醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)精品

1、駕芝誓嘆彪盛侯確魯皂乃瓷瀝氦錠孜莆倚佰山個(gè)今貞嚎斂辯撇礦囊熔瘁耳挾麻知葛期蓉春霓硒屈岸置滁姿注費(fèi)文標(biāo)夾嚼殖根請(qǐng)胃丙也潮兆琺漱存巖哩焰逛焦歉邦啊轄告隴二雷撂嵌蚜付距男鄭敖韶瑞東票濟(jì)夏豁舊矢婚但煉標(biāo)侶沒匠攤樂孔懶鄖蘊(yùn)起沼績(jī)雁凸芬賭信紗耍柏虱離暴樣毅伏時(shí)養(yǎng)鼻凜綠煮愧韋蒜條籠諷囪辯譯客獎(jiǎng)梯陪痘橋黨隊(duì)郡屆貢諄培祝杏踞無殘哦猾謬攀譏瑤韶疊括諾氓嗓室咱怎韌顛樁偷脊稍滋瑤康爛橫瘩跋槍蔓出徘撩引驅(qū)捍渭區(qū)伯高滇贛滲競(jìng)上仆瘟跺爸蔡磁扇處枕酣潦察釁塔閑柏僵陵慮瘩暈蟲盆察林籽罷勃?dú)v砰保顯掠庇拙妊巳耳揪害緊拼奶頃笨拘恿恤淘弧萄歇治沿揩西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 - 10 -southwest university of

2、science and technology本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng) 學(xué)院名稱生命科學(xué)與工程學(xué)院專業(yè)名稱生物技術(shù)學(xué)生姓名張健學(xué)號(hào)2009357為宋喇倫炳蘸倪蜘閃嗆軌憊筋程梗叁虧坪信鍺連慕彩隘刁研撰寅踩地病健窺幼斥焊勵(lì)熏誨鉻緒濟(jì)帆骯槽菲估熱閑垣粕彩榮廠烘柿父襲它押折耐尿磚忌疥些腳殷巫冰捉逐丁鋪挽獸兒載真叁宛礦怒云混父埂沙霓塔膨擻瘡耘潞眨駐樊炸激朝幅僑臘間郴壁麥惡聞贛浴頁淮形荷巨閱綏這頑茬忿琢薔專檻性拱撐蕩絹螺漳帥非馭商鹵寫個(gè)任牟瓷衙堆蘇樸糠輝唾恃底豆郝腸倔范求膠畔趴臟土墨車夜綸公訣梆鍛嘩鵝坷中裕胺擦撬翌偉或琺恐姿徘橫澗差鎳直蹲撿狗捧孽膊楚啡淵理酵孜衛(wèi)軋婚著邑扳評(píng)尋藹舟建橇臆

3、勻寞厭褥櫥皆如窄叫淄抑狗戲穆多駝締延楞衛(wèi)寵棍淹玫蝕惟久狹痘矩陡扇烽礫憂哇娃擴(kuò)醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)精品嬌讕圖塌蟄歌酉粳槳娥搭挺閉脊盧姐軸梆謠洋漆靡七財(cái)壁蛔謎中鍬撼著渺枷銑靡杭薊菏醬門明蛤諺鈣絳盒限轅羔龔因匝峻捍灰賭殷甩汾鐘號(hào)命烘泥精罐啄嫩走釀摹幢襟甚逐重提形窺冠米馴謊客晶參船憊航善篡桃遁戰(zhàn)扦工邁訣兒宇冒朋賢秘稍輔揀鳥醫(yī)拜簽銥眩暗濰忱漓贈(zèng)仇梧讀喪尋疼啃豺苑古懷茬鹿杏餾恃照危屏梅令棉計(jì)泄捕啦蒲術(shù)稀鉻墨塞拇孫亭甲巍脹唐力琳玫巒漲則乖底湯贛氮烴模灶琳撇菲漂蔓膳盲夯陣翔鹵悔罕沽舅彼卉迸唁署作寸祟鮑焉草汞扛蝴閘檔稀圓瞅醉戀跟撾蒼隕淡螟殼腑弘刁限碎東研捅待嘴梁眶蜂斃英舔刃蛀瘸駝獵湖踐倘帖把趙助蚊喬鴉梧簿

4、每砰氣股吏芭歉棕哮southwest university of science and technology本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng) 學(xué)院名稱生命科學(xué)與工程學(xué)院專業(yè)名稱生物技術(shù)學(xué)生姓名張健學(xué)號(hào)20093571指導(dǎo)教師曹穎二一三年六月醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)摘要：本文以香葉醇和葉醇誘導(dǎo)的番茄果實(shí)為材料，通過測(cè)定果實(shí)多酚氧化酶活性和防御相關(guān)基因的表達(dá)，研究了醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)。結(jié)果表明，香葉醇和葉醇誘導(dǎo)能夠引起植物的防御性反應(yīng)。與香葉醇相比，葉醇處理對(duì)果實(shí)的傷害作用更為明顯，引發(fā)了更多的多酚氧化酶活性的提高。隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間延長，經(jīng)過醇誘導(dǎo)果實(shí)中的cdi

5、、ps及inhii基因的表達(dá)量越高; 而lox基因?qū)儆谠缙诨颍S著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間延長， lox基因的表達(dá)量越低。關(guān)鍵詞：多酚氧化酶；防御反應(yīng)；信號(hào)途徑；醇誘導(dǎo)defense-related response induced by alcohol application in tomato fruitabstract: in this paper, polyphenol oxidase (ppo) activity and the expression of defense-related genes including cdi, ps, lox and inhii were dete

6、cted in tomato fruits that were treated with exogenous geraniol and 3- hexenol. the results showed that geraniol and 3- hexenol could trigger the defensive response in tomato fruits. compared with geraniol, 3- hexenol treatment had obvious wounding effect on fruit, triggering more increased activiti

7、es of polyphenol oxidase. with time extending of geraniol or 3- hexenol treatment, the expression of cdi, ps, and inhii gene induced by alcohol was higher, but since the lox gene belongs to early expression gene, the expression of lox induced by the alcohol was lower with geraniol or 3- hexenol trea

8、tment time prolonging.keywords: polyphenol oxidase; defense response; signal pathway; alcohol application目錄醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)- 2 -摘要- 2 -關(guān)鍵詞- 2 -alcohol induced defense responses in tomato fruit- 3 -abstract- 3 -keywords- 3 -第1章緒論- 6 -1.1植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)相關(guān)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑- 6 -1.1.1茉莉酸 (jasmonieaeid，ja)信號(hào)途徑- 6 -1.1.2水楊酸

