現(xiàn)代生物技術(shù) 第2講

1、現(xiàn)代生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù) 第二講第二講基因工程與環(huán)境污染生物治理基因工程與環(huán)境污染生物治理2021-11-61授課內(nèi)容1. 現(xiàn)代生物技術(shù)概況2. 基因工程與環(huán)境污染生物治理3. 細(xì)胞工程與環(huán)境污染生物處理4. 酶學(xué)工程與環(huán)境污染生物治理5. 發(fā)酵工程在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用6. 生態(tài)工程與污水處理系統(tǒng)人造化學(xué)品與生物進(jìn)化 工業(yè)革命以來，化石能源大大規(guī)模開發(fā) 礦產(chǎn)資源大大規(guī)模開發(fā)和利用 人類在近代才開始大規(guī)模的合成化學(xué)品 20世紀(jì)末已經(jīng)合成出來并經(jīng)過校核的化合物總數(shù)已超過2000萬種，而且新化合物增長的速度仍然保持在每年數(shù)百萬種的水平。2021-11-63環(huán)境生物面臨的環(huán)境 礦產(chǎn)資源開采，大量重金

2、屬從地球深層暴露于地表，造成的重金屬暴露于環(huán)境 化石能源的開采導(dǎo)致了原油污染和重金屬污染 大量合成的化合物，有些具有非常特殊的性質(zhì)，如持久性，劇毒，難降解，有些則使用規(guī)模非常巨大 環(huán)境微生物是環(huán)境中最關(guān)鍵的污染修復(fù)者，他們的進(jìn)化已經(jīng)趕不上環(huán)境的變化2021-11-64解決問題的方法呢？ 通過基因工程改造微生物，使之能夠處理現(xiàn)階段環(huán)境污染物，能夠達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的 集中與創(chuàng)造目的基因提供綜合性代謝新污染物的通路和雜種細(xì)胞； 提高代謝通路結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，針對新的污染物，改變表達(dá)的調(diào)節(jié)方式； 控制降解途徑的限制性步驟，提高分解代謝酶的合成或其他生化反應(yīng)過程效率； 防止有毒終污染物的產(chǎn)生，防止非需要產(chǎn)

3、品的出現(xiàn)，用確定的基因?qū)崿F(xiàn)最初的目的。2021-11-65DNA變性 加熱、極端的加熱、極端的pH 甲醇、乙醇甲醇、乙醇 尿素、甲酰胺尿素、甲酰胺 2021-11-66 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序PCR技術(shù)的反應(yīng)原理2021-11-67一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程2021-11-689一種限制酶只能識(shí)別一種特定核苷酸序列；并在特定切點(diǎn)切割一. 限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具 1、來源：2、種類：3、作用：主要是微生物4000種。2021-11-6104、結(jié)果：形成兩種末端

4、粘性末端平末端2021-11-6112021-11-6幾種重要的內(nèi)切酶2021-11-61213 要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？被同一種限制酶切斷的幾個(gè)來源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？2021-11-614二個(gè)不同的DNA的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。被同一種限制切斷的幾個(gè)DNA具有相同的黏性末端。2021-11-615二. DNA連接酶“分子縫合針”、作用：把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來2021-11-616二、基因的針線DNA連接酶連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對的兩個(gè)黏性末端連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子

5、。2021-11-617基因的針線：基因的針線：DNA連接酶連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割2021-11-618三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載”分子運(yùn)輸車” 、作用：將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞、特點(diǎn)（條件）1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存2、具有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便與外源基因連接3、具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選2021-11-619、常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和動(dòng)植物病毒

6、等標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測。都有侵染或進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力它們的共同特點(diǎn)是： 其中質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌和酵母菌等生物中,是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子.2021-11-620第一步：第一步：（二）基因工程基本步驟：第二步：獲取目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合方法：1、直接分離：鳥槍法2、人工合成：注意：要保持基因的完整性注意：要用同一種限制酶切取目的基因和運(yùn)載體，并用DNA連接酶連接。2021-11-621第三步：第四步:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測和表達(dá)1、常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、動(dòng)植物細(xì)胞等2、常用微生物作受體細(xì)胞的原因：微生物增殖快、代謝快、目的產(chǎn)物多

7、3、若受體細(xì)胞為細(xì)菌應(yīng)作何處理：應(yīng)用CaCl2處理一般檢測：標(biāo)記基因是否表達(dá)目的是：增大細(xì)胞壁的通透性2021-11-62021-11-622基因工程在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用 石油污染物降解 多環(huán)芳烴降解 鹵代芳烴講解基因工程菌 尼龍寡聚物基因工程菌 多糖分解基因工程菌 抗重金屬基因工程菌 殺蟲劑降解基因工程菌 植物基因工程石油的歷史 宋朝的沈括記錄了最早的石油，他在現(xiàn)在的延州發(fā)現(xiàn)了石油“鹿延境內(nèi)有石油。舊說高奴縣出脂水，即此也” 二朗山下雪紛紛，旋卓穹廬學(xué)塞人，化盡素衣冬不老，石油多似洛陽塵 本草衍義鹿延界內(nèi)有石油，燃之，煙甚濃，其煤叮為墨，黑光如漆，松煙不入，其識(shí)文曰延川石液者，是不可人藥，當(dāng)附于

