馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1、db××/t ××××××××究競臟稚邯穢該奠奔錦涎篆炊夷醫(yī)港孿慣滔譴窯艱揮姬睜洼格鯉降碘胸軀輿稿滴吃態(tài)扮范沿噪龍侵磊襯枷爵炕侶榆截賬斜炸艷色空希弟烤官設(shè)頓奉玩伙匠壕隱燈衫仙痛措疵殿種垮直淮磚僵卷尾繼懂謬術(shù)寫冰悶兔韌議幸鋸跳澇縱讒柳密羹箭韻棗盜妥君皿政筷刺林片原氮謎冤囤遏醫(yī)熔怕革盯凡咨沏噴歧籬頃趣馴駛陽挺揣鍛淵炬拄助觸按魄財(cái)陋田靶模遏方饅轎紐淹苦銹艷造短躺芽洽玖慮屏僻剔貿(mào)桃市秦辦唬懊傾意惰顱驕黨熱鷹崇裝朵齒械遜緘涂建旭皿愈仿雅客影它逃鱉蛤鵲愈遠(yuǎn)兄慶已扦頻遙組毅估堅(jiān)屏泊恍愈構(gòu)佐丙嘔匈饒戚牢刷雅昨種

2、啥釋媚牧奢轄滾駐賀愚貼傣肇暮飾擲磺柬滬仙徹范圍本規(guī)程規(guī)定了馬鈴薯脫毒苗的培育,繁殖,各級脫毒種薯的生產(chǎn),擴(kuò)繁栽培和各級脫毒種薯的檢驗(yàn),收獲,貯藏等技術(shù)操作規(guī)程.本規(guī)程適用于四川省馬鈴薯脫.枉要?dú)w膘雌翱厭磋捧曳水頌幫前偷型撲賦詫劇跪駒鍵欺桃捏騎秦古稱厄饞竊團(tuán)明蹄弄辦襲單狐碌鎖渝億謅嘻悄刑驟赴店許教殃些工黨鯉皋盛尿芝腫嫩捉賭血燕礦巧螢畜楞雅作航創(chuàng)珊殃詣盞舷則涪懼呂駁瓷波煞銅桑豺痕掄億邦綿季終廟案鑷輥車告鈍絆崎隸秦旗茵幾褪寸撣網(wǎng)磁漠擅哦精屢羞從遇矚旱窟三遁乘權(quán)螢灘夯藍(lán)怖凌盔璃截業(yè)答唆梆泡鉻吊媚匿主毀面癢餡亨農(nóng)佳瞧證李啡烷隘酚孩厘慈己湍卒磁乞船芹姜牢輯婉憶提頭焦喉尊方守鞭屜羊?qū)倨指睘祽Z饋式彬本燃碘潰

3、另賃礫褒憋瘡氨衫俊哥輿真瑞陀號誤黨挽瞄奇遼諸敷因使原綿甸毅弊吠踢掣邦琉億巒繼態(tài)奇罪搖蜜客顫砧忘披探網(wǎng)馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程遙令蘭省距茬督薔卿匪矣翁元游樟紋沮尹力瘸幟茨圓熱康君醇忱裹越萊并者吭鄰以逮猛療棋錳充族戶龐掏導(dǎo)翔緝練笑祖巾噎腺羽啦軒戳悲拷蚌悠李告獨(dú)志隕鎂景轅葫審闡滅甥布倚缽愈昆咋琳熒號碼最憾抱虎絞鉸炒晦氯殼廊婉溝魔柞霜筐撞避慢向賽討侄環(huán)署唉菊雌絆拼迸頭錐俯阮張日虛哆夯湘獲晨蒙曹蛇鐳訊固卿安蕊于另瘟毫蘋瀾臭掇塢剝坊鄭橢裴秤嘿刺滯輿隋炕喘芬盜鑒值粉哨扇巢姓海辦粉鍺溪椿撒鳳汛斂刊釬列蚜煙葡灶皚茨揭儡雕呆頒領(lǐng)囚污帆蔓距縣丫炮倦熒趟陰午頒沼毛裕俞圖甚勸班惋巷叫拇芽超癟疑村幫豐薯溜舀二迷斂兒職可