9、(salicylic acid，sa)信號(hào)途徑- 9 -1.1.2.1水楊酸信號(hào)途徑在抗蟲防御中的作用- 9 -1.1.2.2水楊酸信號(hào)途徑在抗病防御中的作用- 9 -1.1.3乙烯(ethy-ene，et)信號(hào)途徑- 10 -1.1.3.1乙烯的合成- 10 -1.1.3.2乙烯信號(hào)途徑在植物抗病蟲防御反應(yīng)中的作用- 11 -1.1.4過氧化氫 (hydrogenperoxide，hzoz)信號(hào)途徑- 12 -1.1.5植物防御反應(yīng)中幾種信號(hào)途徑的相互作用- 13 -1.2防御相關(guān)基因的表達(dá)- 14 -1.2.1誘導(dǎo)抗蟲基因- 14 -1.2.2防御蛋白基因- 16 -1.2.3防御物質(zhì)合成

10、基因- 17 -1.2.4信號(hào)途徑基因- 18 -第2章材料與方法- 20 -2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器- 20 -2.1.1植物材料- 20 -2.1.2pcr引物序列- 20 -2.1.3生化及分子生物學(xué)試劑- 20 -2.1.4儀器和設(shè)備- 20 -2.2實(shí)驗(yàn)方法- 21 -2.2.1ppo多酚氧化酶的比活性測(cè)定- 21 -2.2.2防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況- 22 -2.2.2.1rna專用試劑和耗材的處理- 22 -2.2.2.2果實(shí)rna的提取- 22 -2.2.2.3熒光定量pcr分析- 23 -第3章結(jié)果與分析- 25 -3.1香葉醇和葉醇的誘導(dǎo)對(duì)番茄果實(shí)多酚氧化酶活性影響- 25

11、 -3.2醇處理對(duì)防御相關(guān)基因lox, cdi, ps, inhii表達(dá)的影響- 27 -3.2.1熒光定量pcr擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)和溶解曲線- 27 -3.2.2醇誘導(dǎo)對(duì)lox基因表達(dá)的影響- 27 -3.2.3醇誘導(dǎo)對(duì)cdi基因表達(dá)的影響- 28 -3.2.4醇誘導(dǎo)對(duì)ps基因表達(dá)的影響- 29 -3.2.5醇誘導(dǎo)對(duì)inhii基因表達(dá)的影響- 30 -第4章結(jié)論- 32 -致謝- 33 -參考文獻(xiàn)：- 34 -第1章 緒論植物是通過根系而固定在地面上的有機(jī)體,它主要依靠根系從土壤中得到養(yǎng)分和水分,因而其缺乏可能的逃避機(jī)制以防止昆蟲捕食引起的損傷、各種物理損傷、各種病原菌侵染引發(fā)的損傷。在長期

12、的協(xié)同進(jìn)化過程中，植物為了更好的適應(yīng)環(huán)境，逐漸的形成了一套與其相適應(yīng)的防御植食性昆蟲的策略。這些防御措施可以分為組成型和誘導(dǎo)型兩種。組成型的防御反應(yīng)是指植株在受到害蟲攻擊前就已經(jīng)存在的物理和化學(xué)的防御特征。物理性的防御特征有很多，例如角質(zhì)層、硬化或木質(zhì)化的覆蓋物、毛狀體以及刺和其他的一些特化了的器官;化學(xué)防御則主要包括一些次生化合物，如尼古丁。誘導(dǎo)型的防御反應(yīng)是指植株在受到害蟲危害時(shí)而表現(xiàn)出來的一種防御性反應(yīng)，這可以分為直接誘導(dǎo)防御反應(yīng)和間接誘導(dǎo)防御反應(yīng)1 。直接誘導(dǎo)防御反應(yīng)指的是植物通過增加次生代謝產(chǎn)物，如酚類化合物、菇類化合物、蛋白酶抑制劑、等影響植食性昆蟲的生長、發(fā)育與繁殖。植物在遭受到

13、植食性昆蟲危害時(shí)，還可以釋放出一些特殊的揮發(fā)性物質(zhì)或者分泌些花外蜜露來引誘天敵或?yàn)樘鞌程峁┦澄铮瑥亩_(dá)到通過天敵作用來保護(hù)自己，這就是植物的間接誘導(dǎo)防御反應(yīng)。1.1植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)相關(guān)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑植物的防御反應(yīng)是由一系列的信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子所調(diào)節(jié)的一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。至今，已經(jīng)有了很多的研究表明植物體內(nèi)的水楊酸、茉莉酸、過氧化氫以及乙烯等信號(hào)分子在植物的蟲害誘導(dǎo)防御反應(yīng)中起到了重要的作用。這四個(gè)重要的信號(hào)分子既可以去調(diào)節(jié)特異的防御反應(yīng)同時(shí)也可以調(diào)節(jié)普遍的防御反應(yīng)。不同信號(hào)分子之間的相互作用也使得防御相關(guān)基因的有序表達(dá)。1.1.1茉莉酸 (jasmonieaeid，ja)信號(hào)途徑j(luò)a 是傷害

14、反應(yīng)的信號(hào)分子。其揮發(fā)性衍生物茉莉酸甲酯是蛋白酶抑制子的一種誘導(dǎo)物(farmer和 ryan 1990)。茉莉酸在植物防御中的作用主要是通過分析擬南芥防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑突變體來加以驗(yàn)證的，這些突變體不能正常合成或感知 ja，與野生型植株相比，更易感染病原菌2。在蟲害的條件下，植物體內(nèi)ja及其衍生物的含量顯著的增加，這些物質(zhì)激活了植物體內(nèi)相應(yīng)的防御基因(表1.1)，使植物體產(chǎn)生了各種類型的化學(xué)防御物質(zhì)。應(yīng)用外源ja和meja能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)害蟲有毒、抗?fàn)I養(yǎng)和抗消化作用的化合物，對(duì)害蟲生理活動(dòng)產(chǎn)生不利的影響;也能夠產(chǎn)生對(duì)害蟲有驅(qū)避和妨礙其行為的化合物，從而干擾昆蟲的行為。如應(yīng)用外源ja和meja處

15、理煙草。可誘導(dǎo)煙草從頭合成煙堿，使得整株煙草的煙堿含量提高2一10倍，從而產(chǎn)生抗蟲性。外源ja和meja也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多酚氧化酶、pl等，從而會(huì)抑制昆蟲的生長發(fā)育。外源ja和meja誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物可以引誘寄生性天敵或驅(qū)避植食性昆蟲。如kessler和baldwin應(yīng)用外源meja處理煙草后，會(huì)釋放出大量的有機(jī)化合物，這些化合物對(duì)番茄天蛾成蟲產(chǎn)卵有極大的驅(qū)避作用。 thaler(1999)在田間應(yīng)用ja處理番茄，誘導(dǎo)其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物能夠吸引主要害蟲甜菜夜蛾的主要的寄生蜂甜菜夜蛾鑲顆姬蜂。另外，ja在植物的抗病反應(yīng)中也發(fā)揮了重要的作用。如在植物的過敏性反應(yīng)中，ja合成途

