探究葉綠體提取液對腫瘤細胞的抑制作用

1、高中組11年級集體項目（2人） 探究葉綠體提取物對腫瘤細胞的抑制作用組別：高中組學科：生物化學探究葉綠體提取物對腫瘤細胞的抑制作用摘要：綠色蔬菜是人類的主要食物，在日常膳食中可通過綠葉蔬菜的攝入,可以達到維持機體代謝、增強體質(zhì), 甚至防病抗癌的作用。綠色植物的顯著特點在于綠色，其綠色的產(chǎn)生源于細胞內(nèi)的葉綠素。早期研究發(fā)現(xiàn):葉綠素具有造血、解毒、抗病等多種用途。葉綠素是否具有抑制癌癥的作用，尤其是對于消化道腫瘤的抑制作用，尚未有詳盡的報道。本研究我們選取菠菜作為葉菜類的蔬菜代表，黃瓜作為瓜菜類的代表，通過提取這兩種蔬菜葉綠體中的葉綠素和類胡蘿卜素，觀察了它們對人胃癌細胞生長的影響。我們用乙醇提取

2、法提取市售菠菜和黃瓜中的葉綠素和類胡蘿卜素，倍比稀釋成 5個濃度，（1：1；1：2；1：4；1：8;1:16）用MTT法觀察它們對人胃癌細胞BCG823生長的影響。結果顯示：菠菜中葉綠素a濃度為6.345（mg/L），葉綠素b濃度2.425（mg/L），類胡蘿卜素濃度為1.595（mg/L）。黃瓜中葉綠素濃度為2.359（mg/L），葉綠素b濃度為0.644（mg/L），類胡蘿卜素的濃度為0.565（mg/L）。5個濃度（1：1；1：2；1：4；1：8;1:16）的菠菜提取液對人胃癌細胞的抑制率分別為81%、80%、79%、77%、34%；而黃瓜抑制率分別為68%、63%、58%、46%、26

3、%。本次試驗結果顯示：由于菠菜中的葉綠素含量和類胡蘿卜素的含量均高于黃瓜，所以其對細胞生長的抑制效果強于黃瓜，提示由于葉菜類的蔬菜葉綠素和類胡蘿卜素的含量高于瓜菜類，所以我們在日常膳食中應該多攝入葉菜類的蔬菜以增加葉綠素、類胡蘿卜素的攝入量從而達到更好的抗癌抗病作用。關鍵詞：葉綠素；人胃癌細胞 ；MTT；細胞抑制率一、 引言綠色蔬菜是人類的主要食物，在日常膳食中可通過綠葉蔬菜的攝入,可以達到維持機體代謝、增強體質(zhì), 甚至防病抗癌的作用。綠色植物的顯著特點在于綠色，其綠色的產(chǎn)生源于細胞內(nèi)的葉綠素。那么葉綠素是否具有防癌抗癌的作用呢？葉綠素存在于植物細胞內(nèi)的葉綠體中。大部分高等植物和藻類微生物的葉

4、綠體是植物光合作用的場所。主要含有葉綠素（葉綠素a和葉綠素b）、類胡蘿卜素（胡蘿卜素和葉黃素），葉綠素a和葉綠素b主要吸收藍紫光和紅光，胡蘿卜素和葉黃素主要吸收藍紫光。這些色素吸收的光都可用于光合作用。葉綠素的含量最多，遮蔽了其他顏色，而且，葉綠素吸收綠光最少，綠光被反射，所以呈現(xiàn)綠色。主要功能是進行光合作用。早期研究發(fā)現(xiàn):葉綠素具有造血、解毒、抗病等多種用途。葉綠素是否具有抑制癌癥的作用，尤其是對于消化道腫瘤的抑制作用，尚未有詳盡的報道。二、方法論與假設概述2.1葉綠素和類胡蘿卜素提取取市售的菠菜葉片或黃瓜表皮2克，放于坩堝加入酒精研磨至褪色。靜置10分鐘后過濾并用酒精定容至15ml。存放于

5、塑料試劑瓶中并用錫箔紙包裹放入冰箱冷藏備用。取 1200ul（95%乙醇）+50 ul（葉綠素提取物）用722分光光度計分別在波長A665, A649, A470測定吸光值，按公式分別計算菠菜和黃瓜提取物中葉綠素濃度以及菠菜和黃瓜中葉綠素的含量。實驗時每種葉綠素樣品置于離心管中1500rpm離心5min取上層清液1ml，按1: 1，1:2，1:4，1:8，1:16用PBS稀釋成5個梯度。葉綠素濃度計算公式如下：葉綠素含量計算公式如下：2.2細胞培養(yǎng)人胃癌細胞BCG823采用DMEM培養(yǎng)液含10%小牛血清，100mg/ml青霉素，100mg/ml的鏈霉素，100mg/ml的慶大霉素，在37，5%

