中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品嗜熱菌芽孢(需氧.

1、中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品嗜熱菌芽孢（需氧芽孢總數(shù)、平酸芽孢和厭氧芽孢）計數(shù)方法1主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品嗜熱菌芽孢（ 需氧芽孢總數(shù)、平酸芽孢和厭氧芽孢） 的計數(shù)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于谷物產(chǎn)品和食品配料嗜熱菌芽孢計數(shù)。其他食品可參照使用。2設(shè)備和材料2.1取樣工具：刮勺、取樣鏟等。2.2帶蓋樣品瓶或容器。2.3高壓蒸汽滅菌鍋。2.4天平: 感量 0.01g。2.5均質(zhì)器和 1000mL 帶蓋均質(zhì)杯。2.6移液管：容量 1mL、10mL（大口徑）。2.7培養(yǎng)皿：內(nèi)徑 90mm。2.8250mL 三角燒瓶：具 100mL 刻度線。2.9水浴箱：溫度 4548Co2.10

2、 酒精燈。2.11 菌落計數(shù)器。2.12 培養(yǎng)箱：溫度 552Co2.13 蒸汽柜。3培養(yǎng)基3.1 葡萄糖胰蛋白胨瓊脂。3.2 覆蓋瓊脂。3.3 改良亞硫酸鹽瓊脂。3.4 肝湯。4樣品制備4.1 谷物：將 50g 樣品放入滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，加入 200mL 滅菌蒸餾水，以 8000 10000r/min 均質(zhì) 3min,使 成均勻的混懸液。淀粉或面粉： 將 20g 樣品放入盛有適量玻璃珠的 250 mL 滅菌三角燒瓶內(nèi) ,加滅菌蒸餾水至 100mL 刻度線，振搖,使成均勻的混懸液。4.3 糖：將 20 g 干態(tài)糖或相同糖含量的液態(tài)糖（根據(jù)白利度確定。如 29.41g、68 白利度的液態(tài)糖相當(dāng) 于

3、20g干態(tài)糖）放入 250mL 滅菌三角燒瓶內(nèi)，加滅菌蒸餾水至 100mL 刻度線，攪拌使溶解，迅速加熱至沸 并維持 5min，立即用水冷卻。5接種培養(yǎng)和計數(shù)5.1需氧嗜熱芽孢總數(shù)5.1.1谷物、淀粉或面粉 :用大口徑移液管移取 20 mL 谷物混懸液或 10 mL 淀粉或面粉混懸液，在攪拌狀態(tài)下加入盛有 100mL 融化的葡萄糖胰蛋白胨瓊脂（5560C）的 250mL 三角燒瓶內(nèi)。將此混合物在沸 水或蒸汽柜中放置 15 min。輕微攪拌使盡快冷卻，再將全部混合物等量傾注至5 個滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)。凝固后于其表面覆蓋一薄層2%滅菌瓊脂（防止蔓延型菌落出現(xiàn)），待覆蓋瓊脂凝固后，倒置培養(yǎng)皿于 55C保持

4、一定濕度培養(yǎng) 48 ho5.1.2 糖：于 5 個滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)各放入 2 mL 經(jīng)熱處理的糖溶液，傾入葡萄糖胰蛋白胨瓊脂（5560C），輕輕搖動，使樣液與培養(yǎng)基混合均勻。待凝固后，倒置培養(yǎng)皿于 55C保持一定濕度培養(yǎng) 48h。5.1.3 計數(shù) 5 個平板上的菌落。5 個平板上的菌落數(shù)相加，再乘以 2 即為 10 g 谷物中的需氧嗜熱芽抱總 數(shù)。如樣品為淀粉或面粉或糖，則 5 個平板上的菌落數(shù)相加，再乘以 5 即為 10g 樣品中的需氧嗜熱芽抱總數(shù)。5.2平酸芽孢521 對上述 5.1.1 和 5.1.2 條中的平板再進(jìn)行檢查。計數(shù)平板上直徑 15mm,中心有不透明暗色斑點的圓形菌落。在紫色平板

5、上 ,平酸菌菌落通常被黃色暈圈圍繞著。當(dāng)接種菌過多（整個平板呈淡黃色 ）或產(chǎn)低酸的菌株存在時 ,黃色暈圈不明顯或消失。表面以下的菌落致密,兩面凸出 ,近乎針尖狀。如對表面以下菌落有懷疑 ,可挑取此菌落劃線培養(yǎng)于葡萄糖胰蛋白胨瓊脂平板上,以證實表面菌落的特征。樣品中平酸芽孢的計算同上述 5.1.3 條。5.3產(chǎn)硫化氫厭氧芽孢5.3.1將 20 mL 樣品混懸液分裝于 6 支剛剛排氣的改良亞硫酸鹽瓊脂試管內(nèi)。如樣品為谷物、淀粉或面粉，應(yīng)旋緊試管帽，在加熱（在沸水或蒸汽柜中放置15 min）之前和加熱過程 中輕輕顛倒試管數(shù)次，加熱后迅速用水冷卻試管。 預(yù)熱試管至 55C,并在此溫度下培養(yǎng) 48h。5