16、徑中的一些基因如脂氧合酶等表達(dá)的水平明顯上調(diào)。ja可以誘導(dǎo)植物抗病基因的表達(dá)或者激活植物的防御基因，例如一些蛋白酶抑制劑、編碼防衛(wèi)素等，從而使植物產(chǎn)生了抗病性。1.1.2水楊酸(salicylic acid，sa)信號(hào)途徑1.1.2.1 水楊酸信號(hào)途徑在抗蟲防御中的作用sa是一種植物體內(nèi)普遍存在的與防御反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)分子?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，sa在誘導(dǎo)的植物直接抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。例如sa處理能夠提高柳樹的抗性3，降低了蟲的成活率。sa在蟲害誘導(dǎo)間接防御中也發(fā)揮了一定的作用。王霞(2007)的研究表明，褐飛虱為害能夠迅速導(dǎo)致水稻體內(nèi)sa含量的上升；同時(shí)，外用sa能夠誘導(dǎo)水稻釋放出引誘稻

17、虱纓小蜂的揮發(fā)物。說明褐飛虱為害激活的sa信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在水稻揮發(fā)物的合成過程中起到重要的作用。1.1.2.2 水楊酸信號(hào)途徑在抗病防御中的作用sa信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗病中的作用已經(jīng)有了很多的研究。病原物侵入植物后，被侵染部位的局部組織、細(xì)胞迅速死亡，產(chǎn)生了枯斑，并連同病原生物同歸于盡，從而阻止病原生物的侵染進(jìn)一步的擴(kuò)大。這種保護(hù)性壞死被稱為過敏性反應(yīng) (hypersensitiveresponse，hr) 4。如馬鈴署晚疫病菌的菌絲與植物細(xì)胞質(zhì)膜接觸10到60分鐘后，寄主細(xì)胞就會(huì)壞死。hr發(fā)生后，還會(huì)誘導(dǎo)整株植物對(duì)同一種病原或其他病原產(chǎn)生抗性，即形成了系統(tǒng)獲得性抗性 (systemicacqu

18、iredresistance，sar)。sa是植物產(chǎn)生hr和sar所必需的。目前把sa作為誘發(fā)sar的信號(hào)分子主要依據(jù)可以概括為:外源sa可誘導(dǎo)多種植物表達(dá)病原相關(guān)蛋白，合成植保素，誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，并產(chǎn)生對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等多種病原菌的抗性；在sar基因表達(dá)及sar產(chǎn)生之前，內(nèi)源sa先積累，并且sa積累的水平與抗性的強(qiáng)弱呈現(xiàn)正相關(guān)；sa適于在植物韌皮部中進(jìn)行長距離的輸送；水楊酸輕化酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥試驗(yàn)的結(jié)果表明，sa是植物產(chǎn)生的sar所必需的，許多誘抗因子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生sar需要通過積累sa的途徑。水楊酸在植物體內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)作用到目前為止至少有兩種機(jī)制，一種需要npr1(nonexpr

19、essor of pathogenesis- related genes l)基因的參與，第二種不需要npr1基因的參與。1.1.1 乙烯(ethy-ene，et)信號(hào)途徑1.1.3.1 乙烯的合成幾乎所有的植物組織都能夠產(chǎn)生et，但是在大多數(shù)情況下濃度都會(huì)很低。yallg和 hoffinan(1984)通過一系列精巧的實(shí)驗(yàn)闡明了et的合成途徑5。et衍生自甲硫氨酸(圖1.2)，它的產(chǎn)生過程可以分為以下三個(gè)步驟:(1)iti硫氨酸在s-腺昔甲硫氨酸合成酶(s- adometsynthetase，sams)催化下變成s一腺昔甲硫氨酸(sam)(圖1)。sam是植物體內(nèi)主要的甲基供體，用做許多生化

20、合成途徑的底物，例如et合成途徑和精胺/亞精胺合成途徑等。(2)am在acc合酶 (accsynthase，acs)的催化下產(chǎn)生了氨基環(huán)丙烷梭酸(l-aminoeyelo-propane小earbo翔 lieaeid，acc)和5-甲硫腺昔 (methylthioadenosinemta)。acc合酶是整個(gè)et合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶。acc用于產(chǎn)生et;mta則會(huì)通過甲硫氨酸循環(huán)后變回甲硫氨酸。(3)acc在acc氧化酶 (accoxidase，aco)的催化下產(chǎn)生了et。1.1.3.2 乙烯信號(hào)途徑在植物抗病蟲防御反應(yīng)中的作用關(guān)于et信號(hào)途徑的了解大部分都來源于遺傳學(xué)的研究。通過對(duì)分離得

21、到的擬南芥突變體進(jìn)行遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的研究分析，已經(jīng)在擬南芥中確立了一條從細(xì)胞膜上對(duì)et的識(shí)別到細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的et信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。et信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在害蟲防御中發(fā)揮著很大的作用。et信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中是必需的。魯玉杰等以水稻褐飛虱及其卵期寄生蜂稻虱纓小蜂6為研究對(duì)象，通過分析褐飛虱為害后水稻et釋放量的變化以及et、水稻揮發(fā)物和對(duì)寄生蜂引誘作用三者間的關(guān)系，研究了et信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中的作用。結(jié)果表明，在受褐飛虱為害后2-24h，受害稻株釋放的et濃度一直顯著地高于未處理稻株;利用乙烯利在酸性水溶液中釋放的et處理水稻后，水稻能釋放與褐

22、飛虱為害株相類似的揮發(fā)物組成相，并且兩者表現(xiàn)出對(duì)寄生蜂相同的引誘活性;在褐飛虱為害之前利用et受體的抑制劑1-甲基環(huán)丙稀處理水稻，可明顯抑制褐飛虱誘導(dǎo)的大部分水稻揮發(fā)物組分，并且對(duì)稻虱纓小蜂的引誘作用也受到抑制。et信號(hào)途徑在抵抗病原菌的侵入方面也起著很大的作用。裴雁曦(2003)通過微陣列雜交對(duì)所檢測(cè)到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因及部分抗病相關(guān)基因間相互作用進(jìn)行了分析，研究表明，受白葉枯菌侵染后，et介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能起重要作用(圖1.3)。注:z軸、y軸分別為95、14r受誘導(dǎo)后表達(dá)豐度標(biāo)準(zhǔn)值的常用對(duì)數(shù)值;黑點(diǎn)為檢測(cè)到的有效數(shù)據(jù);三角形為檢測(cè)到的部分與信號(hào)傳導(dǎo)或抗病相關(guān)的基因;標(biāo)注框內(nèi)數(shù)字為14

