微生物與基因工程

1、；第十章 微生物與基因工程基因工程（genetic engineering）或重組DNA技術(shù)(recombinant DNA technology) 是指對遺傳信息的分子操作和施工，即把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)，使其擴增和表達，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀?；蚬こ踢@個術(shù)語可以用來表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技術(shù)系統(tǒng)，其核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)。因此，基因工程和重組DNA技術(shù)有時也就成為同義詞。基因工程是在現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和化學(xué)工程學(xué)以及其他數(shù)理科學(xué)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生和發(fā)展起來的，并有賴于微生物學(xué)的理論和技術(shù)的發(fā)展和運用，微生物在基因工程

2、的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用?；蚬こ痰某霈F(xiàn)是本世紀生物科學(xué)具有劃時代意義的巨大事件，它使得生物科學(xué)獲得迅猛發(fā)展，并帶動了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起。它的出現(xiàn)標志著人類已經(jīng)能夠按照自己意愿進行各種基因操作，大規(guī)模生產(chǎn)基因產(chǎn)物，并且去設(shè)計和創(chuàng)建新的基因、新的蛋白質(zhì)和新的生物物種，這也是當今新技術(shù)革命的重要組成部分。第一節(jié) 基因工程概述 一、基因工程的發(fā)展歷史基因工程是在本世紀70年代初開始出現(xiàn)的。三項關(guān)鍵技術(shù)的建立為基因工程奠定了基礎(chǔ)，這三項技術(shù)是：DNA的特異切割、DNA的分子克隆和DNA的快速測序。早在50年代，阿爾伯（Arber）的實驗室就已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠限制侵染的噬菌體，60年代末進而

3、證明大腸桿菌細胞內(nèi)存在修飾限制系統(tǒng)，即給宿主自身DNA打上甲基化標記并切割入侵的噬菌體DNA。1970年史密斯（Smith）等人從流感嗜血桿菌（Hemophilus influenzae）中分離出特異切割DNA的限制酶。次年，內(nèi)森斯（Nathans）等人用該酶切割猴病毒SV40 DNA，最先繪制出DNA的限制圖譜（restriction map）。1973年史密斯和內(nèi)森斯提出修飾限制酶的命名法。限制性核酸內(nèi)切酶可用以在特定位點切割DNA，限制酶的發(fā)現(xiàn)使分離基因成為可能。為表彰上述科學(xué)家在發(fā)現(xiàn)和使用限制酶中的功績，1978年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎被授予阿爾伯、內(nèi)森斯和史密斯。1973年，科恩（Cohen

4、）和博耶（Boyer）等將pSC101質(zhì)粒作為載體與R質(zhì)粒的四環(huán)素和卡那霉素的抗性基因相融合，并將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，首次實現(xiàn)了DNA的分子克隆。1975年桑格（Sanger）實驗室建立了酶法快速測定DNA序列的技術(shù)。1977年吉爾伯特（Gilbert）實驗室又建立了化學(xué)測定DNA序列的技術(shù)。分子克隆和測序方法的建立，使重組DNA技術(shù)系統(tǒng)得以產(chǎn)生。1980年諾貝爾化學(xué)獎被授予伯格、吉爾伯特和桑格，以肯定他們在發(fā)展DNA重組與測序技術(shù)中的貢獻。1977年板倉（Itakura）和博耶用人工合成的生長激素釋放抑制素（Somatostatin, SMT）基因構(gòu)建表達載體，并在大腸桿菌細胞內(nèi)表達成

5、功，得到第一個基因工程的產(chǎn)品。1982年，在建立轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)上均獲得重大突破。借助土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒可將外源基因?qū)腚p子葉植物細胞內(nèi)并發(fā)生整合，從而使植株獲得新的遺傳性狀。同年通過基因工程方法把大鼠生長激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宮內(nèi)，由此培育出巨型小鼠。僅僅10年時間，基因工程在實踐中迅速成熟，日趨完善。二、基因工程的基本過程生物的遺傳性狀是由基因（即一段DNA分子序列）所編碼的遺傳信息決定的?；蚬こ滩僮魇紫纫@得基因，才能在體外用酶進行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、質(zhì)?；蛉旧wDNA片段構(gòu)建成的載體，并將重組體DNA轉(zhuǎn)入微生物或動、植物細胞，使

6、其復(fù)制（無性繁殖），由此獲得基因克隆（clone，無性繁殖系的意思）?；蜻€可通過DNA聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）在體外進行擴增，借助合成的寡核苷酸在體外對基因進行定位誘變和改造?？寺〉幕蛐枰M行鑒定或測序?？刂七m當?shù)臈l件，使轉(zhuǎn)入的基因在細胞內(nèi)得到表達，即能產(chǎn)生出人們所需要的產(chǎn)品，或使生物體獲得新的性狀。這種獲得新功能的微生物稱為“工程菌”，新類型的動、植物分別稱為“工程動物”和“工程植物”，或“轉(zhuǎn)基因動物”和“轉(zhuǎn)基因植物”?；蚬こ滩僮鬟^程大致可歸納為以下主要步驟：分離或合成基因；通過體外重組將基因插入載體； 將重組DNA導(dǎo)入細胞；擴增克隆的基因；篩選重組體克?。粚寺〉幕蜻M行鑒定或測序；

7、控制外源基因的表達；得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物。上述步驟可用圖10-1來表示。 圖10-1 基因工程基本操作過程示意圖三、微生物學(xué)與基因工程的關(guān)系微生物和微生物學(xué)在基因工程的產(chǎn)生和發(fā)展中占據(jù)了十分重要的地位，可以說一切基因工程操作都離不開微生物。從以下六個方面可以說明：基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成；基因工程所用千余種工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化得到的；微生物細胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和動物基因工程也要先構(gòu)建穿梭載體，使外源基因或重組體DNA在大腸桿菌中得到克隆并進行拼接和改造，才能再轉(zhuǎn)移到植物和動物細胞中；為大規(guī)模表達各種基因產(chǎn)物

