在大腸桿菌內引入甲羥戊酸途徑高效合成抗藥青蒿素前體——紫穗槐4,11二烯PPT課件

1、在大腸桿菌內引入甲羥戊酸途徑高效合成抗瘧藥青蒿素前體紫穗槐-4,11- 二烯 合成生物學：n一門生物學與工程學交叉的前沿學科, 以生命科學理論為指導, 以工程學原理進行遺傳設計、基因組改造( 重組染色體) 和（或）合成以及人造細胞合成。其中, 基因組改造( 重組染色體) 和（或）合成是關鍵。n2010年5 月20日, 以克雷格文特爾為首的美國科學家, 在science上公布了人類歷史上創(chuàng)造出首個“人造單細胞生物”的消息，以這項成果為代表的合成生物學(synthetic biology, synbio)也就受到了前所未有的關注。 合成生物學如何創(chuàng)造生命n用a 、g 、c 、t 為代表的化學物質人

2、工合成dna(脫氧核糖核酸) 片段, 由dna片段合成基因,再由基因組合成生物模塊, 然后裝配成“人造基因組”, 最終在實驗室里創(chuàng)造出全新生物體。 合成生物學與大腸桿菌 合成生物學中的底盤生物是合成生物學的“硬件”基礎。大腸桿菌(escherichia coli) 作為最簡單的模式生物，由于其背景清晰、生長快速、易于操作，在基礎生物研究以及生物技術應用方面有著其他模式生物無可比擬的優(yōu)越性。n大腸桿菌已經成為能源、化合物、材料及藥物 生產的重要平臺，合成生物學的發(fā)展促進了大腸桿菌代謝途徑的重建，通過精確設計基因環(huán)路、重構代謝途徑為大腸桿菌提供了新的代謝和生理功能，使其能夠高產天然甚至非天然產物。

3、 在過去的十年里，基于大腸桿菌的系統(tǒng)生物學得到了迅猛發(fā)展。 大腸桿菌與青蒿素的合成 青蒿素(artemisinin) 是中國科學家于20世紀70年代從傳統(tǒng)中草藥青蒿或稱黃花蒿( artemisia annua l.)中分離提純的抗瘧有效單體, 其化學本質是含有“ 過氧橋” 結構(1,2,4- 三噁烷環(huán)) 的倍半萜內酯。n以青蒿素為母核經人工半合成獲得的青蒿素琥珀酸酯( 青蒿琥酯) 、青蒿素甲醚( 蒿甲醚) 、青蒿素乙醚( 蒿乙醚)和雙氫青蒿素等青蒿素類藥物, 血中溶解性好, 生物利用度高, 對氯喹抗性瘧疾及致命性腦型瘧有特效, 已成為世界衛(wèi)生組織(who)倡導的“ 基于青蒿素的聯(lián)合療法”(ar

4、temisinin-based combination therapies, acts)首選的抗瘧新藥。 青蒿分布地域狹窄, 青蒿素含量低(0.01% 0.5%). 化學合成青蒿素產率不理想, 成本高. 隨著全球瘧疾發(fā)病率(3.8 億人/ 年) 和死亡率(4600 萬人/ 年)逐年升高, 青蒿素類抗瘧藥需求量迅猛增長, 導致青蒿素原料藥供不應求, 市場價格飆升. 近10年來, 為了從根本上解決青蒿素的供需矛盾, 國內外爭相開展了青蒿素合成生物學及代謝工程研究, 一方面嘗試在微生物體內重建青蒿素生物合成途徑, 另一方面對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進行遺傳改良 大腸桿菌與青蒿素前體 大腸桿菌內

5、存在以脫氧木酮糖磷酸 (deoxyxylulose-5-phosphate ，dxp) 途徑為基礎的類異戊二烯代謝途徑，能合成少量的輔酶q 等。故大腸桿菌非常適合作為生物合成類異戊二烯化合物的宿主菌。n本研究在大腸桿菌中引入人工合成的紫穗槐- 4,11- 合酶基因并構建原核的糞腸球菌 enterococcus faecalis 來源的mva途徑，獲得了抗瘧藥青蒿素前體紫穗槐-4,11- 二烯的高表達。n這種微生物半合成青蒿素的方法先通過改造微生物合成途徑獲得青蒿素的前體紫穗槐- 4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相對簡單的化學催化步驟可將這些前體轉化成青蒿素，可以大規(guī)模制備青蒿素，解決資源短缺問

6、題。n基本思路：n首先在大腸桿菌escherichia coli dhgt7 中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大腸桿菌內源的法尼基焦磷酸，成功獲得了紫穗槐-4,11- 二烯。n為提高前體供給，引入糞腸球菌的甲羥戊酸途徑，紫穗槐-4,11- 二烯的產量提高了13.3 倍，達到151 mg/l。n進一步研究發(fā)現了3 個限制酶，分別是紫穗槐-4,11- 二烯合酶、hmg-coa 還原酶和甲羥戊酸激酶；通過調節(jié)這些酶的水平，紫穗槐-4,11- 二烯產量提高了7.2 倍，在搖瓶中達到235 mg/l。 1. 載體構建、目的基因表達n采用常用分子克隆技術，如pcr 擴增、酶切、 連接和

