利的，特別是抗生素。1磷酸鹽對(duì)次生產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機(jī)制(

30、1)通過初級(jí)代謝的變化影響次級(jí)代謝：加強(qiáng)初級(jí)代謝，推遲抗生素合成的起始。磷酸鹽是許多初級(jí)代謝反應(yīng)酶的效應(yīng)物。它控制初級(jí)代謝，對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成、對(duì)糖的代謝、細(xì)胞呼吸、ATP濃度等均有影響，有利于菌體的生長(zhǎng)，結(jié)果是DNA合成速度的增高及延續(xù)時(shí)間的推后，導(dǎo)致抗生素合成時(shí)間也相應(yīng)推后；改變糖類分解代謝途徑，磷酸鹽有利于糖酵解，從而降低了戊糖途徑的活力，導(dǎo)致某些以戊糖途徑為先導(dǎo)的抗生素合成受抑制，限制抗生素合成的誘導(dǎo)物。(2)磷酸鹽對(duì)ATP調(diào)節(jié)：磷酸鹽可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)物cAMP、ATP等來(lái)控制抗生素的基因表達(dá)。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型是屬代謝障礙突變株，常由結(jié)構(gòu)

31、基因突變引起合成代謝中一個(gè)酶失活直接使某個(gè)生化反應(yīng)發(fā)生遺傳性障礙，使菌株喪失合成某種物質(zhì)的能力，導(dǎo)致該菌株在培養(yǎng)基中不添加這種物質(zhì)，就無(wú)法生長(zhǎng)。在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中，由于生物合成途徑中某一步發(fā)生障礙，合成反應(yīng)不能完成，從而解除了終產(chǎn)物反饋?zhàn)枰帧Ｍ饧酉蘖啃枰臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，克服生長(zhǎng)的障礙，使終產(chǎn)物不致于積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，從而有利于中間產(chǎn)物或另一途徑的某種終產(chǎn)物的積累。(一)在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用氨基酸、核苷酸等是初級(jí)代謝中的主要產(chǎn)物、它們生物合成是由反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻恼{(diào)節(jié)機(jī)制所控制。1在直線式生物合成途徑中 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株不能積累終產(chǎn)物，只能累積中間產(chǎn)物。2在分支式生物合成途徑中營(yíng)養(yǎng)缺

32、陷型突變導(dǎo)致協(xié)同反饋調(diào)節(jié)某一分支途徑的代謝阻斷，使這一分支途徑的終產(chǎn)物不能合成。若控制供應(yīng)適量的這一終產(chǎn)物，滿足微生物生長(zhǎng)，將使合成代謝流向另一分支途徑，有利于另一終產(chǎn)物的大量積累。 (二)在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用由于營(yíng)養(yǎng)缺陷型導(dǎo)致初級(jí)或次級(jí)代謝途徑阻斷，所以抗生素產(chǎn)生菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷多數(shù)生產(chǎn)能力是下降的。然而在初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的分支代謝途徑中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型切斷初級(jí)代謝支路有可能使抗生素增產(chǎn)。 滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用滲漏缺陷型是一種特殊的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點(diǎn)是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長(zhǎng)。利用滲漏缺陷型既能少量地合成代謝終產(chǎn)物

33、，又不造成反饋抑制的特點(diǎn)，篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株，其原理類似于營(yíng)養(yǎng)缺陷型，只是不必添加限量的缺陷營(yíng)養(yǎng)物。 抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的突變型菌株。特點(diǎn)是所需產(chǎn)物不斷積累，不會(huì)因其濃度超量而終止生產(chǎn)。如果由于結(jié)構(gòu)基因突變而使變構(gòu)酶成為不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合，失去了反饋抑制的突變，稱為“抗反饋突變型”由于調(diào)節(jié)基因突變引起調(diào)節(jié)蛋白不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合而失去阻遏作用的，稱為“抗阻遏突變型”。（一）回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選1初級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變型2次級(jí)代謝途徑障礙性的回復(fù)突變“零變株”的回復(fù)突變株的篩選：將“零變株”進(jìn)行誘變處理后的菌懸液和完全