8、，從事商品化生產(chǎn)，通常都是將外源基因表達載體導(dǎo)入大腸桿菌或是酵母菌中以構(gòu)建成工程菌，利用工廠發(fā)酵來實現(xiàn)的；微生物的多樣性，尤其是抗高溫、高鹽、高堿、低溫等基因，為基因工程提供了極其豐富而獨特的基因資源；有關(guān)基因結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達調(diào)控的理論主要也是來自對微生物的研究中取得的，或者是將動、植物基因轉(zhuǎn)移到微生物中后進行研究而取得的，因此微生物學(xué)不僅為基因工程提供了操作技術(shù)，同時也提供了理論指導(dǎo)。第二節(jié) 微生物與克隆載體外源DNA片段進行克隆，需要一個合適的載體，將其運送到細胞中并進行復(fù)制與擴增。這種以擴增外源DNA為目的載體，稱為克隆載體（cloning vector）。作為克隆載體的基本要求是：（1

9、）載體在細胞中必須能夠進行獨立自主地復(fù)制。因此載體應(yīng)是一個獨立的復(fù)制子（replicon），具有復(fù)制起始序列，可在細胞中進行有效擴增。（2）載體必須具有若干限制酶的單一切割位點，便于外源DNA的插入。并且由于這些酶切位點位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，故插入適當大小外源DNA片段后載體仍然能夠進行正常的復(fù)制。（3）載體必須具有可供選擇的遺傳標記，例如具有抗生素的抗性基因，便于對陽性克隆的鑒別和篩選。（4）載體DNA須易于生長和操作。到目前為止，基因工程中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括六大類：質(zhì)粒載體；噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒載體；M13噬菌體載體；真核細胞的克隆載體；人工染色體等。一、質(zhì)?？寺≥d體

10、1.質(zhì)粒克隆載體的特性 當前分子克隆中所用的克隆載體，絕大多數(shù)是利用細菌的質(zhì)粒，經(jīng)人工修飾改造而成。質(zhì)粒作為克隆載體，具有十分有利的特性：（1）具有獨立復(fù)制起點作為克隆載體的質(zhì)粒，通常都含有一個復(fù)制起點，這是質(zhì)粒在宿主細胞中進行擴增的必要條件。（2）具有較小的分子量 質(zhì)粒是染色體外DNA，通常由環(huán)形雙鏈DNA構(gòu)成，其分子大小約為1200Kb。低分子量有利于DNA的分離和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超過15Kb。（3）具有較高拷貝數(shù)每個細胞可含有10200個拷貝的松弛型復(fù)制質(zhì)粒。當加入蛋白質(zhì)合成抑制劑（如氯霉素等），還可大大增加細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)，每個細胞可含有高達數(shù)千個拷貝

11、的質(zhì)粒，使外源DNA得以大量擴增。（4）具有便于選擇的標記 某些質(zhì)粒中存在著抗生素的抗生基因，便于對克隆基因的檢測和篩選。（5）易于導(dǎo)入細胞 質(zhì)粒可通過轉(zhuǎn)化或電穿孔等方法極易被導(dǎo)入細胞。（6）具有安全性 作為載體的質(zhì)粒不具有轉(zhuǎn)移功能，防止帶有外源DNA的重組質(zhì)粒擴散至實驗室外，以免造成危害。2質(zhì)粒pBR322的結(jié)構(gòu)特點大腸桿菌質(zhì)粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的質(zhì)粒（圖102），它是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年構(gòu)建而成的，是一個典型的人工質(zhì)粒載體。質(zhì)粒pBR322是環(huán)狀雙鏈DNA分子，由4361bp組成?？刹迦胪庠碊NA大小為5kb左右，外源DNA若超過10kb，質(zhì)粒

12、在復(fù)制時就會變得不穩(wěn)定。它具有一個復(fù)制起點，是松弛型質(zhì)粒，故細胞中具有較高的拷具數(shù)，每個細胞含有2030個拷貝。當加入氯霉素擴增之后，每個細胞可含有10003000個拷貝，大大有利于重組質(zhì)粒在細胞中的擴增。此外，pBR322還具有兩種抗生素的抗性基因，一個是四環(huán)素抗性基因（Tetr）另一個是氨芐青霉素抗性基因（Ampr）。已知有24種主要限制酶在pBR322上都只有一個切點，其中有7種限制酶（EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、 XmaIII、 NruI）的切點位于四環(huán)素抗性基因之內(nèi)，還有3種限制酶（ScaI 、PvuI和PstI）的切點位于氨芐青霉素抗性基因之內(nèi)。外源DNA

13、片段插入這些位點之中任一位點時，將導(dǎo)致相應(yīng)的抗性基因的失活。這種因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活（insertional inactivation）。圖10-2 質(zhì)粒pBR322結(jié)構(gòu)圖插入失活常被用于檢測含有外源DNA的重組體（圖103），例如若在質(zhì)粒pBR322的BamHI的位點插入外源DNA，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Tets、Amps ）。含有重組質(zhì)粒（即帶有外源DNA的質(zhì)粒）的宿主細胞失去對四環(huán)素的抗性，所以不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基的平板上生長，但仍能在含有氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上生長。而那些含有不帶外源基因的質(zhì)粒的宿主細胞，則可以在含有四環(huán)素或氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上生長，

