高中生物選修三專題一基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四個(gè)步驟基因工程基本操作的四個(gè)步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取（一）從基因文庫(kù)中直接獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中直接獲取1.1.基因文庫(kù)：基因文庫(kù)：概念見(jiàn)概念見(jiàn)p9p92.2.基因文庫(kù)的分類基因文庫(kù)的分類: :按外源按外源dnadna片段的來(lái)源分類片段的來(lái)源分類種種類類基因組基因組dna文庫(kù)：文庫(kù)：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫(kù)：部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的只

2、包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cdna文庫(kù)文庫(kù)3.3.基因文庫(kù)的目的基因文庫(kù)的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。目的基因。4.4.獲取目的基因的根據(jù)：獲取目的基因的根據(jù)： 見(jiàn)課本見(jiàn)課本p9提取某生物提取某生物全部全部dna用適當(dāng)用適當(dāng)限制酶切割限制酶切割許許 多多dna片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群該生物基該生物基因組文庫(kù)因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的dna片段）與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群mrna逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈雜交雙鏈核酸酶核酸酶h單鏈單鏈dnadna聚

3、合酶聚合酶雙鏈雙鏈dna(cdna)該生物該生物cdna文庫(kù)文庫(kù)2.2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法鳥(niǎo)槍法：鳥(niǎo)槍法：供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的dnadna許多許多dnadna片段片段運(yùn)載體運(yùn)載體限制酶限制酶與載體連接與載體連接載入載入受體細(xì)胞受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入導(dǎo)入外源外源dnadna擴(kuò)增擴(kuò)增目的基因目的基因分離分離( (直接分離法直接分離法) )( (一一) )從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使的信使rnarna為模板，反為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈dnadna，然后在酶的作用下合成

4、然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈dnadna，從而獲得所，從而獲得所需的基因。形成的事需的基因。形成的事cdnacdna文庫(kù)文庫(kù)目的基因的目的基因的mrnamrna雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈rna/rna/單鏈單鏈dna)dna)單鏈單鏈dnadna反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶核酸酶h h2.2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法dnadna聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈dnadna( (目的基因目的基因) )1 1、 概念概念：pcrpcr全稱為全稱為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因

5、因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，所以又叫做因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外體外dnadna擴(kuò)增技術(shù)。擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段2 2、原理：、原理： dnadna復(fù)制復(fù)制（二）利用（二）利用pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dntp)(dntp) 一對(duì)引物：一對(duì)引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定dnadna聚合酶聚合酶(taq(taq酶）酶）模板模板dna( dna( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一

6、段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物根據(jù)這一序列合成引物溫度控制溫度控制5 5/ /3 3/ /g gg gt tc c3 3/ /5 5/ /g ga ac cc c5 5/ /3 3/ /引物引物g gg g變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸1、變性、變性(90-95度度)：目的基因：目的基因dna受熱變性，解鏈為單鏈；受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性（復(fù)性（55-60）：引物與兩條單鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；）：引物與兩條單鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；3.延伸（延伸（70-75）：在）：在dna聚合酶（聚合酶（taq酶）作用下，從酶）作用下，從5端端3端端進(jìn)行延伸。進(jìn)行延伸。5 5

7、/ /3 3/ /a ag g引物引物5、擴(kuò)增過(guò)程、擴(kuò)增過(guò)程利用利用pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a a、dnadna變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈dnadna模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成_ _ b b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與dnadna模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在taqdnataqdna聚合酶的作聚合酶的作用下，從引物的用下，從引物的_延伸，合成與延伸，合成與模板互補(bǔ)的

8、模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈dnadna雙鏈雙鏈dnadna鏈鏈5端端3端端dna合成儀合成儀推推測(cè)測(cè)推推測(cè)測(cè)合合成成質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶dna連接酶連接酶重組重組dna1.1.用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 dnadna分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制

9、酶的黏性末端的黏性末端切口切口dnadna連接酶連接酶相同相同( (二二) )基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心核心質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna分子分子一個(gè)一個(gè)切口切口兩個(gè)兩個(gè)黏性末端黏性末端兩個(gè)兩個(gè)切口切口獲得目的基因獲得目的基因dna dna 連接酶連接酶重組重組dnadna分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶 科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)

10、，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。 基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因、目的基因b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因知識(shí)點(diǎn)一：知識(shí)點(diǎn)一：1.1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游

11、編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與rnarna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與rnarna聚合酶結(jié)合并能起聚合酶結(jié)合并能起始始mrnamrna合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的dnadna片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙rnarna聚合酶的移動(dòng)，并使其從聚合酶的移動(dòng)，并使其從dnadna模板鏈上脫離下來(lái)，模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。rnarna聚合酶聚合酶: :能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合能夠識(shí)別

12、啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì).(.(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使rnarna，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使rnarna，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的rnarna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下

13、游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與rnarna聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 知識(shí)點(diǎn)一：知識(shí)點(diǎn)一：2.2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼

14、蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的rnarna 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1、導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是什、導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是什么？具么？具 體過(guò)程是怎樣的？體過(guò)程是怎樣的？ 2、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用的方法是什、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？么？基本操作程序是怎樣的？ 3、導(dǎo)入大腸桿菌的方法是怎樣的？、導(dǎo)入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？鈣離