34、培養(yǎng)基混均，倒入平板底層，上層覆蓋含有敏感的檢驗(yàn)菌?；蛘哂铆傊瑝K法，培養(yǎng)到適當(dāng)時(shí)候?qū)傊瑝K移到含有敏感檢驗(yàn)菌的瓊脂板上，培養(yǎng)后，根據(jù)菌落周圍形成的透明圈的情況，挑選菌落中恢復(fù)產(chǎn)抗的回復(fù)突變株，挑取的菌落進(jìn)一步搖瓶篩選。共同趨向，即發(fā)生障礙性突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，抗生素產(chǎn)量大多數(shù)都比親株低，而回復(fù)突變株往往比原養(yǎng)型親株高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因：主要是以上缺陷型菌株中幾種不能合成的氨基酸都是參與相應(yīng)抗生素生物合成的。比如甲硫氨酸是金霉素合成的甲基供體，亮氨酸和纈氨酸是合成放線菌素的原料。基因突變結(jié)果，使菌體喪失參與合成這些氨基酸的某種酶的活力，導(dǎo)致有關(guān)抗生素合成過程因缺乏這些氨基酸而產(chǎn)量下降(二)耐自身

35、產(chǎn)物突變株選育(三)抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育結(jié)構(gòu)類似物(亦稱代謝纈抗物)是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物(氨基酸、嘌呤、維生素等)相似的物質(zhì) 較之營(yíng)養(yǎng)缺陷型的方法，優(yōu)點(diǎn)是：（1）抗結(jié)構(gòu)類似物變株的代謝調(diào)節(jié)根本上被解除，（2）抗生突變株易于保存，而且不發(fā)生回復(fù)突變，只要在保存培養(yǎng)基中加適量結(jié)構(gòu)類似物，就可防止回復(fù)突變。 (四)累積前體和耐前體突變株的選育1耐“毒性”前體突變株的選育2耐前體結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育3耐前體的有關(guān)代謝物突變株的篩選 細(xì)胞膜透性突變株的選育1營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育可改變細(xì)胞膜透性生物素缺陷型的突變株：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，

36、參與脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成，最終改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。油酸缺陷型的突變株：由于油酸缺陷型突變株切斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力，即喪失脂肪酸合成能力，必須由外界供給油酸才能生長(zhǎng)，故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細(xì)胞膜的滲透性。甘油缺陷型的突變株：甘油缺陷型的遺傳障礙是喪失磷酸甘油脫氫酶，即喪失L-甘油-3-磷酸NADP氧化還原酶。所以不能合成磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長(zhǎng)。通過選育以上營(yíng)養(yǎng)缺陷剩的變株，而獲得滲透性的細(xì)胞。這也是多年來(lái)谷氨酸生產(chǎn)常用的三種缺陷型菌株。2.溫度敏感突變株的選育 3.溶菌酶敏感突變株的選育 基因重組育種工業(yè)微生物原核與真

37、核的遺傳系統(tǒng)在無(wú)性細(xì)胞中所有的非減數(shù)分裂導(dǎo)致DNA重組的過程叫準(zhǔn)性雜交，這在原核生物和真核生物中均有存在。原核系統(tǒng)：在細(xì)菌中準(zhǔn)性雜交分為接合 (細(xì)胞融合之后重組)，轉(zhuǎn)導(dǎo) (通過噬菌體載體DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞之后進(jìn)行重組)和轉(zhuǎn)化(分離得到的DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中以后的重組)三種類型。真核系統(tǒng)：在真菌中，菌絲融合或胞質(zhì)融合形成一個(gè)雙核體之后，單倍體的核進(jìn)行核配。DNA的重組一般發(fā)生在減數(shù)分裂期，在這之后形成單倍體。在高等植物或動(dòng)物的細(xì)胞融合之后進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)也會(huì)發(fā)生這種重組。酵母菌分無(wú)性繁殖和有性繁殖兩大類，主要是無(wú)性繁殖。 無(wú)性繁殖：包括芽殖 、裂殖 、芽裂繁殖和產(chǎn)生無(wú)性孢子 有性繁殖