14、這樣就很容易篩選到含有目的基因的細菌，從而淘汰不含目的基因的細菌。圖10-3 插入失活示意圖3. 其它質(zhì)粒載體現(xiàn)在已構(gòu)建許多新的質(zhì)粒載體 (如pUC系列和pGEM系列的質(zhì)粒載體)，它們具有更多有用的特點并且使用起來更方便。 這些載體的優(yōu)點之一，在質(zhì)粒載體上含有一個人工構(gòu)建的多接頭位點 (polylinker) 或多克隆位點(multiple cloning site)，這是一個帶有不同限制酶單一識別位點的短的DNA片段，外源基因可隨意插入任何一個切點。同時又由于多克隆位點常位于一個基因的編碼區(qū)之中，因此，基因的插入失活極易被檢測到。除大腸桿菌質(zhì)粒外，枯草芽孢桿菌質(zhì)粒也可作為質(zhì)粒載體之用。此外，

15、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的2m m質(zhì)粒常作為酵母細胞外源基因的克隆或表達載體。為了便于基因工程工作，人們先后構(gòu)建了一系列不同類型的穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector）。這是一類同時含有兩種細胞的復(fù)制起點（特別是同時含有原核與真核生物的復(fù)制起點），能在兩種生物細胞中進行復(fù)制的質(zhì)粒載體。其中最為常見和被廣泛應(yīng)用的是大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒同時含有大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點，故既可在大腸桿菌細胞中復(fù)制又可在酵母細胞中進行復(fù)制。此外還有其他穿梭質(zhì)粒載體系統(tǒng)。二、噬菌體克隆載體噬菌體是基因工程中一類很有價值的克隆載體，具有很多

16、優(yōu)點：它的分子遺傳學(xué)背景十分清楚。噬菌體載體的容量較大。一般質(zhì)粒載體只能容納10多個kb。而噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段。具有較高的感染效率。其感染宿主細胞的效率幾乎可達100，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有0.1。以上優(yōu)點為克隆較大片段的外源DNA提供了有利條件，并可大大增加構(gòu)建基因庫的效率。1.噬菌體載體的構(gòu)建 野生型噬菌體DNA不適于作為克隆載體，因為它的DNA分子很大，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，限制酶有很多切點，并且這些切點多數(shù)位于必需基因之中等等。為了避免上述問題，需經(jīng)一系列改造。構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本原則是：刪除基因組中非必需區(qū)，使基因組變小，有利于克隆大的DNA片段。除去多

17、余的限制位點?，F(xiàn)已構(gòu)建了各種各樣的載體。這些載體可分為兩類：一類稱為插入型載體（insert vector）其限制酶位點可用于外源DNA的插入；另一類稱為取代型載體（replacement vector）具有成對限制酶位點，外源DNA可取代兩個限制位點上的DNA區(qū)段。重組DNA與包裝蛋白混合，可在體外包裝成有感染力的重組噬菌顆粒。雖然噬菌體載體是一類極為有用的克隆載體，但是由于噬菌體頭部組裝時容納DNA 的量是固定的，因此插入外源DNA的長度必須控制在使重組DNA為野生型DNA長度的78105之間，否則不能正常組裝。三、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vector）即粘粒載體，是由噬菌

18、體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成。cosmid一詞的意思是帶有cos位點的質(zhì)粒。柯斯質(zhì)粒載體含有來自質(zhì)粒的一個復(fù)制起點、抗藥性標記、一個或多個限制酶單一位點，以及來自噬菌體粘性末端的DNA片段，即cos位點。它對于將DNA包裝成噬菌體粒子是必需的?？滤官|(zhì)粒載體的優(yōu)點：具有噬菌體的高效感染力。而在進入宿主細胞后不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在。具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式。重組DNA注入宿主細胞后，兩個cos位點連接形成環(huán)狀DNA分子，如同質(zhì)粒一樣進行復(fù)制。具有克隆大片段外源DNA的能力。這是柯斯質(zhì)粒的最大優(yōu)點?？滤官|(zhì)粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段的極限值竟高達45kb，遠遠超過質(zhì)粒載

19、體及噬菌體載體的克隆能力。四、M13噬菌體載體M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀ssDNA，大小為6407bp。感染雄性（F+或Hfr）大腸桿菌并進入細胞后，轉(zhuǎn)變成復(fù)制型 (RF) dsDNA，然后以滾環(huán)方式復(fù)制出ssDNA。每當復(fù)制出單位長度正鏈，即被切出和環(huán)化，并被立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細胞不被裂解）被釋放至胞外。野生型M13不適于作為克隆載體，因此人們對野生型M13進行了改造，構(gòu)建了一系列M13克隆載體（圖10-4）。在M13基因組中，除基因間隔區(qū)（IG）外，其他均為復(fù)制和組裝所必需的基因。外源DNA插入IG區(qū)，可不影響M13活動，因此對野生型M13的改造主要在

20、IG區(qū)中進行。圖10-4 噬菌體載體M13 mp 18 的結(jié)構(gòu)示意圖（1） 插入半乳糖苷酶選擇標記 在IG區(qū)中插入半乳糖苷酶N端一小段編碼序列及其調(diào)控序列，該序列編碼半乳糖苷酶的肽，肽可與大腸桿菌LacZ突變基因M15進行互補，產(chǎn)生具有活性的半乳糖苷酶。若將M13和宿主細胞涂布在含有異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍色噬菌斑。（2） 插入一小段多克隆位點區(qū) 在肽的編碼區(qū)內(nèi)插入一小段密集限制酶單一位點的DNA片段，當外源DNA插入到這一區(qū)段，則會破壞互補作用。這時若將M13（含外源DNA）和宿主細胞涂布在含有