7、轉化等構建質粒表達載體 。n將表達載體轉化宿主菌e. coli dhgt7 ，接入含相應抗生素 (kn、cm 均為25 g/ml) 的液體lb培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)至od600 =0.30.4 ，加入 0.2 l-阿拉伯糖誘導，繼續(xù)培養(yǎng)45 h 。取菌體全蛋白作sds-page 分析,以 pet28a 為對照。結果在約56 kda 處有可見的紫穗槐-4,11- 二烯合酶 (ads) 的條帶 。 2. 搖瓶培養(yǎng)方法n挑取新轉化的單克隆，接入含相應抗生素的液體lb 培養(yǎng)基中，37 振蕩培養(yǎng)過夜。n取過夜培養(yǎng)菌液轉接40 ml 抗性fm2g 培養(yǎng)基，使初始菌體濃度為od600=0.05，37 、220

8、 r/min振蕩培養(yǎng)至od600 為0.30.4 時，加入0.2 l- 阿拉伯糖或0.5 mmol/l iptg 誘導，并加入20 ( v / v ) 無菌的十二烷覆蓋在培養(yǎng)基的表面，隨后轉至30 繼續(xù)培養(yǎng)4860 h。選取不同時間點測定菌體濃度和紫穗槐-4,11- 二烯產量。 gc-ms法測定ad含量 n新轉化的菌株pet28-ads/dhgt7 進行搖瓶培養(yǎng)，采用gc-ms法測定紫穗槐-4,11- 二烯的含量。通過gc檢測，分別在8.42 min和8.83 min 出現內標物石竹烯 (is) 和紫穗槐-4,11- 二烯 (ad) 的保留峰 。n根據內標石竹烯的濃度對樣品ad 含量進行定量，

9、結果搖瓶培養(yǎng)48 h 的紫穗槐-4,11- 二烯產量僅為11.3 mg 石竹烯當量/l 。我們推測大腸桿菌內源的fpp 水平太低，限制了紫穗槐-4,11- 二烯的產量，因此提高胞內fpp 水平是提高紫穗槐-4,11- 二烯產量的關鍵。n由于大腸桿菌僅存在dxp途徑，為避免對內源途徑的影響，后面引入了異源的 mva途徑來提高前體供給。 3. 構建異源mva途徑 n以低拷貝質粒pacycduet-1 的骨架為基礎，pcr 擴增質粒pet3b 的多克隆位點 (mcs)，并通過pcr 引物引入not和apa 限制性酶切位點，將pcr 擴增的mcs序列連接到pacycduet-1 的sph 和eco r

10、 之間，構建了具有特殊 mcs的質粒載體paoc3anl，用于多基因合成途徑的構建。 n將糞腸球菌來源的mvae、mvas、md 和ispa與ads 分別構建在質粒載體paoc3anl 和pet28a上，得到表達載體paoc3-es-md 和pet28-ispa- ads，共轉化e. coli dhgt7 ，搖瓶培養(yǎng)48 h ，紫穗槐-4,11- 二烯產量達到151 mg/l，是利用內源fpp的13.3 倍。 4. 優(yōu)化紫穗槐-4,11- 二烯合成途徑 n將整個紫穗槐-4,11- 二烯合成途徑的基因構建 到單個質粒載體 paoc3anl 上，得到表達載體paoc3-es-md-ispa-ads

11、 ( 圖4），轉化e.coli dhgt7，紫穗槐-4,11- 二烯產量為32.5 mg/l，僅為使用2 個質粒共表達時的1/5，菌體的生長也受到嚴重抑制 ( 圖5a) 。推斷這是因為當使用2 個質粒共表達時ads 是構建在高拷貝的pet28a 上，而以單個質粒表達時 ads 是構建在低拷貝的paoc3anl 上，間接地降低了ads 的拷貝數，使得胞內fpp 累積，引起內源fpp 合成途徑的反饋調控作用，從而抑制菌體生長。n提高ads 的拷貝數，將pet28-ads與paoc3-es-md-ispa-ads 共轉化 e. coli dhgt7，結果紫穗槐-4,11- 二烯產量提高了4.3 倍，

12、達到140 mg/l ( 圖5b) ，菌體生長抑制也得到一定程度的緩解。nhmg-coa 還原酶是類異戊二烯化合物生物合成過程中的關鍵酶，其活性不足會導致hmg-coa 在胞內累積產生毒性。因此，我們提高hmg-coa 還原酶水平，構建了表達載體pet28-e-ads，paoc3 es-md-ispa-ads 共轉化e. coli dhgt7 ，結果菌體生長抑制得到進一步緩解，紫穗槐-4,11- 二烯產量也再次提高。 n另外，提高胞內甲羥戊酸激酶 (mk) 的水平可以極大地提高紫穗槐-4,11- 二烯產量。因此我們構建了表達載體pet28-e-mk-ads，與paoc3-es-md-ispa-ads 共轉化e. coli dhgt7 ，結果紫穗槐-4,11- 二烯產量達到235 mg/l，是優(yōu)化前的7.2 倍，菌體生長抑制基本消除。 展望 n