高中生物選修三專題一基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.1.基因文庫：基因文庫：概念見概念見p9p92.2.基因文庫的分類基因文庫的分類: :按外源按外源dnadna片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組dna文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只

2、包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cdna文庫文庫3.3.基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。目的基因。4.4.獲取目的基因的根據(jù)：獲取目的基因的根據(jù)： 見課本見課本p9提取某生物提取某生物全部全部dna用適當(dāng)用適當(dāng)限制酶切割限制酶切割許許 多多dna片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群該生物基該生物基因組文庫因組文庫（每個受體菌含有一段不同的dna片段）與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群mrna逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈雜交雙鏈核酸酶核酸酶h單鏈單鏈dnadna聚

3、合酶聚合酶雙鏈雙鏈dna(cdna)該生物該生物cdna文庫文庫2.2.基因文庫的構(gòu)建方法基因文庫的構(gòu)建方法鳥槍法：鳥槍法：供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的dnadna許多許多dnadna片段片段運載體運載體限制酶限制酶與載體連接與載體連接載入載入受體細(xì)胞受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入導(dǎo)入外源外源dnadna擴增擴增目的基因目的基因分離分離( (直接分離法直接分離法) )( (一一) )從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使的信使rnarna為模板，反為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈dnadna，然后在酶的作用下合成

4、然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈dnadna，從而獲得所，從而獲得所需的基因。形成的事需的基因。形成的事cdnacdna文庫文庫目的基因的目的基因的mrnamrna雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈rna/rna/單鏈單鏈dna)dna)單鏈單鏈dnadna反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶核酸酶h h2.2.基因文庫的構(gòu)建方法基因文庫的構(gòu)建方法dnadna聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈dnadna( (目的基因目的基因) )1 1、 概念概念：pcrpcr全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 通過這項技術(shù)可在通過這項技術(shù)可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因短時間內(nèi)大量擴增目的基因

5、因為整個過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做因為整個過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外體外dnadna擴增技術(shù)。擴增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段2 2、原理：、原理： dnadna復(fù)制復(fù)制（二）利用（二）利用pcrpcr技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dntp)(dntp) 一對引物：一對引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定dnadna聚合酶聚合酶(taq(taq酶）酶）模板模板dna( dna( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 一對寡核苷酸序列：與目的基因一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一

6、段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物根據(jù)這一序列合成引物溫度控制溫度控制5 5/ /3 3/ /g gg gt tc c3 3/ /5 5/ /g ga ac cc c5 5/ /3 3/ /引物引物g gg g變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸1、變性、變性(90-95度度)：目的基因：目的基因dna受熱變性，解鏈為單鏈；受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性（復(fù)性（55-60）：引物與兩條單鏈通過堿基互補配對原則結(jié)合；）：引物與兩條單鏈通過堿基互補配對原則結(jié)合；3.延伸（延伸（70-75）：在）：在dna聚合酶（聚合酶（taq酶）作用下，從酶）作用下，從5端端3端端進(jìn)行延伸。進(jìn)行延伸。5 5

7、/ /3 3/ /a ag g引物引物5、擴增過程、擴增過程利用利用pcrpcr技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因pcrpcr技術(shù)擴增過程技術(shù)擴增過程a a、dnadna變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈dnadna模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成_ _ b b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與dnadna模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在taqdnataqdna聚合酶的作聚合酶的作用下，從引物的用下，從引物的_延伸，合成與延伸，合成與模板互補的

8、模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈dnadna雙鏈雙鏈dnadna鏈鏈5端端3端端dna合成儀合成儀推推測測推推測測合合成成質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶dna連接酶連接酶重組重組dna1.1.用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 dnadna分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制

9、酶的黏性末端的黏性末端切口切口dnadna連接酶連接酶相同相同( (二二) )基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心核心質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna分子分子一個一個切口切口兩個兩個黏性末端黏性末端兩個兩個切口切口獲得目的基因獲得目的基因dna dna 連接酶連接酶重組重組dnadna分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶 科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)

10、，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。 基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因知識點一：知識點一：1.1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游

11、編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與rnarna聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與rnarna聚合酶結(jié)合并能起聚合酶結(jié)合并能起始始mrnamrna合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的dnadna片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙rnarna聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從dnadna模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。rnarna聚合酶聚合酶: :能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合能夠識別

12、啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì).(.(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使rnarna，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使rnarna，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的rnarna聚合酶結(jié)合位點。聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下

13、游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與rnarna聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 知識點一：知識點一：2.2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼

14、蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的rnarna 聚合酶結(jié)合位點等。聚合酶結(jié)合位點等。原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1、導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是什、導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是什么？具么？具 體過程是怎樣的？體過程是怎樣的？ 2、導(dǎo)入動物細(xì)胞常用的方法是什、導(dǎo)入動物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？么？基本操作程序是怎樣的？ 3、導(dǎo)入大腸桿菌的方法是怎樣的？、導(dǎo)入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？鈣離