38、：主要是產(chǎn)生子囊孢子。芽殖：酵母菌最常見的無(wú)性繁殖方式是芽殖。芽殖發(fā)生在細(xì)胞壁的預(yù)定點(diǎn)上，此點(diǎn)被稱為芽痕，每個(gè)酵母細(xì)胞有一至多個(gè)芽痕。成熟的酵母細(xì)胞長(zhǎng)出芽體，母細(xì)胞的細(xì)胞核分裂成兩個(gè)子核，一個(gè)隨母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入芽體內(nèi)，當(dāng)芽體接近母細(xì)胞大小時(shí)，自母細(xì)胞脫落成為新個(gè)體，如此繼續(xù)出芽。如果酵母菌生長(zhǎng)旺盛，在芽體尚未自母細(xì)胞脫落前，即可在芽體上又長(zhǎng)出新的芽體，最后形成假菌絲狀。 裂殖：是少數(shù)酵母菌進(jìn)行的無(wú)性繁殖方式，類似于細(xì)菌的裂殖。其過程是細(xì)胞延長(zhǎng)，核分裂為二，細(xì)胞中央出現(xiàn)隔膜，將細(xì)胞橫分為兩個(gè)具有單核的子細(xì)胞。 有性繁殖：酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式進(jìn)行有性繁殖的。兩個(gè)臨近的酵母細(xì)胞各自伸

39、出一根管狀的原生質(zhì)突起，隨即相互接觸、融合，并形成一個(gè)通道，兩個(gè)細(xì)胞核在此通道內(nèi)結(jié)合，形成雙倍體細(xì)胞核，然后進(jìn)行減數(shù)分裂，形成4個(gè)或8個(gè)細(xì)胞核。每一子核與其周圍的原生質(zhì)形成孢子，即為子囊孢子，形成子囊孢子的細(xì)胞稱為子囊。酵母菌的生活史單倍體型：以八孢裂殖酵母為代表特點(diǎn):營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞是單倍體；無(wú)性繁殖以裂殖方式進(jìn)行；雙倍體細(xì)胞不能獨(dú)立生活，故雙倍體階段短，一經(jīng)生成立即減數(shù)分裂。雙倍體型：以路德類酵母為代表特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)體為雙倍體，不斷進(jìn)行芽殖，雙倍體營(yíng)養(yǎng)階段長(zhǎng)，單倍體的子囊孢子在子囊內(nèi)發(fā)生接合。單倍體階段僅以子囊孢子形式存在，故不能獨(dú)立生活。單雙倍體型：以啤酒酵母為代表特點(diǎn)：?jiǎn)伪扼w營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和雙倍體營(yíng)養(yǎng)細(xì)

40、胞均可進(jìn)行芽殖。營(yíng)養(yǎng)體既可以單倍體形式也可以雙倍體形式存在；在特定條件下進(jìn)行有性生殖。單倍體和雙倍體世代交替霉菌霉菌的繁殖方式有營(yíng)養(yǎng)繁殖、無(wú)性繁殖和有性繁殖三種。營(yíng)養(yǎng)繁殖：由菌絲中間個(gè)別細(xì)胞膨大形成的休眠孢子，其原生質(zhì)濃縮，細(xì)胞壁加厚，可抵抗高溫與干燥等不良環(huán)境條件。待環(huán)境條件適宜時(shí)，萌發(fā)成菌絲體，無(wú)性繁殖：主要產(chǎn)生節(jié)孢子、分生孢子和孢囊孢子。有性繁殖：主要產(chǎn)生卵孢子、接合孢子和子囊孢子。 雜交育種的步驟和方法 雜交育種的步驟 細(xì)菌的雜交 酵母菌的雜交 霉菌的細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體融合育種 原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn) 原生質(zhì)體融合育種步驟 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體再生率和融合率的計(jì)算 微生物發(fā)酵工藝的特

41、點(diǎn)： 應(yīng)先因素眾多 缺乏理論模型 試驗(yàn)誤差較大 影響因素間存在相互作用因素：試驗(yàn)中考察的對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)可能有影響的因素簡(jiǎn)稱因素。水平：每個(gè)因素在試驗(yàn)中要比較的具體條件稱為水平。工藝優(yōu)化研究的主要步驟：篩選：因素多，不精確的知識(shí)，找出重要的影響因素；優(yōu)化：因素少，在較適范圍內(nèi)，建立預(yù)言性模型確證：使用預(yù)言的最優(yōu)成套條件，驗(yàn)證結(jié)果常用的優(yōu)化方法單因子法：實(shí)驗(yàn)室最常用的優(yōu)化方法是單次單因子法，這種方法是在假設(shè)因素間不存在交互作用的前提下，通過一次改變一個(gè)因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐個(gè)因素進(jìn)行考察的優(yōu)化方法。多因子試驗(yàn)：多因子試驗(yàn)需要解決的兩個(gè)問題:(1)哪些因子對(duì)響應(yīng)具有最大(或最小)的效應(yīng)