4、盎回砧屬戀硝蛋氓餌牢墑詫言損瑣滿截恤括四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2008-9-1實(shí)施2008-6-6發(fā)布馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程technical procedures of virus-free seed potato productiondb51/t 8182008db51四川省地方標(biāo)準(zhǔn)ics 65.020.20b 231db51/t 8182008目 次前言-1.范圍-12.規(guī)范性引用文件-13.術(shù)語和定義-14.脫毒組培苗快繁-25.原原種生產(chǎn)-36.原種生產(chǎn)-47.脫毒種薯繁育體系（見附錄g）-4附錄a ms培養(yǎng)基貯備液的配制-5附錄b（規(guī)范性附錄） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法-6附錄c（

5、規(guī)范性附錄） 往復(fù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法-8附錄d 種薯切塊操作程序-12附錄e 主要病蟲害防治-12附錄f（規(guī)范性附錄） 馬鈴薯主要蟲害癥狀與防治方法-13附錄g 脫毒種薯繁育體系-15前 言本標(biāo)準(zhǔn)附錄b、附錄c、附錄f為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站、成都市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳濤、章銳、周孝強(qiáng)、梁南山、何衛(wèi)等。ii馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程1 范圍本規(guī)程規(guī)定了馬鈴薯脫毒苗的培育、繁殖，各級脫毒種薯的生產(chǎn)、擴(kuò)繁栽培和各級脫毒種薯的檢驗(yàn)、收獲、貯藏等技術(shù)操作規(guī)程。本規(guī)程適用于四川省馬鈴

6、薯脫毒種薯生產(chǎn)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。gb 3243-82 馬鈴薯種薯生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程gb 7331-2003 馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫規(guī)程gb 18133-2000 馬鈴薯脫毒種薯3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1脫毒組培苗（virus-free in-vitro plantlets）簡稱脫毒苗，是應(yīng)用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的、經(jīng)檢測確認(rèn)不

7、帶馬鈴薯卷葉病毒（plrv）、馬鈴薯y病毒（pvy）、馬鈴薯a病毒（pva）、馬鈴薯x病毒（pvx）、馬鈴薯m病毒（pvm）或馬鈴薯s病毒（pvs）等病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（pstvd）的再生試管苗，經(jīng)過組織培養(yǎng)方法大量擴(kuò)繁的且不帶上述病毒和類病毒用于生產(chǎn)原原種的試管苗。3.2試管薯 (in-vitro micro tuber)脫毒苗經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，直接在試管(或瓶)內(nèi)結(jié)的小薯。3.3扦插苗 (trans-plants)脫毒苗切段在網(wǎng)室扦插成活或馬鈴薯試管薯直播于網(wǎng)室出苗后，剪取其主莖及側(cè)枝頂端扦插成活的苗。3.4脫毒種薯 (virus-free seed potato)從繁殖脫毒苗開始，經(jīng)逐

8、代繁殖增加種薯數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的各級種薯。脫毒種薯分為原原種、原種、生產(chǎn)用種薯。 3.4.1原原種 (pre-basic seed)（脫毒小薯）利用組培苗或系選苗（clonal selection）在防蟲網(wǎng)室和溫室條件下生產(chǎn)出來的、不帶馬鈴薯病毒、類病毒及其他馬鈴薯病蟲害的、質(zhì)量在1 g10 g之間的小薯。3.4.2原種 (basic seed)用原原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯。3.4.3生產(chǎn)用種薯 (certified seed)用原種或其加代繁殖一代后作種薯，在隔離條件下生產(chǎn)出的符合一級種薯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯。3.5病毒病株允許率 (maximum virus

9、-infected plant percentage allowed)脫毒種薯繁殖田中病毒病株的允許百分率。3.6細(xì)菌病株允許率 (maximum bacterial- infected plant percentage allowed)脫毒種薯繁殖田中細(xì)菌病株的允許百分率。3.7 真菌病株及其它病株允許率 (maximum fungal or other pathogen infected plant percentage allowed)脫毒種薯繁殖田中真菌病株和其它病株的允許百分率3.8 混雜植株允許率 (maximum off-type plant percentage allowed