21、IPTG和Xgal培養(yǎng)基的平板上，則形成無色噬菌斑。M13載體克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆300400bp的外源DNA片段，它的突出優(yōu)點是，特別適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。因此，它主要被用于制備測序用單鏈DNA模板、特異的單鏈DNA探針，定位誘變等。也可用于噬菌體展示（phage display）。五、噬菌質(zhì)粒載體噬菌質(zhì)粒（phagemid 或phasmid）是由絲狀噬菌體和質(zhì)粒載體DNA融合而成，兼有兩者優(yōu)點，這類載體具有來自M13或f1噬菌體的基因間隔區(qū)（內(nèi)含M13或f1噬菌體復(fù)制起點）和來自質(zhì)粒的復(fù)制起點，抗藥性標記，一個多克隆位點區(qū)等。例如pUC118噬菌質(zhì)粒載體就是

22、在野生型M13的基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒載體pUC18構(gòu)建而成的。噬菌質(zhì)粒在寄主細胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復(fù)制產(chǎn)生雙鏈DNA。當用輔助噬菌體M13感染宿主細胞后，噬菌質(zhì)粒的復(fù)制就轉(zhuǎn)變成如同M13噬菌體一樣的滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生單鏈DNA并被包裝成噬菌體粒子， 以出芽方式釋放至胞外。噬菌質(zhì)粒載體在應(yīng)用上具有許多優(yōu)點：載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作。克隆外源DNA的容量較M13噬菌體載體大，可克隆10kb外源DNA片段。可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源基因。現(xiàn)將上述幾類大腸桿菌克隆載體的克隆能力及其主要用途列表比較（表10-1）表10-1 幾類大腸桿菌克隆載體比較載體類型 克隆外源DN

23、A片段大小 主要用途 質(zhì)粒載體 <15kb 克隆和表達外源基因；DNA測序 噬菌體載體 <23kb 構(gòu)建基因文庫和cDNA文庫 柯斯質(zhì)粒載體 <45kb 構(gòu)建基因文庫 M13載體 300400bp 制備單鏈DNA；定位誘變；噬菌體展示 六、真核生物的克隆載體以上主要討論了原核生物的克隆載體。但是關(guān)于真核生物基因調(diào)控以及真核基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄及翻譯后的加工等問題，是原核生物載體所無法解決問題。因此為了適應(yīng)真核生物基因工程的需要，現(xiàn)已構(gòu)建了一系列真核生物載體，主要有以下幾大類：1.酵母質(zhì)粒載體 酵母質(zhì)粒載體都是利用其2?m質(zhì)粒與細菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建而成的，主要有以下三種(圖10-5

24、)：圖10-5 酵母質(zhì)粒載體（1）附加體質(zhì)粒（episomal plasmid）該質(zhì)粒載體含有來自細菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點并攜帶作為大腸桿菌選擇標記的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）。此外還有來自酵母2m m質(zhì)粒的復(fù)制起點以及一個作為酵母選擇標記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），這種質(zhì)粒既可在大腸桿菌中也可在酵母細胞中復(fù)制，當重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細胞中可進行自主復(fù)制，且具有較高拷貝數(shù)。（2）復(fù)制質(zhì)粒（replicating plasmid）該質(zhì)粒含有來自細菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點和作為大腸桿菌選擇標記的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）。還有來自酵母染色體

25、的自主復(fù)制序列（ARS），以及作為酵母選擇標記的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細胞中復(fù)制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。（3）整合質(zhì)粒（integrating plasmid） 該質(zhì)粒含有來自大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點和作為大腸桿菌選擇標記的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）。以及來自酵母的URA3基因，它既可以作為酵母細胞的選擇標記，也可與酵母染色體DNA進行同源重組。這種質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細胞中進行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細胞，可整合到酵母染色體上，成為染色體DNA的

26、一個片段。2.真核生物病毒載體（1）哺乳動物病毒載體 這類病毒載體具有許多突出優(yōu)點：例如動物病毒能夠有效識別宿主細胞，某些動物病毒載體能高效整合到宿主基因組中，以及高拷貝和強啟動子等，有利于真核外源基因的克隆與表達。目前利用許多哺乳動物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲病毒載體 昆蟲中的桿狀病毒的衍生物作為載體具有許多優(yōu)點，主要為高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高達100kb；其次具有高表達效率，外源DNA的表達量達到細胞蛋白質(zhì)總量的25左右，甚至更多；此外，它具有安全性，僅感染無脊椎動物，并不引起人和哺乳動物疾病。（3）植物病毒載體一些R

27、NA病毒和DNA病毒已被改造為植物基因工程載體。目前植物基因工程操作較多使用雙鏈DNA病毒載體，如花椰菜花葉病毒載體。七、 人工染色體酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC）是一類目前能容納最大外源DNA片段人工構(gòu)建的載體。它是由默里（Murray）于1983年首次構(gòu)建成功的。伯克（Burke）等于1987年用以構(gòu)建成YAC克隆庫。酵母染色體的控制系統(tǒng)主要包括三部分：著絲粒（centromere, CEN）它的作用是使染色體的附著粒與有絲分裂的紡錘絲相連，保證染色體在細胞分裂過程中正確分配到子代細胞。端粒（telomere, TEL）位于染色體兩個末端