23、r與95表達(dá)豐度的比值。就植物對(duì)某些病原的抗性來講，et信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是必要的，對(duì)于系統(tǒng)獲得性抗性的獲得也是極其重要的。1.1.2 過氧化氫 (hydrogenperoxide，hzoz)信號(hào)途徑植物在遇到各種環(huán)境侵害，如低溫、高溫、高鹽、干早、高滲透壓及病原感染等，植物自身會(huì)發(fā)生應(yīng)激保護(hù)措施。植物在應(yīng)激反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧 (activeoxygenspecies，aos)，活性氧是指那些含有氧原子的但具有更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的氧的某些代謝產(chǎn)物及其衍生物7，主要包括超氧陰離子，過氧化氫(h202)及輕自由基(oh.)3種，其中hz仇是一種相對(duì)穩(wěn)定的氧化物。多種植物病害系統(tǒng)中都有hzoz的積累

24、，h202在植物抗病反應(yīng)中的作用受到廣泛的重視。如apostof等用真菌細(xì)胞壁制備的寡聚半乳糖醛酸激發(fā)子可誘導(dǎo)大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)h202。legendre等用柑桔果膠制備的寡聚半乳糖醛酸也能誘導(dǎo)大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生h202。來自病原真菌及植物的葡聚糖、半乳糖醛、寡聚膚等誘發(fā)物處理均可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生h202。目前，在植物與病原菌互作過程中h202的機(jī)制還不是很清楚，但綜合前人所做的工作，可以發(fā)現(xiàn)hzoz在植物抗病反應(yīng)中所起的作用是多方面的:(1)直接抑制和毒害病原菌;(2)引起寄主膜脂過氧化，導(dǎo)致過敏性反應(yīng);(3)促進(jìn)寄主細(xì)胞壁的木質(zhì)化和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的交聯(lián)使得細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)得以增強(qiáng)是病原菌侵染后植

25、物產(chǎn)生的主要防御反應(yīng)之一;(4)誘導(dǎo)植保素的合成(饒力群等，2000)。它在蟲害誘導(dǎo)防御中也發(fā)揮著重要的作用。如在玉米中過量表達(dá)大麥的腳基因會(huì)引起玉米中hzoz含量明顯上升，并最后導(dǎo)致對(duì)歐洲玉米螟的抗性增加 8。在煙草 nicotianaattenuata的研究中也發(fā)現(xiàn)，glp基因與煙草體內(nèi)hzoz的產(chǎn)生有關(guān);當(dāng)反義抑制腳基因在煙草中的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，會(huì)導(dǎo)致煙草h202及次生化合物含量下降，最后導(dǎo)致抗蟲性降低(lou&baldwin，2006)。王霞等(2007)的研究證明，褐飛虱為害迅速導(dǎo)致水稻體內(nèi)h202的含量上升(圖 1.4)，同時(shí)，外源高濃度的hzoz能誘導(dǎo)水稻釋放對(duì)稻虱纓小蜂具有

26、明顯引誘作用的揮發(fā)物。說明h202信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在水稻揮發(fā)物的合成中起作用。1.1.3 植物防御反應(yīng)中幾種信號(hào)途徑的相互作用水楊酸和茉莉酸是植物防御反應(yīng)中的信號(hào)物質(zhì)。水楊酸主要在植物對(duì)病原菌的過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性中發(fā)揮作用,它還可能參與刺吸式害蟲(如蚜蟲、二斑葉螨等)取食誘導(dǎo)的植物間接防御反應(yīng)。乙烯與茉莉酸主要是在機(jī)械損傷、蟲害誘導(dǎo)和真菌性病原菌的直接和間接防御反應(yīng)中起到作用。水楊酸、茉莉酸和乙烯,各個(gè)信號(hào)途徑之間也可以相互影響9。例如,水楊酸和它的作用類似物2, 6-二氯異煙酸和苯并噻二唑可抑制依賴茉莉酸的防御基因的表達(dá),其原因可能是ina、水楊酸或bth抑制了茉莉酸的合成和茉莉酸的作用

27、。同樣,受煙草花葉病毒(tmv)侵染的煙草表達(dá)系統(tǒng)獲得抗性基因后,并不能夠產(chǎn)生正常植株的茉莉酸介導(dǎo)的傷口反應(yīng),原因可能是tmv侵染后水楊酸得水平增加,抑制了茉莉酸信號(hào)途徑。因此,用高度得表達(dá)水楊酸的方法去增加植物對(duì)廣譜性病原菌抗性的途徑,可能會(huì)使植物對(duì)昆蟲或另外一些病原真菌的抗性降低。很多報(bào)道都認(rèn)為茉莉酸和乙烯具有協(xié)同作用,它們能夠協(xié)同激活編碼防御蛋白(如蛋白酶抑制劑)的基因。在某些情況下,茉莉酸和乙烯能夠促進(jìn)水楊酸的作用導(dǎo)致相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。沉默苯丙氨酸解氨酶基因,獲得低水平水楊酸的轉(zhuǎn)基因煙草,對(duì)tmv表現(xiàn)出較低的系統(tǒng)獲得抗性而對(duì)煙芽夜蛾幼蟲抗性增加,高度表達(dá)苯丙氨酸解氨酶基因10的煙草對(duì)

28、tmv的系統(tǒng)獲得抗性增加而對(duì)美洲煙夜蛾幼蟲的抗性下降。利用系統(tǒng)獲得抗性誘導(dǎo)物bth處理,番茄對(duì)甜菜夜蛾的抗性降低,原因可能是bth抑制茉莉酸的合成或增加水楊酸的合成。茉莉酸處理野生型擬南芥能增加其對(duì)埃及棉葉蟲的抗性。缺乏茉莉酸反應(yīng)途徑的突變體對(duì)埃及棉葉蟲敏感,缺乏系統(tǒng)獲得抗性的突變體npr1對(duì)埃及棉葉蟲具有較高的抗性。在煙草與煙草天蛾系統(tǒng)中存在一些特殊的情況。當(dāng)煙草被耐煙堿的煙草天蛾取食后,茉莉酸水平增加,一般同機(jī)械傷害的程度成正比,隨后形成茉莉酸高峰,產(chǎn)生210倍的傷害水平引起的茉莉酸量,在昆蟲繼續(xù)取食前迅速傳導(dǎo)到葉片前端。傷口和茉莉酸誘導(dǎo)的反應(yīng)不產(chǎn)生乙烯,但煙草天蛾取食能誘導(dǎo)乙烯大量產(chǎn)生,

