CFX熒光定量PCR儀操作指南(Bio-rad)

1、CFX96 實(shí)時熒光定量PCR儀操作流程及注意事項(xiàng)開始運(yùn)行儀器打開電腦打開定量PCR儀底座開關(guān)啟動CFX Manager軟件 放置樣品將PCR反應(yīng)體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學(xué)級封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。   設(shè)置程序，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)定量PCR軟件操作基本步驟為：a. 設(shè)置熱循環(huán)程序文件（Protocol Tab）   b.設(shè)置反應(yīng)板文件（Plate Tab）。 C.點(diǎn)擊“Start Run”鍵，運(yùn)行程序熱循環(huán)程序文件（Proto

2、col Tab）設(shè)置指南：點(diǎn)擊Edit（編輯）或 Create New（創(chuàng)建新程序）。反應(yīng)板設(shè)置文件（Plate Tab）設(shè)置指南：選擇本次實(shí)驗(yàn)所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品（Standard），點(diǎn)擊“Dilution Series”鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。點(diǎn)擊“Start Run”鍵。單擊open lid（打開熱蓋）或Close lid（關(guān)閉熱蓋）放置樣品；單擊Start Run，保存文件，開始運(yùn)行程序。 結(jié)果分析PCR反應(yīng)結(jié)束后，軟件會自動計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值等。如需進(jìn)行表達(dá)量分析、等位基因分析等， 在軟件窗口選擇相

3、應(yīng)分析功能。點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報告單  關(guān)閉運(yùn)行儀器實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出反應(yīng)管，順序關(guān)閉CFX Manager軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀器上蓋部分為全自動控制，在通電狀態(tài)，嚴(yán)禁任何人為干涉上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會導(dǎo)致上蓋故障，危及儀器使用。CFX Manager軟件操作快速指南實(shí)驗(yàn)操作程序設(shè)置圖 1顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口中一個預(yù)覽的程序。點(diǎn)擊 Create New，打開程序編輯器創(chuàng)建一個新的程序。點(diǎn)擊 Select Existing，通過瀏覽器加載一個程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。使用 Express Load下拉菜單直

4、接加載一個程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。點(diǎn)擊 Edit Selected，打開程序編輯器編輯所選程序的各個步驟。點(diǎn)擊 Start Run開始運(yùn)行當(dāng)前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來創(chuàng)建一個新程序或編輯一個已存在的程序，圖 2。 1在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會用藍(lán)色高亮顯示），點(diǎn)擊溫度或保持時間進(jìn)行直接編輯。2點(diǎn)擊 Insert Step在程序中增加一個溫度步驟。點(diǎn)擊 Delete Step在程序中刪除選中的步驟。3點(diǎn)擊 Add Plate Read to Step，在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時間。如果當(dāng)前的高亮顯示步

5、驟已經(jīng)進(jìn)行了讀板設(shè)置，則這一選項(xiàng)變?yōu)?Remove Plate Read。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點(diǎn)擊 Remove Plate Read。4點(diǎn)擊 GOTO步驟的重復(fù)次數(shù)，改變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖 2第 4步。點(diǎn)擊 GOTO步驟數(shù)可改變 GOTO循環(huán)中所包含的步驟。增加一個梯度步驟：1在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊 Insert Gradient，圖 2。2對梯度中最低和最高溫度值進(jìn)行編輯，在圖形模式，文本模式下或出現(xiàn)在文本模式右側(cè)的梯度范圍計(jì)算器中直接點(diǎn)擊數(shù)值進(jìn)行編輯，圖 3。 3在梯度范圍計(jì)算器中，對任何一行都可以賦予一個指定的溫度。每行的溫度都會調(diào)整為合適的

6、溫度來滿足指定的溫度范圍。增加熔解曲線：1在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊 Insert Melt Curve，圖 2。2在圖形或文本顯示模式下，點(diǎn)擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖 4第 5步。3點(diǎn)擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間。4點(diǎn)擊保持時間編輯每一個增量溫度的保持時間。CFX Manager軟件數(shù)據(jù)分析快速指南 定量分析數(shù)據(jù)瀏覽擴(kuò)增圖表可以顯示實(shí)驗(yàn)中每個循環(huán)每個孔收集的相對熒光信號曲線。點(diǎn)擊位于擴(kuò)增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖 1。在孔選擇器中點(diǎn)擊孔，行或列來顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖 1。選中的孔是藍(lán)色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標(biāo)置于