28、，它的功能是保護染色體兩端，保證染色體的正常復(fù)制，防止染色體DNA復(fù)制過程中兩端序列的丟失。酵母自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence, ARS），其功能與酵母細胞復(fù)制有關(guān)。酵母人工染色體（圖107）除有端粒、著絲粒、自主復(fù)制序列等外，還有選擇標記基因（如TRP1和URA3等）。圖10-7 酵母人工染色體（YAC）YAC克隆外源DNA能力非常大，一個YAC可插入長達100萬堿基以上DNA片段。因此YAC既保證所插入外源基因結(jié)構(gòu)的完整性，又大大減少基因庫所要求克隆的數(shù)目。目前YAC已成為構(gòu)建高等真核生物基因庫的重要載體，并在人類基因組的研究中起著重要作用

29、。除酵母人工染色體外，現(xiàn)已構(gòu)建細菌人工染色體（BAC）更便于基因工程操作，在人類基因組研究中正被廣泛應(yīng)用。第三節(jié) 微生物與基因工程工具酶基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。例如在分離目的基因或切割載體時，需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對DNA進行準確切割。在構(gòu)建重組DNA時，需在DNA連接酶的催化下，使目的DNA片段與載體DNA進行連接。此外，重組DNA技術(shù)還需要一些其他的工具酶。值得注意的是，基因工程所用到的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化而獲得的。一、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）或簡稱為限制性酶（restrition enz

30、yme）是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。在細菌細胞內(nèi)限制性酶與DNA甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，利用限制酶降解進入細胞內(nèi)的外源DNA，同時用甲基化酶修飾細菌本身DNA，以避免被酶降解。1.限制性內(nèi)切酶的命名與分類 限制性酶的命名是根據(jù)分離出此酶的微生物學(xué)名而定的。即取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。例如EcoRI中的E表示大腸桿菌屬名第一個字母，co表示種名頭兩個字母，R表示株名，I表示該菌中第一個被分離出來的酶。如限制酶是來自

31、同一屬的細菌，而且種名的頭兩個字母完全相同，這時其中一個菌的酶命名的第三個字母可用種名的詞頭后的另一個字母代替。例如副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）的酶表示為HpaI 和HpaII；而副溶血嗜血桿菌（Haemophilus parahaemolyticus）的酶表示為HphI。根據(jù)限制酶識別和切割DNA的特點，可將限制酶分為I、II、III三種類型，I型和III型由于無切割特異性或特異性不強故不用于基因工程，II型限制酶的限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同的酶組成，僅需Mg2+作為輔助因子，切割位點位于識別位點之內(nèi)或在附近，特異性最強，用處最大，是基

32、因工程重要工具酶，通常所說的限制性核酸內(nèi)切酶，即指此類酶。2.限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 II型限制酶的識別序列通常由48個堿基對組成，他們具有二重旋轉(zhuǎn)對稱軸，這些堿基對的序列呈回文結(jié)構(gòu)（palindromic structure）。所有限制酶切割DNA后，均產(chǎn)生含5，磷酸基和3，羥基的末端。限制酶作用所產(chǎn)生的DNA片段有以下兩種形式：(1) 形成粘性末端（cohesive end）有些限制酶不在識別序列的對稱軸上切割，而是交錯切割結(jié)果形成的DNA限制片段具有粘性末端。例如HindIII切割結(jié)果形成5，單鏈突出的粘性末端；而PstI切割結(jié)果卻形成3¢ 單鏈突出的粘性末端。 （2）形成

33、平末端（blunt end）有些限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaI切割結(jié)果形成平末端。HindIII的識別序列是： HpaI的識別序列是：不同的限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA中的堿基對序列長短不同。在隨機排列的DNA序列中，識別位點序列長的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段長，相反識別位點序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。同裂酶（Isoschizomers） 有些來源不同的限制酶卻識別和切割相同的序列，這類限制酶稱為同裂酶。同裂酶產(chǎn)生同樣切割，形成同樣的末端，酶切后所得到的DNA片段經(jīng)連接后所形成重組序列，仍可能被原來的限制酶所切割。同裂酶之間的性質(zhì)有

34、所不同（如對離子強度、反應(yīng)溫度以及對甲基化堿基的敏感性等方面可能有所差別）。同尾酶(Isocaudomers) 有些來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，不能被原來的限制酶所識別和切割。EcoRI 和MunI屬于同尾酶。MunI的識別序列是： EcoRI的識別序列和切割位點：表10-2介紹一些常用限制酶的識別序列及其產(chǎn)生菌。表10-2 若干常用限制酶的識別序列及其產(chǎn)生菌限制酶名稱 識別序列 產(chǎn)生菌 BamH I GGATCC 淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliuifa

35、ciens H） EcoR I GAATTC 大腸桿菌（Eschericha coli Rr13） Hind III AAGCTT 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae Rd） Kpn I GGTACC 肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae OK8） Pst I CTGCAG 普羅威登斯菌屬（Providencia stuartii 164） Sma I CCCGGG 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens sb） Xba I TCTAGA 黃單胞菌屬（Xanthomonas badrii） Sal I GTCGAC 白色鏈霉菌（Stre

36、ptomyces albus G） Sph I GCATGC 暗色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces phaeochromogenes） Nco I CCATGG 珊瑚色諾卡代菌（Nocardia corallina） 二、DNA連接酶（DNA ligase）DNA連接酶與限制性內(nèi)切酶一樣，也是由微生物產(chǎn)生。主要來自T4噬菌體和大腸桿菌，也是重組DNA技術(shù)中具有頭等重要的工具酶，重組DNA技術(shù)核心步驟是在體外利用DNA連接酶將目的基因和載體共價連接構(gòu)成重組DNA分子。目前常用的三種體外DNA連接方法為： 用T4或E.coli DNA連接酶可連接具有互補粘性末端的DNA片段； 用T4 DNA連