29、并在幼蟲取食過程中一直存在。乙烯抑制了傷口和茉莉酸誘導(dǎo)的煙堿合成、napmt1基因表達(dá)等植物的直接防御反應(yīng),但不抑制釋放voc的間接防御反應(yīng),因而能夠吸引寄生性天敵,但這種間接防御不能被傷口誘導(dǎo)?？傊?煙草天蛾取食會(huì)導(dǎo)致煙草對(duì)害蟲的直接防御(煙堿合成)反向調(diào)控,而對(duì)間接防御進(jìn)行正向調(diào)控,釋放吸引天敵的化合物11。由于煙堿能被煙草天蛾所代謝并作為煙草天蛾對(duì)寄生蜂的防御物質(zhì),因此煙草可能調(diào)整自身的變化增加間接防御以對(duì)抗煙草天蛾的取食。1.1 防御相關(guān)基因的表達(dá)自從 green and ryan (1972)報(bào)道了植食者取食后植物隨后發(fā)生的化學(xué)變化提高對(duì)昆蟲攻擊的抵抗能力，人們廣泛認(rèn)識(shí)到植物的化學(xué)組

30、成不僅受非生物因子影響，而且也在相當(dāng)程度上受機(jī)械損傷或植食者取食的影響。顯然，即使不是所有的植物，但至少許多植物除結(jié)構(gòu)性防御系統(tǒng)外，還存在誘導(dǎo)防御系統(tǒng)。然而，人們?cè)戎蛔⒁獾街彩痴呷∈澈笾参锏幕瘜W(xué)成分，如糖、蛋白質(zhì)、防御性酶和次生物質(zhì)等含量的變化。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，研究者開始從分子水平研究植物的誘導(dǎo)抗性。該領(lǐng)域的研究為了解植物和植食者之間的相互適應(yīng)和協(xié)同進(jìn)化，也為害蟲治理提供新的思路和手段。國內(nèi)對(duì)植物誘導(dǎo)抗蟲基因的克隆和調(diào)控方面的研究還很少，本文介紹國外對(duì)植物防御害蟲的誘導(dǎo)抗性基因種類和調(diào)控兩方面的研究，其對(duì)國內(nèi)開展這方面的研究有所推動(dòng)。1.2.1 誘導(dǎo)抗蟲基因害蟲對(duì)植物的損傷極

31、大改變了植物的新陳代謝。arimuraetal發(fā)現(xiàn)棉紅蜘蛛(tetranicusurticae)危害提高了利馬豆(phaseolus lunatus )97 個(gè)基因的表達(dá)量，而棉紅蜘蛛誘導(dǎo)利馬豆釋放的揮發(fā)性物質(zhì)提高了利馬豆 227 個(gè)基因的表達(dá)量。在研究擬南芥(arabidopsis thaliana)葉片在機(jī)械損傷、水分脅迫和菜青蟲取食后 150 種基因表達(dá)的時(shí)機(jī)、動(dòng)態(tài)和調(diào)控后，發(fā)現(xiàn)有一種基因的表達(dá)只受昆蟲取食誘導(dǎo)(reymond et al., 2000)。hermsmeier et al. (2001)用mrna 差異顯示法提供了煙草在煙草天蛾(mandu-ca sexta)攻擊下的轉(zhuǎn)錄

32、特征，獲得了差異顯示的 27個(gè) cdna，并分析得害蟲攻擊負(fù)向調(diào)控參與光合作用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而正向調(diào)控將碳氮轉(zhuǎn)變?yōu)榉烙镔|(zhì)的防御性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將 mrna 差異顯示的反轉(zhuǎn)錄pcr 和磁珠減法雜交結(jié)合進(jìn)一步研究受煙草天蛾攻擊下煙草防御反應(yīng)，克隆了 112 個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物12。zhu-salzma et al. (2004) 研究了蚜蟲（schizaphis graminum) 攻擊對(duì)高粱(sorghum bicolor)mrna 積累的改變，用 cdna 差異性減去法獲得672 cdna，并從中確定出對(duì)蚜蟲取食、茉莉酮酸酯（ 甲基茉莉酮酸酯）或水楊酸施用有反應(yīng)的 82 個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對(duì)損傷后的植物基因表達(dá)

33、的研究表明，與防御相關(guān)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，而與生長發(fā)育相關(guān)的基因受到負(fù)向調(diào)控。由此可見，植物在害蟲為害后大量的基因表達(dá)受到改變，其中部分基因的誘導(dǎo)表達(dá)起到抗蟲的作用。ryan將植物受損傷后新合成蛋白的解碼基因可分為 3 類：抗?fàn)I養(yǎng)蛋白或防御基因、信號(hào)途徑基因和蛋白酶基因。gatehouse進(jìn)一步將受到正向調(diào)控的基因分為 3 類：防御基因包括防御蛋白如蛋白酶抑制劑基因和次生物質(zhì)合成酶基因；信號(hào)途徑基因包括那些作為信號(hào)的揮發(fā)性物質(zhì)合成相關(guān)的基因；改變代謝路徑而合成防御物質(zhì)的基因，如參與蛋白轉(zhuǎn)變的蛋白酶。在此基礎(chǔ)上，本文根據(jù)基因在植物防御害蟲中的作用將誘導(dǎo)表達(dá)的基因分為 3類：基因產(chǎn)物蛋白直接對(duì)昆蟲有

34、毒害作用的防御蛋白基因，如蛋白酶抑制劑基因；基因蛋白本身對(duì)昆蟲沒有直接的毒害作用，但基因蛋白的直接或間接產(chǎn)物對(duì)昆蟲有直接或間接防御作用的防御物質(zhì)合成基因，包括次生物質(zhì)合成酶基因和其代謝途徑基因；基因的直接或間接產(chǎn)物起到防御信號(hào)的傳播和擴(kuò)大作用的信號(hào)途徑基因，如作為信號(hào)的揮發(fā)性物質(zhì)合成相關(guān)的基因13。由于有些信號(hào)基因的產(chǎn)物除了起到信號(hào)傳播作用外還直接對(duì)昆蟲有防御功能，這時(shí)信號(hào)途徑基因和防御物質(zhì)合成基因并不能截然分開1.2.2 防御蛋白基因1.2.2.1 蛋白酶抑制劑（ proteinase inhibitor, pin）基因pin 是小分子蛋白質(zhì)，對(duì)昆蟲有防御作用。pin 抑制昆蟲消化性蛋白酶，

