實(shí)驗(yàn)九細(xì)胞骨架觀察

1、實(shí)驗(yàn)九 細(xì)胞骨架觀察( 4 學(xué)時(shí))一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参锛?xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架( cytoskeleton )是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管(MT , 20- 25nm)、微絲(MF , 5 7nm)和中間纖維(IF, 8 11nm)。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔谩９鈱W(xué)顯 微鏡下細(xì)胞骨架的觀察多用 1% Triton X-100 處理細(xì)胞，可使細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和 全部脂質(zhì)被溶解抽提掉， 而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞被保存， 經(jīng)戊二醛固定， 考馬斯 亮蘭 R250 染色后，

2、微管不夠穩(wěn)定，其他類型纖維太細(xì)，無法分辨，只能觀察到由微絲組成 的微絲束(40nm)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑(一) 儀器、用具： 光學(xué)顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片， 染色缸，燒杯。(二) 材料：新鮮洋蔥鱗莖(三) 試劑1) M 緩沖液( pH 7.2)：50mmol/L 咪唑(MW:68.08，3.4g/L)(緩沖劑)50mmol/L KCl(MW:74.55, 3.73g/L)0.5mmol/L MgCl 2 6H20(MW:203.30, 0.1g/L)或 MgCI 2(MW:95.3, 0.05g/L)1mmoI/L EGTA(MW:380.36,

3、0.38g/L) (和 EDTA 敖合 Ca2+,并在 Mg"存在時(shí)，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并較為舒張)0.1mmol/L EDTA (MW:292.25, 0.29g/L)或 EDTA Na2 ( MW:372.24,0.37g/L )1mmol/L DTT(MW:154.3, 0.15g/L)用 1M HCl 調(diào)至 pH7.22) 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液( PBS)(pH7.3)：PB50mlNaCl0.15M蒸餾水 至 1L100ml 0.2 M 磷酸緩沖液( PB)( pH7.3)：0.2 M Na 2HP0477ml 0.2 M NaH 2P0423ml0.2 M

4、Na 2HPO4： Na2HPO4 2H2O (MW : 178.05, 3.561 g/100mL)或 Na2HPO4 12H2O MW： 358.22， 7.164 g/100mL)0.2 M NaH2PO4： NaH2PO4 H2O ( MW : 138.01, 2.76 g/100mL )或 NaH2PO4 2H2O MW： 156.03， 3.12 g/100mL)3) 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于M-緩沖液4) 3% 戊二醛 100mL: 取 50% 戊二醛 6mL ,PBS 94mL考馬斯亮藍(lán)甲醇冰乙酸 蒸餾水R2500.2g( 0.04g/20mL )5) 0.2% 考馬斯亮藍(lán) R250 染液：46.5mL( 9.3ml/20mL )7mL (1.4ml/20mL )46.5 mL( 9.3ml/20mL )四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟燒杯中，使其下沉。(2) 吸去磷酸鹽緩沖液，用1% Trit on I00處理20 30min。(3) 吸去Trit on I00，用M緩沖液洗3次，每次10min。(4) 3%戊二醛固定 0.5 1h。(5) pH7.3磷酸鹽緩沖液洗 2次，每次10min。(6) 0.2%考馬