單核巨噬細胞(RAW264.7)復蘇與培養(yǎng)、消化與凍存

1、單核巨噬細胞(RAW 264.7)復蘇與培養(yǎng)、消化與凍存1材料與方法1.1 實驗材料1.1.1 細胞及中藥單體成分：小鼠RAW 264.7單核巨噬細胞株購自上海細胞庫；LPS購于sigma公司；1.1.2 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液：Gbico公司產(chǎn)品胎牛血清：Gbico公司產(chǎn)品DMSO(批號 DZ0231): AMRESCO 公司產(chǎn)品胰蛋白酶：Merck公司產(chǎn)品青霉素-鏈霉素：Gbico公司MTT、臺盼藍試劑：Sigm心司產(chǎn)品PBS:上海雙螺旋生物科技有限公司TNF-a ELISA試齊【J盒：美國eBioscienc公司1.1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo From宓司酶標儀

2、：Biorad公司倒置顯微鏡：日本olympus公司高速低溫冷凍離心機：彳惠國Eppend0f司側(cè)擺搖床：歐瑞實驗器材公司培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿、24孔/48孔/96孔培養(yǎng)板、離心管：美國BD公司1.2 實驗方法1.2.1 單核巨噬細胞(RAW 264.7)復蘇與培養(yǎng)：實驗操作前，先將水浴鍋預先 調(diào)至37C,無血清的RPMI- 1640培養(yǎng)液于37 C水浴鍋內(nèi)預熱，15 ml的離心 管4 C熱平衡；用銀子將單核巨噬細胞(RAW 264.7)的細胞凍存管從液氮罐 中取出，浸入含37 c水的燒杯內(nèi)，輕輕晃動凍存管，凍存管內(nèi)冰核差不多融 化時取出凍存管移至超凈工作臺內(nèi)，用酒精棉球擦拭管口；在 15 ml離心

3、管內(nèi)加入4 ml含10 % FBS及1 %青霉素-鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液，再將凍存 管內(nèi)含細胞的懸液吸至該離心管內(nèi)，蓋上管蓋，輕輕搖勻和上下顛倒混勻；繼 續(xù)添加含10 %胎牛血清、1 %青霉素-鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液至離心管 刻度14 ml處，蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻；離心機設(shè)置 4 C, 1000 rpm,離心 5 min后，小心吸出上清液，然后輕彈離心管底部使細胞團分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液14 ml,蓋上管蓋，輕輕顛 倒混勻，4 C, 1000 rpm離心5 min,棄上清液，力口 2 ml無血清的RPMI- 1640

4、 培養(yǎng)液混勻，取50 d細胞懸液使用臺盼藍試劑進行活細胞計數(shù)；加細胞培養(yǎng)液稀釋至所需的細胞濃度，移至培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)置于含5 % CO2培養(yǎng)箱(37 C)中，1-2 d更換細胞培養(yǎng)液1次，呈貼壁生長，2-3 d用0.25 %胰酶消化傳代1 次。1.2.2 單核巨噬細胞(RAW 264.7)消化與凍存單核巨噬細胞(RAW 264.7)消化：實驗操作前，先將水浴箱預先調(diào)至37 C, 將0.25 %胰酶及含10 %胎牛血清、1 %青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液 置于37 c水浴箱中水浴備用，將長滿單核巨噬細胞(RAW 264.7)的培養(yǎng)瓶中 原培養(yǎng)液棄去，用PBS洗滌3次，再加入1-2 ml

5、 0.25 %胰酶，使瓶底細胞都浸 入胰酶溶液中，于含5% CO2的37 c培養(yǎng)箱中消化3 min；在倒置顯微鏡下觀 察細胞，原貼壁細胞逐漸趨于圓形時，加入 10 ml含10 %胎牛血清、1 %青霉 素-鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液終止消化；輕輕敲打培養(yǎng)瓶并用吸管將貼壁細胞 吹打成懸液，分別轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻，4 C, 1000 rpm離心5 min,棄上清液，加4 ml含10 %胎牛血清、1 %青霉素-鏈霉素的 RPMI- 1640培養(yǎng)液混勻，取50 M細胞懸液進行細胞計數(shù)，再加適應(yīng)量的含10 % FBS及1 %青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至細胞密度為1x106個/ml; 再移至培養(yǎng)瓶或24孔板內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)置于培養(yǎng)箱(5 % CO2, 37C)中培養(yǎng)。單核巨噬細胞(RAW 264.7)凍存：將備好的細胞凍存管做好標記(RAW 264.7、日期、實驗室單位)，配置好一定量的細胞凍存液，配置比例為RPMI- 1640 培養(yǎng)液：血清：DMSO = 7: 2: 1;將已經(jīng)消化下來的細胞懸液 4 C, 1000 rpm 離心5 min,棄上清液，留下細胞，緩慢加入已經(jīng)配好的細胞凍存液，輕輕混勻；每個細胞凍存管中加入含凍存液的細胞懸液 1.8 ml,蓋上