42、，哪些因子間具有交互作用。(2)感興趣區(qū)域的因子組合情況，并對(duì)獨(dú)立變量進(jìn)行優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用少量的具有代表性的試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，較快地取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)就是選擇適當(dāng)?shù)恼槐?，合理安排?shí)驗(yàn)的分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種實(shí)驗(yàn)方法。具體可以分為下面四步：（1）根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；（2）根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設(shè)計(jì)正交表頭，并安排實(shí)驗(yàn)；（3）根據(jù)正交表給出的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（4）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選出較優(yōu)的“試驗(yàn)”條件以及對(duì)結(jié)果有顯著影響的因子。如果僅考慮“均勻分散”，而不考慮“整齊可比”，完全從

43、“均勻分散”的角度出發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，叫做均勻設(shè)計(jì)。Plackett-Bunnan設(shè)計(jì)法是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，它試圖用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因子的主效果得到盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因子，供進(jìn)一步優(yōu)化研究用。該法不能考察各因子的相互交互作用。部分因子設(shè)計(jì)法與Plackett-Burman設(shè)計(jì)法一樣是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，能夠用比全因子實(shí)驗(yàn)次數(shù)少得多的實(shí)驗(yàn)，從大量影響因子中篩選出重要的因子。響應(yīng)面分析：方法是數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，和其他統(tǒng)計(jì)方法一樣，由于采用了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最經(jīng)濟(jì)的方式，用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，科學(xué)地提

44、供局部與整體的關(guān)系，從而取得明確的、有目的的結(jié)論。 發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)的基本概念發(fā)酵過程反應(yīng)的描述：XS（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）單位時(shí)間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為比速，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念。微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的基本概念微生物在一個(gè)密閉系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況：微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、Monod方程 產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)的基本概念初級(jí)代謝產(chǎn)物：微生物合成的主要供給細(xì)胞生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。次級(jí)代謝產(chǎn)物：還有一類產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的代謝功能沒有明顯的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等，這一類化合物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用連續(xù)培養(yǎng)的操作特性連續(xù)反應(yīng)器：流入速度=流出速度=F 發(fā)酵

45、過程的代謝控制 發(fā)酵過程控制是發(fā)酵的重要部分 控制難點(diǎn)：過程的不確定性和參數(shù)的非線性發(fā)酵過程工藝控制的目的、研究的方法和層次發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)：簡(jiǎn)單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個(gè)過程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點(diǎn)：產(chǎn)率低，不適于測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在分批培養(yǎng)過程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；還可以利

46、用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點(diǎn)：由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)半連續(xù)培養(yǎng)：在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點(diǎn)：代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大連續(xù)培養(yǎng)：發(fā)酵過程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。優(yōu)點(diǎn)：控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長(zhǎng)，得到高的產(chǎn)量。由于D，通過改變稀釋速率可以比較容易

47、的研究菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)缺點(diǎn)：菌種不穩(wěn)定的話，長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)料染菌機(jī)會(huì)大大增加。 發(fā)酵過程工藝控制的目的：有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長(zhǎng)的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來(lái)。目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率 發(fā)酵過程研究的方法和層次1、研究方法單因子實(shí)驗(yàn)：對(duì)實(shí)驗(yàn)中要考察的因子逐個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)，尋找每個(gè)因子的最佳條件。一般用搖瓶做實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：一次可以進(jìn)行多種條件的實(shí)驗(yàn)，可以在較快時(shí)間內(nèi)得到的結(jié)果。缺點(diǎn)：如果考察的條件多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)。各因子之間可能會(huì)產(chǎn)生交互作用，影響的結(jié)果準(zhǔn)確性數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。如正交