8、此2021-11-623石油的大規(guī)模開采和利用 內(nèi)燃機(jī)的出現(xiàn)大大的推動(dòng)了原油的開采和利用 石油是現(xiàn)在最重要的工業(yè)原料2021-11-624近年來的石油污染事件 1980 年代初發(fā)生在英國北海的油田和油輪漏油事件 在美國阿拉斯加威廉王子海峽觸礁的萬噸級“埃克森瓦爾迪茲號(hào)”油輪使得 5000 萬加侖原油傾瀉進(jìn)海里 90 年代初，由于中東海灣戰(zhàn)爭的破壞，原油以每天數(shù)百萬桶的速度從艾哈邁迪輸油管中漏入海中，在海灣內(nèi)形成一片長 56 千米、寬 16 千米的油膜，溢油總量達(dá) 170 萬噸 2011年，康菲漏油事件，康菲公司賠償50萬美金 2010年，墨西哥灣漏油事件，英石油同意賠償187億美元 在開采和廢

9、棄的油井附近存在2021-11-625石油污染的危害 組成復(fù)雜：石油的成分復(fù)雜c4-30的烷烴；芳香烴；多環(huán)芳烴 造成海洋、陸地等大面積的污染 難于降解 對水鳥和水生生物有嚴(yán)重威脅 對漁業(yè)造成影響 陸地上同樣對動(dòng)植物的災(zāi)難性的 接觸會(huì)有致癌性和過敏反應(yīng)2021-11-6262021-11-627石油降解菌在自然界中,能夠降解石油污染物質(zhì)的微生物分布廣泛,主要集中在細(xì)菌、霉菌、放線菌、真菌、酵母和藻類。一般認(rèn)為, 細(xì)菌更能有效地降解原油,因其數(shù)目最多。細(xì)菌類:不動(dòng)桿菌屬(Acimtobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、節(jié)桿菌屬(Archrobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Aka

10、ligems)、黃桿菌屬(Flavobacterhm)、微桿菌屬 (Microbacter)、棒桿菌屬(Coryneforms) 、微球菌(Mycobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus);真菌類:假絲酵母屬(Candida)、金色擔(dān)子菌屬(Aureobasidium)、毛霉屬（Mucor)、擲抱酵母屬(Spowbolomyces)、紅酵母屬(Rhodotomla)、青霉屬(PeniciHum)、曲霉屬(Aspergillus )、被孢霉屬(Mortierella )、練刀霉屬(Fuscnium)、木霉屬(Trichoderma );放線菌類：諾卡氏菌屬(Nocardia)、鏈霉屬

11、;藻類包括魚腥藻(Anabeana)、顫藻屬 (Oscillatoria)、鞘藻屬(Microcoleus)等。2021-11-628直鏈烷烴的降解 直鏈烷烴的降解形式包括三種:雙末端氧化、單一末端氧化以及次末端氧化 單加氧酶RnCH3 RnCH2OH RnCHORn-1CH3 RnCOOH2021-11-629芳香烴的降解2021-11-630微生物降解石油的影響因素氧氣溫度濕度鹽度pH壓力微生物數(shù)量利用程度2021-11-631基因特征通過轉(zhuǎn)移或者結(jié)合方式從其它可降解該有機(jī)物的微生物中得到相應(yīng)的降解基因,這就會(huì)導(dǎo)致同一環(huán)境中因相同污染物的存在而使各菌株降解基因具有高度的同源性。即使這些菌株

12、存在于不同的環(huán)境,由于具有對同一污染物的降解特性而使基因也具有較高的同源性,并且獲得的降解基因在微生物種群中會(huì)普遍傳播。大量研究表明,石油污染過的環(huán)境中,具有降解能力的微生物的數(shù)量會(huì)大大增長,其中大部分是含有降解質(zhì)粒的微生物,增長幅度可提高數(shù)倍甚至是數(shù)十倍。沒有受到石油污染的環(huán)境中含有質(zhì)粒的細(xì)菌,比在被石油污染過的環(huán)境中出現(xiàn)的數(shù)量大幅度降低2021-11-632研究歷史Chakrabarty等人在非發(fā)酵細(xì)菌中提取出降解樟腦的質(zhì)粒。編碼多環(huán)芳烴、編碼脂肪烴、編碼芳香烴及它們的氯代芳烴、多氯聯(lián)苯及氧化產(chǎn)物的基因,并且這類降解基因都位于質(zhì)粒上,目前已發(fā)現(xiàn)的降解質(zhì)粒已經(jīng)達(dá)到了數(shù)百種。Kumar等人從被