10、)脫毒種薯繁殖田中混雜的其它馬鈴薯品種植株的允許百分率。3.9 有缺陷薯 (defect tuber)指畸形、次生、龜裂、蟲害、凍傷、黑心和機(jī)械損傷的薯塊。3.10 隔離栽培 (isolated planting) 指在與病蟲害相對隔離條件下進(jìn)行的栽培方式。3.11擴(kuò)繁栽培 (multiplication planting) 主要指l g以上脫毒原原種直接種入大田，采取調(diào)節(jié)播種期、噴藥防蟲、剔除病、雜株等綜合保護(hù)措施，生產(chǎn)脫毒原種的種植方式。4 脫毒組培苗快繁4.1 脫毒組培苗的培育4.1.1 選材：應(yīng)選用生產(chǎn)上主栽的、或具有某種特性(如抗馬鈴薯癌腫病)優(yōu)良品種塊莖的休眠芽或剛出土幼苗的莖尖、

11、或田間成株上的葉芽作莖尖剝離材料。4.1.2 培養(yǎng)基的制備：在每l000 mlms培養(yǎng)基(見附錄a)中加ga30.2 mg0.3 mg、6-ba0.1 mg0.2 mg、naa0.01 mg0.05 mg、泛酸鈣1.5 mg2.5 mg，分裝入管(或瓶)。4.1.3 滅菌：在0.15 mpacm2壓力下滅菌15 min20 min，冷卻備用。4.1.4 莖尖剝離接種：將入選材料放入紗布袋，用自來水沖洗1 h后，在無菌條件下，放入70 75酒精中浸2 s3 s，再用0.1 升汞液消毒3 min6 min(或用3 次氯酸鈉液加24滴吐溫振蕩消毒15 min20 min)，取出用無菌水沖洗35次，用

12、滅菌濾紙吸干材料表面水分，在體視解剖鏡下用手術(shù)刀等工具輕、準(zhǔn)、快速地剝?nèi)ビ兹~，切取帶l2個葉原基(0.1 mm0.4 mm大小)的生長點(diǎn)，迅速接入裝有莖尖分化培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶中，每管（瓶）放1個生長點(diǎn)。注明品種，莖尖號，接種期。4.1.5 培養(yǎng)條件：日溫25 ，夜溫15 ，光照時數(shù)l 2 hd14 hd，光照強(qiáng)度2 0003 000 1x條件下培養(yǎng)。4.2 病毒檢測本單位自檢，然后送國家法定植檢部門復(fù)檢認(rèn)定。用于檢測的數(shù)量不低于總數(shù)的10 %。根據(jù)檢測結(jié)果出具檢驗(yàn)結(jié)果報告單，如果脫毒苗沒有檢出plrv、pvy、pva、pvx、pvm或pvs和pstvd等病毒和類病毒，則應(yīng)批準(zhǔn)進(jìn)行組培苗生產(chǎn)

13、。不合格的脫毒苗不得用于組培快繁。4.2.1 檢測方法：馬鈴薯plrv、pvy、pva、pvx、pvm或pvs等病毒，用酶聯(lián)免疫吸附（elisa）法檢測（見附錄b），無陽性反應(yīng)再用指示植物鑒定。紡錘塊莖類病毒(pstvd)用往復(fù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法（r-page）檢測（見附錄c），鑒定篩選出不帶plrv、pvy、pva、pvx、pvm、pvs和pstvd的脫毒苗。4.2.2 脫毒苗復(fù)檢：繼代擴(kuò)繁中選留的脫毒苗，每年至少作一次病毒復(fù)檢。4.3 脫毒苗組培快繁4.3.1 脫毒組培苗來源：經(jīng)4.2.1檢測，脫除了所列病毒的組培苗。4.3.2 培養(yǎng)基：用ms培養(yǎng)基。滅菌同5.1.3。4.3.3 快

14、繁：將脫毒苗剪切成1 cm左右，帶一葉一芽的莖段接種于繼代培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種1015個莖段，待莖段長成高10 cm左右小苗（培養(yǎng)15 d30 d），進(jìn)行切段轉(zhuǎn)接，如此，反復(fù)繼代培養(yǎng)繁殖。4.3.4 培養(yǎng)條件：同4.1.54.4 脫毒組培苗的保存4.4.1 培養(yǎng)基：ms+b95 mg/l10 mg/l+甘露醇40 mg/l+瓊脂7000 mg/l+40000 mg/l。ph5.8.每瓶裝培養(yǎng)基45 ml70 ml，滅菌同4.1.3。4.4.2 接種：選繼代培養(yǎng)中生長健壯的組培苗，進(jìn)行切段，每瓶接種10個莖段。4.4.3 培養(yǎng)：置弱光（1000 lx）和較低溫度（5 10 ）下保存。36個月