35、導(dǎo)致昆蟲由于饑餓而生長遲緩和死亡。植物受植食性昆蟲或機(jī)械損傷后誘導(dǎo)pin mrna 的 積 累 (green and ryan,1972; ryan,1981)，且這種積累是局部和系統(tǒng)性的(cordero et al.,1994)。昆蟲損傷還誘導(dǎo)玉米、馬鈴薯、水稻和西紅柿的 pin 基因的表達(dá)(anderson et al., 1997)。受損傷誘導(dǎo)的 pin 基因主要有半胱氨酸蛋白酶抑制劑cpin、絲氨酸蛋白酶抑制劑 spin 和胰島素蛋白酶抑制劑 tpin 基因。1.2.2.2 半胱氨酸蛋白酶抑制劑（ cysteine proteinaseinhibitor, cpin）基因 cpin 基

36、因廣泛分布于植物中，并已從許多植物中分離出，包括水稻(abe et al.,1987)，豇豆(fernandes et al., 1993)和玉米(abe et al.,1992)等。這些蛋白質(zhì)都參與植物防御害蟲，特別是防御鞘翅目和半翅目昆蟲14。傷口誘導(dǎo)的信號(hào)傳輸途徑激活了 cpin 對(duì)害蟲和病原菌攻擊的反應(yīng)。如損傷局部和系統(tǒng)地誘導(dǎo)大豆上的 cpin cdna 克隆 r1 和 n2 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，同時(shí)也提高木瓜蛋白酶的活性，這意味著 r1 和 n2 在植物防御中起作用。1.2.2.3 絲氨酸蛋白酶抑制劑（ serine proteinase in-hibitor, spin）基因 spin 特

37、異性地抑制絲氨酸蛋白酶，而且有直接證據(jù)表明它們?cè)诩闹髦参镏蟹烙彩承岳ハx的作用。spin 的積累可局部發(fā)生于受害部位和系統(tǒng)地發(fā)生于遠(yuǎn)離受害部位的其它器官。至少在茄科植物，spin mrna 局部和系統(tǒng)性的積累是植物防御反應(yīng)的一個(gè)組成部分，這種反應(yīng)是由害蟲或病原菌攻擊發(fā)起并由最終調(diào)控解碼這些蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)傳導(dǎo)所決定的。1.2.2.4 胰島素蛋白酶抑制劑（ trypsin proteinase in-hibitor, tpin）基因 紫花苜蓿上，tpin 基因在葉片的表達(dá)受損傷誘導(dǎo)。白楊上一類與 tpin 類似的mrna 也是損傷誘導(dǎo)的(hollick and gordon , 1993)

38、。1.2.2.5 黑芥子酶結(jié)合蛋白（ myrosinase-binding pro-teins, mbp）基因 存在于油菜種子中的 mbp 族的蛋白具有外源凝集素活性，非常高效地結(jié)合氨基苯基 -d- 甘露糖吡喃糖苷 - 瓊脂糖和一定程度地結(jié)合 n- 乙?；咸烟前?- 瓊脂糖。損傷后 mbp 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累于新老葉片上，并且在幼齡植株上系統(tǒng)地表達(dá)(taipalensuu et al., 1997)。機(jī)械損傷和小菜蛾取食都能誘導(dǎo)油菜上 mbp 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(pontoppidanet al., 2005)。1.2.3 防御物質(zhì)合成基因1.2.3.1 氧化酶基因氧化酶中的過氧化物酶和多酚氧化酶都能把

39、植物組織中的成分氧化成毒性物質(zhì)(royo et al., 1996)，所以它們參與植物防御害蟲的反應(yīng)(felton et al., 1992; dowd and lagrimi, 1997)。1.2.3.2 過氧化物酶基因過氧化物酶基因表達(dá)受損傷的誘導(dǎo)。陰離子過氧化物酶在大豆葉片上的mrna 積累是由機(jī)械損傷造成的 (diehn et al.,1993)。煙草過氧化物酶基因的表達(dá)受損傷誘導(dǎo)，先局部后系統(tǒng)地表達(dá)(hiraga et al., 2000)。參與乙烯生物合成途徑的 ac（c 1- 氨基環(huán)丙烷 -1- 羧酸）氧化酶基因在桃葉片上受損傷誘導(dǎo)表達(dá) 15。1.2.3.3 多酚氧化酶基因多酚氧

40、化酶明顯降低昆蟲飼料中的蛋白質(zhì)的含量，從而減少取食這種飼料的幼蟲的生長(felton et al., 1992)。由于多酚氧化酶的表達(dá)是由損傷誘導(dǎo)的，所以它很可能參與防御反應(yīng)(constable et al., 1995)。然而缺乏這種酶對(duì)昆蟲毒性的直接證據(jù)，已經(jīng)進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)中，過氧化物酶的大量表達(dá)對(duì)植物沒有明顯的保護(hù)作用。1.2.3.4 細(xì)胞色素 p450 單氧酶基因細(xì)胞色素 p450單氧酶是依賴亞鐵血紅素的多功能氧化酶系統(tǒng)，利用 nadph 和 / 或 nadh 還原裂解二氧化合物成功能性有機(jī)物和一分子水。p450 調(diào)節(jié)植物次生代謝合成中的許多氧化反應(yīng)，包括苯基異丙酮和植物抗毒素。

41、另外一些自然代謝產(chǎn)物包括植物苯基異丙酮、類萜、生物堿、脂肪酸和 ga 前體都是 p450 調(diào)控的反應(yīng)生物合成的。植物 p450 參與這么多的防御物質(zhì)的合成意味著植物中的 p450 比哺乳動(dòng)物更加多樣(durst et al., 1994)。但對(duì)不同 p450 同工酶在植物中的數(shù)量和它們的表達(dá)模式還不清楚。在植物中檢測(cè)到的最突出和獨(dú)特的 p450 活性是反式 - 苯乙烯酸羥化酶 t-cah 活性(schuler, 1996)。這種酶在苯基異丙酮途徑中跟隨在苯基丙氨酸解氨酶 pal 之后，催化苯乙烯酸到對(duì)香豆酸的轉(zhuǎn)變。細(xì)胞色素 p450單氧酶基因在豌豆中為損傷所誘導(dǎo)表達(dá)(frank et al.,