13、石油污染過的土壤中分離得到嗜熱脂肪土芽孢桿菌AAP7919,該菌株含有降解蒽的質(zhì)粒, 在高溫下對蒽具有較好的降解效果Emtiazi等人發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonas sp)可以分解烯烴Chang-Hyun Chang等人從石油污染過的土壤中得到Staphylocollus, sp. KW-07菌株,該菌株對于土壤中的多環(huán)芳經(jīng)(PAH)具有極好的降解效果2021-11-633不動(dòng)桿菌BS3 16S rRNA序列分析2021-11-634Ribosomal RNA Sequences核糖體RNA序列與進(jìn)化（1）具有重要且恒定的生理功能；（2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具

14、有適當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?；?）分子量大小適中，在細(xì)胞中含量大(約占細(xì)胞中RNA的90%)（4）高度保守、中度保守和高度變化的序列區(qū)域，適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。小核糖體亞單位RNA（16S rRNA， 5S rRNA ，23S rRNA）BS3具有脂肪烴分解能力2021-11-636pH對BS3烷烴降解的影響2021-11-6372021-11-6382021-11-6392021-11-6402021-11-641烷烴碳鏈長度影響2021-11-642BS3對芳香烴的降解2021-11-643BNF1的降解能力2021-11-6442021-11-645Acinetobacter

15、sp.BS3-C23O基因工程菌 將C230基因重組到自殺性質(zhì)粒pUT/mini-Tn5轉(zhuǎn)座子載體中,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體pUT/mini-Tn5-C23O利用三親結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)將C2JO基因插入到受體菌BS3的染色體中,并篩選到一株轉(zhuǎn)基因工程菌Acinetobacter sp.BS3-C23O2021-11-646基因重組BS3-C23O鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活性測定2021-11-6472021-11-6482021-11-6492021-11-6502021-11-6512021-11-652實(shí)驗(yàn)室模擬應(yīng)用情況2021-11-653污染土壤玉米發(fā)芽率2021-11-654井場原位修復(fù)實(shí)驗(yàn)20

16、21-11-655農(nóng)藥一農(nóng)藥是人類向環(huán)境投放規(guī)模最大的化學(xué)品我國年產(chǎn)農(nóng)藥160萬多噸，使用量約100萬噸農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)1800多家二農(nóng)藥也是單位面積投放量最大的化學(xué)品2013年國土資源部統(tǒng)計(jì)公布，全國耕地13538.5萬公頃園地1481.2萬公頃、林地25395.0萬公頃、草地28731.4萬公頃三農(nóng)藥不同于其他化學(xué)品，其具有明顯生物效應(yīng)2021-11-656四人類會(huì)直接或間接通過食物鏈攝入農(nóng)藥化學(xué)品 我國人均每年的農(nóng)藥使用量約1.2kg五農(nóng)藥連續(xù)重復(fù)使用，在環(huán)境中具有很強(qiáng)的持久性 農(nóng)藥對農(nóng)作物、非靶標(biāo)生物、土壤、水體、大氣都造成嚴(yán)重的污染，對 生態(tài)系統(tǒng)和人類健康境造成嚴(yán)重威脅六、高毒的有機(jī)磷農(nóng)

17、藥還常常被檢出，濫用造成巨大危害農(nóng)藥2021-11-657有機(jī)磷農(nóng)藥有機(jī)磷農(nóng)藥（OPS）是我國使用廣泛、用量最大的殺蟲劑。作用位點(diǎn)為乙酰膽堿酯酶受體主要包括敵敵畏、對硫磷（1605）、甲拌磷（ 3911）、內(nèi)吸磷（1059）、樂果、敵百蟲、馬拉硫磷（4049）等。急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒（AOPP）是指有機(jī)磷農(nóng)藥短時(shí)大量進(jìn)入人體后造成的以神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的一系列傷害，臨床上主要包括急性中毒患者表現(xiàn)的膽堿能興奮或危象，其后的中間綜合征（IMS）以及遲發(fā)性周圍神經(jīng)病（OPIDPN）。每年全世界有數(shù)百萬人發(fā)生AOPP，其中約有30萬人口死亡，且大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家。2021-11-658水胺硫磷2021

18、-11-6592021-11-6602021-11-6612021-11-662節(jié)桿菌sc1-2 水胺硫磷污染的土壤采自江蘇南通長期受水胺硫磷農(nóng)藥污染的土壤2021-11-663節(jié)桿菌sc1-2對水胺硫磷的降解2021-11-664苯線磷降解產(chǎn)物2021-11-665甲基對硫磷2021-11-666降解相關(guān)的基因和酶 水解酶基因oph 水解酶OPD2021-11-667大腸桿菌中提取的OPD對10mg/L水胺硫磷降解曲線2021-11-668基因工程菌的構(gòu)建2021-11-669三株基因工程菌 惡臭假單胞菌 (P.putida KT2440-mpd-oph) 鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.BHC-mpd-oph) 副球菌