6、.3.2 產(chǎn)硫化氫厭氧菌在改良亞硫酸 鹽培養(yǎng)基中形成烏黑發(fā)亮的特殊球形區(qū)域，開明顯氣體產(chǎn)生。某些不產(chǎn)硫化氫厭氧菌產(chǎn)生大量氫氣和還原亞硫酸鹽，引起瓊脂斷裂和使整個培養(yǎng)基變黑。但是，這種情況易與上述的黑色球形區(qū)域分開。計數(shù)6 支試管中的黑色球形區(qū)域。 6 支試管中的黑色球形區(qū)域數(shù)相加，再乘以 2 即為 10g 谷物中的產(chǎn)硫化氫 厭氧芽孢數(shù)。如樣品為淀粉或面粉或糖，則 6 支試管中的黑色球形區(qū)域數(shù)相加，再乘以 2.5 即為 10g 樣品中的產(chǎn)硫化氫厭氧芽孢數(shù)。ered_44d04637-1384-4031-94a7-c19cfb89d27c$不產(chǎn)硫化氫厭氧芽孢將 20 mL 樣品混懸液分裝于 6 支

7、剛剛排氣的肝湯試管內(nèi)。 如樣品為谷物、 淀粉或面粉，應(yīng)立即旋緊試管帽，在加熱（在沸水或蒸汽柜中放置15 min）之前和加熱過程中搓轉(zhuǎn)試管數(shù)次。加熱后迅速用水冷卻，并于各試管內(nèi)注入 50C滅菌覆蓋瓊脂，厚度 56cm。待瓊 脂凝固后，預(yù)熱試管至 55C,并在此溫度下 培養(yǎng) 4872 h。瓊脂斷裂，產(chǎn)酸，偶爾伴有干酪氣味，被判定為不產(chǎn)硫化氫厭氧菌。此方法適用于定性試驗或作粗 略定量估計，不能以單位樣品中芽孢數(shù)表示結(jié)果。6 報告結(jié)果需氧嗜熱芽孢總數(shù)、平酸芽孢、產(chǎn)硫化氫厭氧芽孢 : 按芽孢數(shù) /10g 樣品報告結(jié)果。 6.2 不產(chǎn)硫化氫厭 氧芽孢: 按陽性或陰性 （或 ）管數(shù)報告結(jié)果。附 錄 A 培養(yǎng)

8、基制備 （補(bǔ)充件 ）A1 葡萄糖胰蛋白胨瓊脂胰蛋白胨 10g葡萄糖 5g2溴甲酚紫乙醇溶液 2mL瓊脂 15g蒸餾水 1000mL最終 pH 6.70.1將各成分混懸于蒸餾水中，靜置 5min，混合均勻，加熱，不時攪拌煮沸 1min，分裝于玻璃瓶內(nèi)，121C高壓滅菌20min 。A2 覆蓋瓊脂瓊脂 20g蒸餾水 1000mL將瓊脂混懸于蒸餾水中，靜置 5min，加熱煮沸使溶解，分裝于試管或三角燒瓶內(nèi)，121C高壓滅菌 20 min。A3 改良亞硫酸鹽瓊脂蛋白胨 10g無水亞硫酸鈉1g20g1000mL將蛋白胨、亞硫酸鈉和瓊脂混懸于蒸餾水中，充分混合，加熱使溶解。分裝試管，每管 1015mL,再

9、于各試 管內(nèi)加入適量清潔的混鐵粉或鐵屑。不調(diào) pH。121C高壓滅菌 20min。如不使用固體亞硫酸鈉，每周需配制 新鮮亞硫酸鈉溶液。A4 肝湯將 500g 碎牛肝加入 1000mL 蒸餾水中，振搖，微火煮沸 1h,調(diào)至 pH7.0,再煮沸 10min。用紗布過濾，擠壓出液 體部分，并稀釋至 1000mL。加入蛋白胨 10g，磷酸氫二鉀 1g，再調(diào)至 pH7.0。將煮沸過的碎牛肝（12cm 厚）和 肝湯（1012mL）加入 18X150mm 試管內(nèi)，12C高壓滅菌 20min。除新鮮配制以外，使用前以流動蒸汽加熱培 養(yǎng)基 20min 以上，以排除培 養(yǎng)基內(nèi)的空氣。接種后用滅菌瓊脂（50C）覆蓋，厚度 56cm。附加說明： 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國湖北進(jìn)出口商 品檢驗局、福建進(jìn)出口商品檢驗