6、的CO2孵箱中培養(yǎng)。2.3細胞毒性檢測（MTT實驗） 取對數(shù)生長期的細胞，取96孔板，每孔加入細胞懸液100µl （細胞數(shù)2.0´104），實驗組分別加入5個梯度的菠菜和黃瓜的葉綠素抽提液100µl，對照組加100µlPBS，培養(yǎng)2小時后，小心吸取上面的培養(yǎng)液，加MTT（終濃度³1mg/ml），37%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，棄上清液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)100ml,震蕩搖勻，在酶標儀上以波長540nm測定各孔的吸光度值，按公式計算細胞生長抑制率。細胞抑制率計算公式 抑制率（%）=1- 實驗組OD值 ´100% 對照組OD值 2.4

7、實驗流程圖：1. 葉綠素和類胡蘿卜素提取測定 Þ 原料 稱量取樣 Þ 在乙醇溶液中剪碎研磨 過濾 Þ 722分光光度計測定葉綠素濃度2. 細胞毒性檢測(MTT實驗) Þ 細胞培養(yǎng)箱圖 胃癌細胞在培養(yǎng)瓶中生長圖 Þ 胃癌細胞（´200）圖 96孔板MTT實驗結果圖 Þ 酶標儀測定吸光度值圖三、 數(shù)據(jù)記錄與分析3.1 菠菜和黃瓜葉綠素和和類胡蘿卜素含量表1 菠菜和黃瓜提取液吸光度值A665 A649A470菠菜0.6860.2690.687黃瓜0.2120.0880.219 表1顯示菠菜和黃瓜提取物經(jīng)722分光光度計分別在波長A

8、665, A649, A470測定的吸光值，按前述公式分別計算菠菜和黃瓜提取物中葉綠素濃度（見表2）以及菠菜和黃瓜中葉綠素的含量（見表3）。表2 菠菜和黃瓜提取物中葉綠素濃度（mg/L）葉綠素a（Ca）葉綠素b（ Cb）類胡蘿卜素（CX.C）菠菜6.3452.4251.595黃瓜2.3590.6440.565由表2可見：本次測定中菠菜提取物中葉綠素a濃度為6.345（mg/L），葉綠素b濃度2.425（mg/L），類胡蘿卜素濃度為1.595（mg/L）。黃瓜中葉綠素濃度為2.359（mg/L），葉綠素b濃度為0.644（mg/L），類胡蘿卜素的濃度為0.565（mg/L）。表3 菠菜和黃瓜葉綠

9、素含量（mg/g）葉綠素a（Ca）葉綠素b（ Cb）類胡蘿卜素（CX.C）菠菜1.1900.4550.299黃瓜0.4420.1210.106從表3可見：菠菜的葉綠素總含量為1.645mg/g，類胡蘿卜素0.299 mg/g，均高于黃瓜中的葉綠素總含量(0.563mg/g）和類胡蘿卜素含量 （0.106 mg/g）3.2葉綠體提取物對人胃癌細胞的存活率的影響表4 不同稀釋濃度的黃瓜和菠菜提取液酶標儀測定吸光度值菠菜黃瓜1: 1 0.0470.0791:2 0.0500.0891:4 0.0520.1041:8 0.0570.133 1:16 0.1640.183 對照組 0.248 0.248

10、表4 顯示不同稀釋濃度的黃瓜和菠菜提取液對胃癌細胞毒性檢測（MTT實驗結果）， 即在酶標儀上以波長540nm測定各孔的吸光度值，按前述公式計算細胞生長抑制率。表5 不同稀釋濃度的黃瓜和菠菜提取液對人胃癌細胞的抑制率（%）1:161:81：41:21:1菠菜3477798081黃瓜2646586368 圖1 不同稀釋濃度的黃瓜和菠菜提取液對人胃癌細胞的抑制率（%）由表5，圖1可知，5個濃度（1：1；1：2；1：4；1：8;1:16）的菠菜提取液對人胃癌細胞的抑制率分別為81%、80%、79%、77%、34%；而黃瓜抑制率分別為68%、63%、58%、46%、26%，菠菜和黃瓜的葉綠素均對胃癌細胞