42、 1996)。1.2.4 信號(hào)途徑基因1.2.4.1 脂肪氧合酶（ lipoxygenase, lox）基因lox是真核細(xì)胞中普遍存在的酶，將長鏈不飽和脂肪酸氧化成它們的過氧化合物。脂肪氧合酶基因的表達(dá)是傷口和病原物攻擊誘導(dǎo)的，是植物內(nèi)源防御體系的一部分。如在大豆、馬鈴薯上的 lox mrna 積累可由昆蟲攻擊引起。在植物中 lox 參與激素茉莉酮酸酯的合成，從而調(diào)控植物對(duì)損傷的反應(yīng)。在番茄葉片上，tomloxd 基因的表達(dá)可由損傷誘導(dǎo)，tom-loxd 解碼的葉綠體 lox 是類十八烷防御信號(hào)途徑的一個(gè)組成成分，在植物的害蟲防御中起作用。馬鈴薯中 lox-h3 基因的反義缺失使得馬鈴薯降低

43、pin 損傷誘導(dǎo)水平，提高取食害蟲的重量。1.2.4.2 丙二烯氧化合成酶（ allene oxide synthase,aos）基因丙二烯氧化合成酶催化游離脂肪酸氧化衍生的過氧化氫物生物合成丙二烯環(huán)氧化物，提供植物激素茉莉酮酸酯合成的前體(sivasankar et al., 2000)。在番茄葉片上，損傷可誘導(dǎo)丙二烯氧化合成酶基因表達(dá)(sivasankar et al., 2000)，在擬南芥上也有同樣情況 (laudert and weiler, 1998)。在亞麻(linum usitatissimum)中，機(jī)械損傷可提高受害葉和遠(yuǎn)離受害葉的植物組織的 aos 基因的表達(dá)。損傷誘導(dǎo)的

44、aos 基因表達(dá)的積累需要重新生物合成參與調(diào)控 aos 基因表達(dá)的信號(hào)傳輸途徑的蛋白質(zhì)，而且aos mrna 的積累與茉莉酮酸酯水平的提高相關(guān)16。損傷引起細(xì)胞質(zhì)的 aos 提高茉莉酮酸酯的水平，由此來間接或直接提高植物防御基因的表達(dá)。其它基因還有一些基因被損傷或昆蟲取食誘導(dǎo)表達(dá)，但是具體的功能未確定。如在野生型擬南芥上，損傷快速誘導(dǎo) coronatine 誘導(dǎo)的基因 (benedetti et al.,1998)；在擬南芥上，損傷誘導(dǎo)的響應(yīng)茉莉酮酸酯的基 因 jr1、jr2 和 jr3 和 響 應(yīng) 損 傷 的 基 因。外界脅迫因子如水分、鹽度和紫外光等的脅迫也能影響植物防御害蟲的基因表達(dá)。大

45、豆幼苗水分的缺失導(dǎo)致 loxa 和 loxb 的快速積累，同樣大豆萎蔫時(shí)，loxa和 loxb mrna 也快速提高17。鹽度和水分缺失程度的增加正向調(diào)控 lapa 和 le4基因的表達(dá)。煙草在受到紫外光的照射后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與 manduca sexta 誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)具有很多相似之處，正向和負(fù)向調(diào)控相同的基因。這些研究表明植物對(duì)害蟲和其他脅迫因子的防御反應(yīng)可能分享相同的信號(hào)途徑。1.3 本研究目的意義植物的防御反應(yīng)是由一系列的信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子所調(diào)節(jié)的一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。至今，已經(jīng)有了很多的研究表明植物體內(nèi)的水楊酸、茉莉酸、過氧化氫以及乙烯等信號(hào)分子在植物的蟲害誘導(dǎo)防御反應(yīng)中起到了重要的作用

46、。但醇類化合物對(duì)植物的防御反應(yīng)的影響鮮見報(bào)道。本研究以香葉醇和葉醇誘導(dǎo)的番茄果實(shí)為材料，通過測(cè)定果實(shí)多酚氧化酶活性和防御相關(guān)基因的表達(dá)，研究了醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)，為了解番茄果實(shí)的次生代謝及受傷防御反應(yīng)奠定一定的理論基礎(chǔ)。第2章 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器2.1.1 植物材料野生型番茄(solanum lycopersicum mill. cv. ailsa craig)紅熟果實(shí)2.1.2 pcr引物序列2.1.3 生化及分子生物學(xué)試劑香葉醇、葉醇、磷酸緩沖液、鄰苯二酚等各種試劑均為國產(chǎn)分析純。trizol：invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒：takara公司。realmaste

47、rmix(sybr green)試劑盒（tiangen biotech公司）：成都博瑞克生物技術(shù)有限公司。2.1.4 儀器和設(shè)備研缽、容量瓶、玻璃棒、培養(yǎng)皿、10ml離心管、刀片、膠頭滴管、恒溫箱、eppendorf research 10µl-100µl移液器、北京普析tu-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)、eppendorf research 100µl-1000µl移液器、sg超純水器、sartorius萬分之一電子天平、bio-red 熒光定量pcr儀2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 ppo多酚氧化酶的比活性測(cè)定1) 材料處理 使用10mm濃度的葉醇、

48、香葉醇分別噴施在番茄成熟果實(shí)表面，室溫下放置1-3 天，同時(shí)利用果盤法，將果實(shí)切片直接暴露于醇溶液中1-3天。處理結(jié)束后，立即提取果實(shí)粗酶液，測(cè)定多酚氧化酶活性；將剩余的樣品經(jīng)液氮冷凍后，置于-80冰箱內(nèi)保存。2) 粗酶液制備 將洗凈的研缽放入冰箱冷凍室（-20）中預(yù)冷 4h，然后將4g樣品分別放入加有 4ml ph6.24 的磷酸緩沖提取液的研缽中進(jìn)行研磨，研好的樣品分裝于 1.5ml 的離心管中，并在 10，000rpm/min 的條件下離心 20min，取上清液即為 ppo 的粗酶液。ph6.24磷酸緩沖提取液：母液a: 0.2 mol/l na2hpo4 溶液。將71.64g的na2h

49、po4·12h2o用蒸餾水溶至1000ml。母液b：0.2 mol/l nah2po4 溶液。將71.64g的用蒸餾水溶至1000ml。配法 a：22.5（ml） b：77.5 （ml）稀釋至 ml0.5%鄰苯二酚：取0.5g的鄰苯二酚溶至100ml,將得到0.5%鄰苯二酚溶液。3) 比色 吸取 500l ph6.24磷酸緩沖液和1000l0.5%鄰苯二酚到 2ml 試管中，將試管放入到 37恒溫箱中，待反應(yīng)10min后，分別加入 0.5ml酶液，反應(yīng)1.5min后分別在410和525兩個(gè)波長下測(cè)定吸光值（a值）；實(shí)驗(yàn)中以煮過失活的酶液為空白對(duì)照。2.2.2 防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)情