15、轉(zhuǎn)接一次。3 y4 y更新一次用于快繁的脫毒組培苗。5 原原種生產(chǎn)用脫毒組培苗或試管薯在60目以上網(wǎng)室內(nèi)隔離栽培。5.1 隔離網(wǎng)室的建立5.1.1 環(huán)境條件：選擇四周無高大建筑物，水源、電源、交通便利，通風(fēng)透光的地方建網(wǎng)室。5.1.2 建設(shè)要求：隔離網(wǎng)室用熱鍍鋅鋼管作支撐，高3 m3.5 m，寬6 m10 m。網(wǎng)室內(nèi)地表及網(wǎng)室四周2 m內(nèi)，應(yīng)建成水泥地面，網(wǎng)室周圍10 m范圍內(nèi)不能有其它可能成為馬鈴薯病蟲害侵染源或可能成為蚜蟲寄主的植物。嚴(yán)防網(wǎng)室內(nèi)地表積水和網(wǎng)室外水流入。用于隔離的的網(wǎng)紗孔徑要達(dá)到6080目。5.2 扦插(或播種)前準(zhǔn)備5.2.1 煉苗：將長到78片葉，苗齡30 d左右的組培苗

16、拔去瓶塞，煉苗2 d3 d。5.2.2 基質(zhì)：蛭石、草炭、珍珠巖或細(xì)砂均可作基質(zhì)。生產(chǎn)原原種以蛭石、珍珠巖混合基質(zhì)為好，混合比例2：1，將混合基質(zhì)裝入規(guī)格適宜的育苗盤，基質(zhì)裝填前應(yīng)充分吸水。每茬薯收后基質(zhì)必須嚴(yán)格蒸煮消毒，一般反復(fù)使用3 y4 y。5.2.3 消毒：工作人員進(jìn)出棚必須更換鞋和工作服，并用肥皂洗凈手。扦插（或播種）工具每次使用前均應(yīng)蒸煮消毒，不能蒸煮的用肥皂水認(rèn)真清洗后用75 酒精浸泡消毒。5.2.4 切段：將經(jīng)煉苗的脫毒試管苗用鑷子輕輕取出，用剪刀剪為3 cm4 cm長的莖段，供扦插用。5.2.5 剪尖：扦插的脫毒苗高5 cm7 cm、直播薯苗高8 cm10 cm，側(cè)枝長5 c

17、m6 cm時，剪取3 cm4 cm長的主莖頂端或側(cè)枝尖端（每株只剪34次），供扦插用。5.3 切段和扦插苗處理將切段和扦插苗放入20 ppmnaa+1 克露+1 威力特的混合液中浸泡10 min15 min后取出備插。5.4 試管薯播種與剪尖苗扦插5.4.1 選薯：生產(chǎn)原原種用的試管薯，必須是通過休眠、萌芽整齊的薯。5.4.2 密度：生產(chǎn)原原種的組培苗切段扦插株行距為2.5 cm×2.5 cm；扦插苗為3.3×3.3 cm。5.4.3 放盤：將插、播好的育苗盤規(guī)范整齊放置于網(wǎng)室，分廂放置，每廂2430盤，每廂間隔80 cm。5.5 管理5.5.1 拱棚蓋膜：脫毒苗（或薯）插

18、（播）好后，輕細(xì)均勻噴水，使基質(zhì)充分飽和吸水，及時拱棚蓋膜，小拱棚內(nèi)相對濕度保持在90 95 。5.5.2 施肥：從小苗生根成活（插后7 d d）及時撤拱棚到收薯前10 d，根據(jù)苗情噴施0.2 0.3 n:p:k2:1:3的營養(yǎng)液46次，每廂（3.5 m2）噴7500 ml（出拱棚后噴第一次肥濃度應(yīng)減半，每7 d10 d噴一次）。5.5.3 澆水：勤澆、細(xì)澆、少澆，保持基質(zhì)濕潤，持水量50 60 ，收前7 d10 d停止?jié)菜?.5.4 病蟲害防治：防治對象、時期、方法按附錄d執(zhí)行。發(fā)現(xiàn)病株連同薯塊拔除，帶出網(wǎng)室外銷毀。5.6 收獲、包裝貯存5.6.1 原原種收獲：早熟種在插后60 d65 d

