農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基本操作與理論

1、編輯ppt1農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法生物技術(shù)生物技術(shù)08-108-1梁榮洪梁榮洪編輯ppt2一、簡介 農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠瘓瘤或發(fā)狀根。根想農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段TDNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將TDNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的TDNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介

2、導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應(yīng)用。 編輯ppt3二、原理 農(nóng)桿菌主要有兩種：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。 根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多種雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。引發(fā)冠癭瘤的原因是，Ti質(zhì)粒上的T-DNA上有8個(gè)左右的基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，指導(dǎo)合成一種非常尋常的化合物冠癭堿，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)化細(xì)胞癌變。而發(fā)根農(nóng)桿菌則誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)狀根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，被譽(yù)為“自然界最小的遺傳工程師”。可以通過將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。編輯ppt4三、操作方法 1、獲取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建。將目的基因與載體（大多數(shù)選用質(zhì)粒）用DNA連接酶連接起來。 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。將含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌為受體細(xì)胞）。 4、目的基因的檢測與鑒定。用DNA分子雜交技術(shù)/分子雜交技術(shù)/抗原-抗體雜交/個(gè)體生物學(xué) 幾種方法進(jìn)行檢驗(yàn)（根據(jù)要求選取不同方法）。 5