11、的生長有抑制作用。菠菜提取液的作用強于黃瓜提取液。四、結論概述葉綠素（chlorophyll)是一類與光合作用(photosynthesis)有關的最重要的色素。光合作用是通過合成一些有機化合物將光能轉變?yōu)榛瘜W能的過程。葉綠素實際上存在于所有能營造光合作用的生物體，包括綠色植物、原核的藍綠藻（藍菌）和真核的藻類。葉綠素從光中吸收能量，然后能量被用來將二氧化碳轉變?yōu)樘妓衔铩４罅垦芯堪l(fā)現(xiàn)葉綠素具有以下作用：（1）造血作用：葉綠素中富含鎂卟啉化合物，其中卟啉是天然的造血原料。人血紅素含有鐵卟啉化合物，與葉綠素不同的是含有鐵離子。因此葉綠素，可以為人體造血源源不斷地提供卟啉化合物。（2）維持酶的活

12、性：葉綠素在酶的制造、維持其活性上有重要作用。葉綠素與酶的結合，就是生命的延續(xù)過程。（3）解毒作用：葉綠素是最好的天然解毒劑，能預防感染，防止炎癥的擴散，還有止痛功能。只要多喝點含葉綠素的蔬菜汁，就能使口腔、鼻腔、身體散發(fā)出的口臭、汗味、尿味、糞便味等異味消失。 （4）抗病強身：葉綠素在改善體質(zhì)，祛病強身方面也有很多作用。（5）抑癌作用：研究發(fā)現(xiàn)食物中的葉綠素可以通過作用于某些關鍵分子，從而阻斷細胞內(nèi)信號轉導通路，進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。類胡蘿卜素（carotenoid）：一類重要的天然色素的總稱。普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類和細菌中的黃色、橙紅色或紅色的色素，主要是-胡蘿卜素和-胡蘿

13、卜素，因此而得名。不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶劑。亦稱脂色素。自從19世紀初分離出胡蘿卜素，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近450種天然的類胡蘿卜素；植物的類胡蘿卜素存在于各種黃色質(zhì)體或有色質(zhì)體內(nèi)；如秋季的黃葉，黃色花卉，黃色和紅色的果實和黃色塊根。動物的類胡蘿卜素主要是脂肪、卵黃、羽毛和魚鱗以及蝦蟹的甲殼的色素。動物的類胡蘿卜素一般與蛋白質(zhì)結合在一起，如蝦青蛋白含有蝦青素，蝦卵綠蛋白是蝦青素與一種富含的復合物。-胡蘿卜素是哺乳動物合成維生素A的前體，稱為維生素A原。葉綠體內(nèi)除含有葉綠素外也含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素能將吸收的光能傳遞給葉綠素a，是光合作用不可少的光合色素.其中葉黃素是一種重要的抗氧化劑，為類胡蘿

14、卜素家族（一組植物中發(fā)現(xiàn)的天然的脂溶性色素）的一員，在自然界中與玉米黃素共同存在。研究發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素具有極強的抗氧化作用，淬滅自由基，從而達到抗癌效應。本次實驗中測定細胞存活率（抑制率）是采用MTT法。MTT也叫噻唑藍，該方法原理為：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強。本次實驗中我們選取菠菜作為

15、葉菜類的蔬菜代表，黃瓜作為瓜菜類的代表，通過提取這兩種蔬菜中的葉綠素和類胡蘿卜素，觀察了它們對人胃癌細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)5個稀釋濃度的提取物均對腫瘤細胞的生長有抑制作用，由于菠菜中的葉綠素含量和類胡蘿卜素的含量均高于黃瓜，所以其對細胞生長的抑制效果強于黃瓜，提示由于葉菜類的蔬菜葉綠素和類胡蘿卜素的含量高于瓜菜類，所以我們在日常膳食中應該多攝入葉菜類的蔬菜以增加葉綠素、類胡蘿卜素的攝入量從而達到更好的抗癌抗病作用。由于本次實驗我們抽提是葉綠體中的混合物，包括葉綠素和類胡蘿卜素，提取物對腫瘤細胞的抑制作用有可能是葉綠素和類胡蘿卜素共同作用的結果，雖然混合物中葉綠素含量占大多數(shù)，也只是初步證明葉綠素

16、可能有作用。要想證實葉綠素的抗癌作用還需提純?nèi)~綠素以進行下一步實驗，最終得以確認。參考文獻：1陳紅， 曾恩泉，葉綠酸防治腫瘤的作用及其機制研究進展J。中華腫瘤防治雜志，2010（16）：1315-13182王景川 龐廣昌-胡蘿卜素的抗腫瘤作用及其分子機制研究進展J.食品科學，2008（10）：665-6693Nagini S1, Vidya Priyadarsini R, Veeravarmal V, Mishra R. Chlorophyllin abrogates canonical Wnt/-catenin signaling and angiogenesis to inhibit the development of DMBA-induced hamster cheek pouch carcinomasJ.Cell Oncol ,2012 ,35(5):385-395.4Thiyaga