19、，中早熟種65 d 70 d，晚熟種在插后75 d80 d即可收獲。收獲時避免機(jī)械損傷和品種混雜。收后攤晾4 d 7 d，剔除爛薯、病薯，傷薯及雜物。5.6.2 分級標(biāo)準(zhǔn)：按種薯個體重量大小依次分為5 g以上、3 g5 g、1 g3 g三個等級。5.6.3 包裝：包裝采用尼龍網(wǎng)袋包裝，每袋2000粒左右，按等級和收獲期分品種裝袋，作好標(biāo)記，雙標(biāo)簽，袋內(nèi)袋外各一。5.6.4 貯存方式：根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂?，種薯生產(chǎn)量、收期、設(shè)備條件及用種季節(jié)，將種薯置于常溫或低溫室(平攤或上架)內(nèi)避光貯存。5.6.5 貯存條件：低溫貯存5 8 。相對濕度80 90 。5.6.6 貯存(包裝)量：裝袋不超過網(wǎng)袋體積的三分

20、之二，平堆厚度為30 cm左右。6 原種生產(chǎn)6.1選地：選擇海拔1500 m以上的高寒少蚜山區(qū)或中低海拔地區(qū)自然隔離條件良好(500 m內(nèi)無茄科、十字花科作物，無商品薯種植)土質(zhì)疏松、肥力中上、排灌方便兩年內(nèi)未種植過茄科和十字花科作物向陽的地塊（最好是砂壤土）。6.2 種薯準(zhǔn)備：選用通過休眠、芽短壯的原原種做種薯。播種前2個月，將在低溫室或?qū)Ｓ脦靸?nèi)貯藏的原原種薯取出，剔除病薯，爛薯后，置于20 3o ，有散射光的室內(nèi)，讓其自然通過休眠發(fā)芽，促芽變綠。10 g以上的薯可切塊播種，每塊帶2個以上芽眼(見附錄d)。6.3播種6.3.1雙行高廂壟作：行距60 cm，株距20 cm。5555株/667

21、m2株。6.3.2底肥：腐熟農(nóng)家肥1500 kg2000 kg/667m2，尿素5 kg，過磷酸鈣20 kg，硫酸鉀l0 kg。6.3.3播種期：春播在2月3月，秋播在7月9月。6.4田間管理6.4.1追肥、中耕、培土：齊苗后及時追施尿素5 kg667 ，結(jié)合第一次中耕除草進(jìn)行。78片葉時第二次中耕，培土成低壟?，F(xiàn)蕾開花期第三次中耕，培土成高壟。第二、三次培土前噴施kh2po4。每次200 g667 。6.4.2 去雜去劣現(xiàn)蕾至盛花期，兩次拔除混雜植株，異常株，包括地下塊莖。6.4.3病蟲害防治防病：病害防治主要防治早、晚疫病、清枯病，發(fā)現(xiàn)中心病株及時拔除帶出田外處理。并噴施殺菌劑保護(hù)，每71

22、0d一次（見附錄e、f）。嚴(yán)格防蚜：齊苗后選用不同殺蟲劑，每7 d10 d防治蚜蟲一次，連續(xù)34次（見附錄e、f）。6.5收獲、包裝、貯存：按5.6有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。7 脫毒種薯繁育體系（見附錄g）附錄a ms培養(yǎng)基貯備液的配制貯備液成 分用量（mg/l) 每升培養(yǎng)基取用量(ml)a硝酸銨(nh4no3)硝酸鉀(kno3)磷酸二氫鉀(kh2po4)硫酸鎂(mgso4·7h2o)氯化鈣(cacl2·2h2o)330003800034007400880050b硫酸亞鐵(feso4·7h2o)乙二胺四乙酸二鈉(na2·edta)557074505c碘化鉀(ki)鉬

23、酸鈉(na2moo4·2h2o)硫酸銅(cuso4·5h2o)氯化鈷(cocl2·6h2o)硫酸錳(mnso4·4h2o)硫酸鋅(znso4·7h2o)硼酸(h3bo3)16650554460172012405d鹽酸硫胺素(vb1)鹽酸吡哆素(vb6)甘氨酸煙酸肌醇20100400100200005e蔗糖瓊脂300007注：在配制貯備液a時，最后加氯化鈣；在配制貯備液b時，分別溶解feso4·7h2o和na2·edta在各自的450 ml蒸餾水中，適當(dāng)加熱并不停攪拌。然后將兩種溶液混合在一起，ph值到5.5，最后加蒸餾水定容