37、接酶連接具有平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再行連接。DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5,端磷酸與3,端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉，也能催化兩個雙鏈DNA片段進行連接。DNA連接酶主要有兩種：一種是T4 DNA連接酶，另一種是大腸桿菌DNA連接酶。T4 DNA連接酶由一條多肽鏈組成，分子量為6800，通常催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率為高。催化反應(yīng)需要Mg2+和ATP，ATP作為反應(yīng)的能量來源。T4 DNA連接酶在基因工程操作中被廣泛應(yīng)用。大腸桿菌DNA連接酶的分子量為7500，連接反應(yīng)的能量

38、來源是NAD，此酶催化DNA連接反應(yīng)與T4 DNA連接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端連接。除上述二種工具酶以外，還有其它重要的工具酶也是來自微生物，如DNA聚合酶I（DNA ploymerase I）、Klenow聚合酶，以及逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）等。第四節(jié)微生物作為克隆載體的宿主為了保證外源基因在細胞中的大量擴增和表達，選擇合適的克隆載體宿主就成為基因工程重要問題之一。一、宿主的基本要求與性質(zhì) 對于克隆基因而講，一個理想宿主的基本要求是：能夠高效吸收外源DNA；具有使外源DNA進行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；不具有限制修飾系統(tǒng)（hsd system），故不會使導(dǎo)

39、入宿主細胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；不具有DNA重組系統(tǒng)，常用重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；便于進行基因操作和篩選；具有安全性。宿主細胞應(yīng)該對人、畜、農(nóng)作物無害或無致病性等。某些工程微生物，如原核生物的大腸桿菌及真核生物的釀酒酵母，由于他們具有一些突出優(yōu)點如生長迅速、極易培養(yǎng)、能在廉價培養(yǎng)基中生長，其遺傳學(xué)及分子生物學(xué)背景十分清楚等，因此他們已成為當前基因工程被廣泛應(yīng)用的重要克隆載體宿主。二、原核生物宿主 在選擇原核微生物作為克隆載體宿主時，還應(yīng)考慮下列一些問題：首先應(yīng)根據(jù)克隆載體性質(zhì)以及它們導(dǎo)入細胞的方式選擇相應(yīng)的宿主細胞。例如當選

40、擇質(zhì)粒DNA作為載體并通過轉(zhuǎn)化方式進入細胞，最好選擇易于形成感受態(tài)細胞的細菌作為宿主，以利于宿主細胞有效吸收外源DNA；又如若選擇經(jīng)體外包裝的l 噬菌體載體或柯斯質(zhì)粒作為克隆載體，并以感染方式進入細胞，則應(yīng)選擇l 的敏感宿主(E.coli k12菌株)作為克隆載體宿主；當用M13衍生物作為克隆載體，則應(yīng)選擇含有F因子的雄性大腸桿菌作為宿主。其次為了便于陽性克隆的篩選，作為克隆宿主的基因型應(yīng)與載體基因相對應(yīng)。例如若載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，則相應(yīng)宿主應(yīng)該是對氨芐青霉素敏感細菌；若載體攜帶-半乳糖苷酶-肽的編碼序列，那么應(yīng)選擇該基因N端部分編碼序列缺失的突變株(Lac ZM15)作為宿主；最后為

41、了安全目的，需嚴格限制載體的宿主范圍，以達到盡量避免重組體從實驗室逃逸出去。例如構(gòu)建的載體中某一重要基因編碼序列發(fā)生琥珀突變，這時必需選擇具有強琥珀突變抑制基因的宿主，重組載體離開該宿主即無法存在。目前幾乎所有的有關(guān)重組DNA的研究工作均利用大腸桿菌作為克隆基因的宿主，但是存在一些不利之處。首先由于它是條件致病菌，故存在潛在的致病性，即使非致病的菌株仍能產(chǎn)生內(nèi)毒素，有可能污染表達產(chǎn)物。再有，外源基因的表達產(chǎn)物，易被蛋白水解酶降解或不能正確加工折疊。目前上述多數(shù)問題已有辦法加以解決。其他細菌，如枯草芽孢桿菌，也已發(fā)展成為克隆載體的宿主。它不存在潛在致病性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，可將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，

42、并且已有合適的質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)化。但是枯草芽孢桿菌作為克隆載體也存在不足之處是，它的質(zhì)粒往往不穩(wěn)定，經(jīng)多次傳代后，很難保持質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，外源DNA不能很好保留在細胞內(nèi)甚至發(fā)生突然丟失。因此，使枯草芽孢桿菌作為克隆宿主的應(yīng)用受到一定的限制。三、真核生物宿主利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個重要意義。第一它促進了對真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)控的研究；第二它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。這是由于對其遺傳學(xué)有較深入的了解；其基因的表達調(diào)控以及蛋白質(zhì)的翻譯后加工比較接近高等真核生物；此外它具有較高的安全性，用它表達生物藥物時，不需進行大量宿主安全試驗。目前已

43、構(gòu)建了一系列酵母質(zhì)粒載體及酵母人工染色體。通過轉(zhuǎn)化，可將大片段的外源DNA導(dǎo)入酵母細胞，并得到正確的克隆和表達。它對于高等真核生物基因組及其轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)研究提供了一個良好基礎(chǔ)。利用哺乳動物細胞進行基因克隆極為重要，有關(guān)人類遺傳學(xué)、腫瘤、感染性疾病和生理學(xué)的許多研究均賴以進行。但是哺乳動物細胞作為宿主不利之處是，若要進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)，則費用過于昂貴和難于操作，同時克隆基因的表達水平也常常是極低的?，F(xiàn)在已開發(fā)昆蟲細胞系作為一種昆蟲DNA病毒（桿狀病毒）載體的克隆宿主，較易進行大規(guī)模的細胞培養(yǎng)。四、外源DNA導(dǎo)入宿主細胞將外源DNA導(dǎo)入宿主細胞是分子克隆關(guān)鍵步驟之一。其導(dǎo)入方式是多種多樣的：1.