48、設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)。優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)進(jìn)行多因子試驗(yàn)。用少量的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過數(shù)理分析得到單因子實(shí)驗(yàn)同樣的結(jié)果，甚至更準(zhǔn)確，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。但對(duì)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確性高，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法算出來(lái)的，如果實(shí)驗(yàn)中存在較大的誤差就會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)果。2、研究的層次初級(jí)層次的研究：一般在搖瓶規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。主要考察目的菌株生長(zhǎng)和代謝的一般條件。代謝及工程參數(shù)層次研究：一般在小型反應(yīng)器規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。生產(chǎn)規(guī)模放大：在大型發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。發(fā)酵過程的中間分析：是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因?yàn)槲⑸飩€(gè)體極微小，肉眼無(wú)法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來(lái)判斷

49、，所以說(shuō)中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因?yàn)樗鼈兎从嘲l(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況。代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等從檢測(cè)手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測(cè)得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計(jì)算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa等直接參數(shù)又可分為: 在線檢測(cè)參數(shù)和離線檢測(cè)參數(shù) 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目1、pH

50、：pH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān) 酶催化活性2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵3、糖含量：糖的消耗 反映產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖情況反映產(chǎn)物合成的活力?？偺侵赴l(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機(jī)氮中的氮（NH2-N），單位是 mg/100ml。氨氮指無(wú)機(jī)氨中的氮（NH3-N）。5、磷含量：微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來(lái)計(jì)算磷含量的是磷酸根。6、菌濃度和菌形態(tài)：菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長(zhǎng)的情況。7、產(chǎn)物濃度：在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測(cè)定來(lái)了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控

51、制的重要參數(shù)。而且通過計(jì)算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補(bǔ)料、pH對(duì)產(chǎn)物形成的影響。 產(chǎn)物量的測(cè)定酶活力的表示法：酶活力用單位來(lái)表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來(lái)表示酶的量。同一種酶用不同的方法測(cè)定會(huì)有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國(guó)際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強(qiáng)度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個(gè)活性單位。1、化學(xué)法1）滴定法產(chǎn)物能使一定指示劑變色來(lái)指示反應(yīng)終點(diǎn)的可用滴定法（2）比色法產(chǎn)物經(jīng)一定化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測(cè)定。（3）測(cè)壓法產(chǎn)物特定反應(yīng)放出或攝入

52、氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測(cè)定壓力變化得知產(chǎn)物量。2、物理法許多酶、抗生素都有不對(duì)稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過測(cè)定旋光度來(lái)測(cè)定酶或抗生素的含量。化學(xué)和物理方法優(yōu)點(diǎn)：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析缺點(diǎn):產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，因此抗生素成品的測(cè)定用生物法測(cè)定。3、生物法: 適用于抗生素效價(jià)的測(cè)定生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，其原理恰好與臨床應(yīng)用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。但此法得到結(jié)果比較慢，需經(jīng)過1618小時(shí)培養(yǎng)。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價(jià)的測(cè)定。發(fā)酵過程pH變化的原因 1.基質(zhì)代謝：（1）糖代謝 （2）氮代謝 （3）

53、生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降2、產(chǎn)物形成 3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。 pH對(duì)發(fā)酵的影響 （1）pH影響酶的活性。（2） pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變，從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行 （3）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用 （4） pH影響代謝方向 pH的控制 1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH。2、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)3、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH 4、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH 溫度變化及其控制 溫度對(duì)發(fā)酵的影響1、溫度影響反應(yīng)速率2、溫度影響發(fā)酵方向最適溫度的選

54、擇1、根據(jù)菌種及生長(zhǎng)階段選擇2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇3、根據(jù)菌生長(zhǎng)情況發(fā)酵過程引起溫度變化的因素發(fā)酵熱Q發(fā)酵：就是發(fā)酵過程中釋放出來(lái)的凈熱量。1、生物熱Q生物：在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來(lái)，這散發(fā)出來(lái)的熱就叫生物熱。培養(yǎng)過程中生物熱的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的時(shí)間性。生物熱的大小與呼吸作用強(qiáng)弱有關(guān)2、攪拌熱Q攪拌：在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)：通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會(huì)帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計(jì)。4、輻射熱Q輻射：發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。發(fā)酵熱的測(cè)定