7、熒光信號曲線上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電子表格的孔上，或者標(biāo)準(zhǔn)曲線上均可以顯示出相應(yīng)的信息。數(shù)據(jù)分析選項(xiàng) CFX Manager軟件可以自動的扣除從各個孔所得數(shù)據(jù)的基線。從菜單欄中選擇 Settings，選擇Baseline Threshold可以改變基線范圍。軟件會自動計(jì)算基線的位置?？梢渣c(diǎn)擊并拖動閥值線來手動定位。點(diǎn)擊工具欄中View/Edit Plate按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時創(chuàng)建新的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。圖表選項(xiàng)可用鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來復(fù)制或保存圖像，或選擇 Chart Options來改變軸范圍或刪除柵格，圖 2。點(diǎn)擊工具欄中 Trace

8、 Styles按鈕，或鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來設(shè)定制定孔的熒光信號曲線顏色。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任何圖表，向下和拖動光標(biāo)可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中 Select Well Group下拉菜單來瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖 3。軟件可以針對每個分群作為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)來處理，每一個分群可針對自己的設(shè)置進(jìn)行分析，如進(jìn)行自身標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析。定量數(shù)據(jù)分析顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口中 Quantitation Data，瀏覽數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，包括每個孔的閥值（ CT）和平均值以及復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)偏差，圖 4。點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題進(jìn)行基于列的行分類。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格并選擇 Sort可進(jìn)行基于多個列的

9、行分類。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題并向左或向右拖動可以重新排列電子表格中列的順序。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格，選擇數(shù)據(jù)輸出格式如 text，XML或 Excel輸出數(shù)據(jù)，圖 4。從 Quantitation Data下拉菜單中選擇 Plate，在反應(yīng)板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報告顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中 Report按鈕，圖 1，打開 Report窗口，圖 5。點(diǎn)擊報告選項(xiàng)列表中的檢查窗，使制定信息包含在報告中，這些信息在預(yù)覽部分中會有所顯示，圖 5。點(diǎn)擊工具欄中 File并選擇 Save，以 PDF格式保存報告，或選擇Print打

10、印報告。也可以保存報告為其它的文件格式。CFX Manager軟件基因表達(dá)分析快速指南 通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制，您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager軟件來評估樣品之間靶標(biāo)濃度的相對差異。這種應(yīng)用最常用的使用是評估 cDNA樣品中靶標(biāo)的濃度來推斷其 mRNA水平。通常，一個或多個參照基因的含量被用來衡量目標(biāo)基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品取樣的差異。通過生物學(xué)條件的研究，參照基因的表達(dá)水平通常不發(fā)生變化。基因表達(dá)分析設(shè)置圖 1顯示各樣品孔含單一的熒光，四個復(fù)制類群，包含兩個不同靶標(biāo)名稱和兩個不同的樣品名稱。指定參照基因1點(diǎn)擊反

11、應(yīng)板編輯器中 Experiment Settings或 Gene Expression Module，打開實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口，圖 2。 2選擇 Targets。3點(diǎn)擊合適的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標(biāo)。4點(diǎn)擊 Show Analysis Settings檢查窗，為靶標(biāo)設(shè)置反應(yīng)擴(kuò)增效率。5Auto Efficiency檢查窗被默認(rèn)設(shè)定。如果實(shí)驗(yàn)中運(yùn)行一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到的擴(kuò)增效率將在計(jì)算中被使用?；蛘邔线m的靶標(biāo)輸入指定反應(yīng)擴(kuò)增效率值，則計(jì)算中將使用這一擴(kuò)增效率值。指定對照樣本1在 Experiment Settings窗口，選擇&

12、#160;Samples標(biāo)簽。2點(diǎn)擊合適的檢查窗，選擇在計(jì)算中將被作為對照的樣本，圖 3。對每個基因來說，對照樣本的值被指定為 1，同時所有其他樣本相對于對照樣本的值會被顯示出來. 基因表達(dá)分析選擇分析模式1從 Mode下拉菜單中選擇分析模式，圖 4： a. Normalized Expression C（t）-靶標(biāo)基因的相對量可通過樣本的參照基因來進(jìn)行相對量的衡量。b.相對量C（t）-靶標(biāo)基因的相對量不能被衡量；結(jié)果顯示的是實(shí)驗(yàn)中靶標(biāo)基因相對于其他樣品的基因濃度。 圖形選項(xiàng)1 Graph Data下拉菜單中選擇對照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，Graph Data選項(xiàng)默認(rèn)是對照相關(guān)。2 X軸下拉菜單中選擇 X軸以 Sample顯示或 Target顯示。3 Y軸下拉菜單中選擇 Linear，Log2或 Log10作為 Y軸刻度。4 Scaling Option下拉菜單中選擇 Highest，Lowest或 Unscaled。5 Error Type下拉菜單中選擇 Standard Error of the Mean或 Standard De