44、 外源DNA導(dǎo)入原核細胞 外源DNA可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染以及感染等方式被導(dǎo)入原核細胞(1) 轉(zhuǎn)化或感染 如果外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細胞；如果外源DNA被構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進入宿主細胞。無論轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染都需用氯化鈣處理宿主細胞,使細胞變得易于吸收外源DNA，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。大腸桿菌轉(zhuǎn)化程序：一般先用一定濃度冰冷的CaCl2溶液處理對數(shù)期的大腸桿菌細胞，然后加入外源DNA并短暫給予42熱休克處理約90s，使感受態(tài)細胞有效吸收外源DNA。一般轉(zhuǎn)化效率可達到每微克DNA轉(zhuǎn)化107108個細胞。(2) 噬菌體的體外包裝與感染 如果外源

45、DNA被包裝成噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機制導(dǎo)入宿主細胞。噬菌體DNA體外包裝技術(shù)是貝克勒(Beckler)和戈爾德(Gold)于1975年最先建立的。體外包裝是將重組DNA分子與的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，從而組裝成完整具有感染力的噬菌體粒子。體外包裝的噬菌體用以感染宿主細胞，每微克DNA可產(chǎn)生109的噬菌斑。而如果僅用重組DNA分子通過轉(zhuǎn)染進入大腸桿菌的感受態(tài)細胞。則每微克DNA僅能產(chǎn)生104105的噬菌斑，說明感染效率比轉(zhuǎn)染效率要高出104105倍，從而大大提高基因文庫的庫容量。2. 外源DNA導(dǎo)入真核細胞 外源DNA導(dǎo)入真核細胞方法可因真核細胞種類不同而有所不同(1) 外源D

46、NA導(dǎo)入酵母細胞 一般利用蝸牛酶除去酵母細胞壁形成原生質(zhì)體，再用CaCl2和聚乙二醇處理，重組DNA以轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母細胞的原生質(zhì)體，最后將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基的平板中培養(yǎng)，使原生質(zhì)體再生出細胞壁形成完整酵母細胞。(2) 外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞 其中最簡便的是微量注射法和電穿孔法。由于有些動物細胞體積較大，如受精卵用微量注射器可將外源DNA注入細胞內(nèi)。電穿孔(electroporation)法是把宿主細胞與外源DNA混合并置于電擊槽中。在高壓電脈沖作用下，使細胞膜瞬時擊穿出現(xiàn)微孔，外源DNA通過微孔進入細胞。電穿孔法十分成功用于哺乳動物細胞和植物細胞，而且也可用于通常不能進行轉(zhuǎn)化

47、的細菌。大腸桿菌應(yīng)用電穿孔法也可提高轉(zhuǎn)化率。此外還有磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、聚陽離子轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法、脂質(zhì)體法等。(3) 外源DNA導(dǎo)入植物細胞 除了通過微量注射法及電穿孔法可將外源DNA導(dǎo)入植物細胞外。還有兩種方法，一種是將含有重組Ti質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片共培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法），多數(shù)雙子葉植物轉(zhuǎn)化常用此法；另一種是基因槍法或稱微彈槍（particle guan）法，利用微彈把表面吸附有外源DNA的金屬微粒高速射進植物的細胞或組織，可直接將外源基因?qū)胗酌?，此法簡便、有效。故頗受歡迎和被廣為應(yīng)用。五、基因文庫與cDNA文庫的構(gòu)

48、建 利用重組DNA技術(shù)，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫(genomic library)或cDNA文庫(cDNA library)之中，就好像將文獻資料貯存于圖書庫一樣。以供長期貯存和隨時釣取克隆基因使用。1. 基因文庫的構(gòu)建由于高等生物染色體基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子龐大，而單個基因卻只占染色體DNA的很小部分。若要從巨大染色體基因組中分離某一目的基因，通常需經(jīng)過兩個步驟：首先構(gòu)建一個基因文庫，然后根據(jù)目的基因的性質(zhì)或序列從基因文庫中篩選出來。所謂基因文庫是指生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基

49、因組中某一特定的DNA片段。一個理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。基因文庫構(gòu)建的簡單步驟（圖10-7）：從組織或細胞提取基因組DNA。用限制性酶部分水解或機械剪切成適當長度的DNA片段，經(jīng)分級分離選出一定大小合適克隆的DNA片段。選擇容載量較大的克隆載體，通常采用l 噬菌體或柯斯質(zhì)粒載體，在適當位點將載體切開。將基因組DNA片段與載體進行體外連接。重組體DNA直接轉(zhuǎn)化細菌或用體外包裝的重組l 噬菌體顆粒感染敏感細菌細胞。最后得到攜帶重組DNA的細菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫。圖10-7 基因文庫構(gòu)建示意圖 2. cDNA文庫構(gòu)建所謂cDNA文

50、庫是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫中的每一個克隆只含一種mRNA信息。如上所述由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫的庫容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個事實，即細胞中的mRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有15%左右基因被表達），因而若由mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，那么所構(gòu)建的cDNA文庫的庫容量相應(yīng)比基因文庫小。構(gòu)建cDNA文庫的主要步驟（圖10-8）：從生物體或細胞中提取mRNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚(dT)或隨機寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈。利用DNA聚合酶I，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條