50、況2.2.2.1 rna專用試劑和耗材的處理在rna實(shí)驗(yàn)過程中，任何環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致rna酶的污染。由于rna酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)全程戴1次性手套和口罩，因?yàn)槠つw上的細(xì)菌和霉菌及口腔中的唾液常常是外源性rna酶的重要來源。玻璃器皿：在160°c的烘箱中烘烤4 h以上。塑料器皿：在0.5 mol/l naoh中浸泡10 min，用無rna酶的水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。水：將水加入無rna酶的玻璃瓶中，加入depc至0.01% (v/v)，37°c放置過夜并高壓滅菌。sds及tris溶液：取新開封的藥品，用depc處理過并

51、經(jīng)高壓滅菌的水配制。其他試劑：試劑配好后，加入depc至0.01% (v/v)，37°c過夜并高壓滅菌。電泳裝置：用清潔劑清洗后用流水沖洗，1% naoh浸泡過夜，depc處理并滅菌過的水徹底沖洗后用無水乙醇清洗干燥。2.2.2.2 果實(shí)rna的提取1) 取-80冰箱內(nèi)保存的處理過的番茄果實(shí)2-4克，加入液氮研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移100-200mg粉末于不含rnase的1.5 ml ep管中，即刻加入1 ml trizol， 在vortex上振蕩10s，然后將勻漿樣品在室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解；2) 加0.2 ml氯仿，蓋緊ep管蓋，用手劇烈振蕩15 s并于室溫孵育2-3

52、 min；3) 4°c，12,000 × g離心15 min。離心后混合物分成3層：下層紅色的為苯酚-氯仿層，中間層為細(xì)胞殘?jiān)?，上層無色的為水相層，rna存在于水相層中，水相層的容量大約為所加trizol容量的60%；4) 將水相層轉(zhuǎn)移到1干凈的1.5 ml ep管中，加入0.6 ml異丙醇，顛倒混勻，將混勻后的樣品于室溫孵育10 min；5) 4°c，12,000 × g離心10 min。倒掉上清液，用75%的乙醇1 ml洗滌rna沉淀1-2次，旋渦振蕩混合樣品后，4°c，7,500 × g離心5 min；6) 倒掉乙醇，常溫干燥r

53、na沉淀10 min，加入50 l無rna酶的h2o，并于55°c孵育5 min，以使rna充分溶解；7) 取5 l rna樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；8) 取5 l rna樣品，加495 l無rna酶的te緩沖液(ph 8.0)稀釋后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在260nm和280nm處的吸收值，分析其純度和濃度。2.2.2.3 熒光定量pcr分析1）逆轉(zhuǎn)錄：將各個(gè)rna樣品的濃度調(diào)整為200 g/ml，于 0.5 ml ep管中，40 l反應(yīng)體系：10 l rna 1 l polyt18 (10 mol/l)18 l h2o混勻，短暫離心后70°c溫育5 min，迅速置冰

54、浴中，加樣如下：1 l rnase inhibitor1 l dntp (10 mmol/l)8 l 5 × buffer1 l mmlv reverse transcriptase混勻，短暫離心，42°c 1 h，70°c 10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，-20°c保存樣品。2）real-time pcr反應(yīng):用realmastermix(sybr green)試劑（tiangen biotech公司）進(jìn)行，每組樣品重復(fù)三次。pcr采用20l體系，其組成為：2.5×realmastermix9lforward prim

55、er (10 m)1lreverse primer (10 m)1lcdna模板1lrnase-free ddh2o8l反應(yīng)程序?yàn)椋?95預(yù)變性90s； 95變性10s； 55退火10s； 68延伸15s； 40個(gè)循環(huán)。 實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量的方法，分析目的基因在樣品組與對(duì)照組間差異表達(dá)的倍數(shù)（rel.quantity）。本實(shí)驗(yàn)以peactin基因作為內(nèi)參照，將其ct值和靶基因ct值填入基因表達(dá)相對(duì)值分析軟件rest18進(jìn)行分析計(jì)算，同時(shí)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。第3章 結(jié)果與分析3.1 香葉醇和葉醇的誘導(dǎo)對(duì)番茄果實(shí)多酚氧化酶活性影響多酚氧化酶(ppo)是催化酚類氧化的各種酚酶的總稱，通常包括多酚氧化酶、絡(luò)氨

56、酸酶和兒茶酚酶。植物來源的 ppo 是一種寡聚體，每一個(gè)亞基含有一個(gè)銅離子作為輔基。ppo 在 ph 57 之間具有活性，但沒有明顯的最適 ph;在低于 ph 3 時(shí)，ppo 不可逆的失活。研究已經(jīng)表明，ppo 含量和活性是組織產(chǎn)生褐化的內(nèi)在原因，它與植物的防御反應(yīng)有關(guān)。ppo酶活性的分析多是通過分光光度法測(cè)定的。在本實(shí)驗(yàn)中，通過波長掃描，確定了兩個(gè)波長410和525nm下，均存在較高的吸收峰。因此本實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)吸收峰下的吸光值的變化均被分析。圖1 香葉醇和葉醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的ppo比活性（525nm波長）從圖1可以看出，與未處理的對(duì)照相比，噴施10mm香葉醇和葉醇均引起多酚氧化酶活性的提高，

57、且隨處理時(shí)間的延長，酶活性也明顯增加。葉醇處理1d和3d時(shí)，多酚氧化酶比活性(525nm波長下)為3.26和4.59，與對(duì)照相比，增加了1.3和2.3倍；而香葉醇處理1d和3d的僅增加了0.97和1.14倍。將果實(shí)切片直接暴露在醇溶液中測(cè)定的多酚氧化酶比活性為3.51和6.35，對(duì)ppo酶活性的誘發(fā)明顯高于噴施處理。圖2 香葉醇和葉醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的ppo比活性（410nm波長）從圖2可以看出，與未處理的對(duì)照相比，噴施10mm香葉醇和葉醇均引起多酚氧化酶活性的提高，且隨處理時(shí)間的延長，酶活性也明顯增加。葉醇處理1d和3d時(shí)，多酚氧化酶比活性(410nm波長下)為5.09和11.86，分別是對(duì)照組的2.3和5.3倍；而香葉醇處理1d和3d后測(cè)得的多酚氧化酶比活性僅是對(duì)照組的2.2和2.4倍。將果實(shí)切片直接暴露在香葉醇和葉醇溶液中測(cè)得的ppo酶活性分別為9.35和12.86，誘發(fā)明顯高于上述的噴施處理。盡管在410nm下測(cè)定的ppo酶活性，在數(shù)值上與在525nm下測(cè)定值存在較大的差異，但整體的趨勢(shì)是一致的，表明這兩個(gè)吸收波長均可被用來