51、鏈。常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物；或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機引物，即可合成第二條鏈。cDNA與載體的體外連接。噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于cDNA不含基因的啟動子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。cDNA文庫對克隆和表達真核生物基因更加重要。因為真核生物的基因含有內(nèi)含子，在原核生物細胞中不能表達，但篩選到的cDNA克隆只要附上原核生物的調(diào)節(jié)和控制序列，就能在原核細胞內(nèi)表達。此外，cDNA還代表了基因組表達的遺傳信息。圖10-8 cDNA文庫構(gòu)建示意圖六、重組體的篩選與鑒定在構(gòu)建文庫之后，就需要從眾多

52、的克隆中，篩選出含有目的基因的重組體，并鑒定其正確性。概括起來通常有三類鑒定方法，一是重組體表型特徵的鑒定。二是重組DNA分子結(jié)構(gòu)特徵的鑒定。三是外源基因表達產(chǎn)物的鑒定。1. 重組體表型特征的鑒定(1) 抗生素平板法 如果外源DNA片段插入載體的位點位于抗生素抗性基因之外，將轉(zhuǎn)化后的重組體細胞置于含有該抗生素的培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，仍可長出菌落。此外，還有一些自身環(huán)化的載體和未被酶解的載體，他們的轉(zhuǎn)化細胞也能在含該抗生素平板上生長并形成菌落，而只有作為對照的受體細胞不能生長。此法缺點是假陽性率高。(2) 插入失活法 見第二節(jié)圖10-3。(3) 插入表達法 在某些載體的標記基因前面連接一段負控制

53、序列，當外源DNA片段插入該負控制序列中，使負控制序列失活，因而位于下游的標記基因因解除阻遏而得到表達。例如質(zhì)粒pTR262有一個負調(diào)控的cI基因，當外源DNA片段插入cI基因中的BcII或Hind III位點，造成cI基因失活，位于cI基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表達，轉(zhuǎn)化后的重組體細胞，在含有四環(huán)素的平板中可形成菌落；而未被酶解的質(zhì)粒，自身環(huán)化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細胞及未轉(zhuǎn)化受體細胞均不能形成菌落。(4) -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法 在某些載體如M13噬菌體載體，pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列，它們的載體上都攜帶lac z'基因一段序列，它編碼-半乳糖苷酶的肽，而宿主細

54、胞為lac zM15的突變株。當將上述載體的轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因內(nèi)互補作用，產(chǎn)生有生物活性的-半乳糖苷酶，把培養(yǎng)基中的無色X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4氯-靛藍，使菌落呈藍色。若將外源DNA插入到載體上lac z¢ 序列中，使-肽基因失活，失去互補作用，將重組體轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)在含有X-gal-IPTG平板上，菌落無色。利用-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)即可挑選出含有外源DNA重組體的陽性克隆。2. 重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定(1) 菌落（或噬菌斑）原位雜交(in situ hybridization) 將轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當形成菌落或噬菌斑

55、后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出DNA。再用堿處理，使DNA變性，經(jīng)烘烤將變性DNA固定于濾膜上。然后用放射性同位素標記的核酸探針進行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克隆。通常影印的濾膜必須有雙份，在一張濾膜上找到陽性克隆后，可在另一張濾膜的相應(yīng)位置上找到活的細菌或噬菌體克隆。此法優(yōu)點可在短時間內(nèi)從成千上萬克隆中快速篩選到陽性克隆。(2) 內(nèi)切酶圖譜鑒定 將初步篩選的陽性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA

56、，用1至2種內(nèi)切酶酶切，然后進行凝膠電泳，檢測插入DNA片段大小。(3) PCR鑒定 通過與插入片段兩側(cè)互補的引物，以重組質(zhì)粒DNA作為模板進行PCR分析，可快速測出插入DNA片段大小及鑒定其序列特異性。(4) DNA序列測定 最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的DNA進行序列測定。3. 外源基因表達產(chǎn)物的鑒定(1) 表達產(chǎn)物免疫活性測定 如果表達產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的一部分，它具有抗原性可與其特異抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。此法實驗操作極似菌落（或噬菌斑）原位雜文。將平板上的克隆轉(zhuǎn)移到濾膜上，處理濾膜使菌體裂解，釋放出蛋白質(zhì)，固定于濾膜上，加入標記抗體。如果抗體用放射性同位素標記，則免

57、疫反應(yīng)后進行自顯影；若加入的抗體用酶偶聯(lián)（酶標），那么此酶就可將無色底物水解成有色產(chǎn)物。(2) 表達產(chǎn)物生物活性檢查 可根據(jù)表達產(chǎn)物不同情況采用不同方法檢測其生物活性。若表達產(chǎn)物是一種酶，則可測定其酶活性；若所表達蛋白質(zhì)是一種酶的抑制劑，則可測定其抑制酶活性能力的大小等等。(3) 表達產(chǎn)物氨基酸序列測定測定表達產(chǎn)物“N”端氨基酸序列，對表達產(chǎn)物的鑒定具有特別重要意義。第五節(jié)表達載體的構(gòu)建基因工程的主要目的是使外源基因能在細菌、酵母或動、植物細胞中得到高效表達，以便獲得大量有益的基因表達產(chǎn)物或改變動、植物遺傳性狀。 所謂表達載體(expression vector)是指具有宿主細胞基因表達所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。也就是說，克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內(nèi)擴增；表達載體不僅使外源基因擴增，還使其表達。原核生物和真核生物的表達載體有一些共同的要求。但是原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控機制有很大不同，故需要分別采用原核生物和真核生物的調(diào)控元件來構(gòu)建。當真核生物基因在原核細胞中表達時，表達產(chǎn)物有兩種形式，一種是非融合蛋白，另一種是融合蛋白。兩種形式各有利弊，在進行基因工程時可根據(jù)具體情況進行設(shè)計。