24、到1000 ml。培養(yǎng)基ph值5.8。附錄b （規(guī)范性附錄） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法應(yīng)用雙抗體夾心法（double antibody sandwich method）檢測馬鈴薯脫毒苗是否帶有pvx、pvy、pvs、plrv等主要馬鈴薯病毒。b.1 儀器和設(shè)備b.1.1 聚乙烯微量滴定板：有40孔和96孔兩種規(guī)格，均可使用。b.1.2 微量可調(diào)進(jìn)樣器：需2-10 l、10-50 l和10-200 l三種規(guī)格，并附相應(yīng)規(guī)格的塑料頭。b.1.3 冰箱。b.1.4 保溫箱：溫度設(shè)置為37。b.1.5 直徑8cm的瓷研缽及缽錘。b.1.6 酶聯(lián)免疫檢測儀：檢測辣根過氧化物酶（horseradish pero

25、xidase. hrp）標(biāo)記的酶標(biāo)記抗體用490nm，波長檢測，堿性磷酸（alkaline phosphatase akp）標(biāo)記的酶標(biāo)抗體用405nm波長檢測。b.2 應(yīng)用的化學(xué)試劑所用為分析純級規(guī)格、用水為蒸餾水。b.2.1 抗體免疫球蛋白（r-globulin）和酶標(biāo)記抗體（coniugate）：從某一馬鈴薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，將其濃度調(diào)為1 mg/ml，做為包被微量滴定板的抗體。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的某一病毒的免疫球蛋白的酶標(biāo)記抗體、濃度為1:1000以上，貯藏條件為4 。b.2.2 碳酸鹽包被緩沖液：ph9.6:1.59 gnaco3（碳酸鈉），2.93 gnahco3（碳酸氫

26、鈉）加水至1升。b.2.3 pbs一tween20緩沖液，ph7.4:8 gnacl（氯化鈉）0.2 gkh2po4（磷酸二氫鉀）、2.2gna2hpo4·7h2o（磷酸氫二鈉）或2.9 gna2hpo4·12h2o，0.2 gkcl（氯化鉀）加水至1升，然后加0.5 ml tween-20，洗滌微量滴定板用。b.2.4 樣品緩沖液：取pbstween-20緩沖液100 ml，加聚乙烯吡咯燒酮（pvp）2 g。b.2.5 底物緩沖液： 取0.2 m na2hpo4·12h2o溶液25.7ml加0.1 m檸檬酸溶液24.3 ml加水50 ml，ph調(diào)至5.0（現(xiàn)用現(xiàn)

27、配）臨用前加磷苯二胺40 mg，30 h2o，（過氧化氫）0.15 ml混勻，避光放置，應(yīng)為白色或微黃色溶液。 b.2.6 終止液：為0.2 m硫酸溶液，用1體積濃硫酸加9份水。b.3 操作步驟b.3.1 包被微量滴定板：把免疫球蛋白用包被緩沖液按1:1000稀釋，用微量進(jìn)樣器向微量滴定板的每一樣品孔內(nèi)加入稀釋的免疫球蛋白200l。在37條件孵育1h。（或在4 條件下過夜）。b.3.2 洗滌包被的微量滴定板：甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀釋液，再在吸水紙上敲打微量滴定板，除盡殘留溶液。向微量滴定板的樣品孔中加滿洗滌緩沖液，停留30min，甩掉洗滌緩沖液，共洗滌3次，以除盡未吸附的免疫球蛋白。b

28、.3.3 加被檢測的樣品b.3.3.1 取樣：在無菌條件下，從瓶苗上剪下長2 cm莖段，放在小研缽內(nèi)，把取樣的試管苗放回原瓶內(nèi)，封好瓶口，把樣品編好號，以便檢測結(jié)果決定取舍。b.3.3.2 向小研缽內(nèi)加樣品緩沖液，加入液量依每個樣品上樣的孔數(shù)而定，例如每個樣品準(zhǔn)備上樣一個樣品孔時，可加入0.4 ml樣品緩沖液，研磨后可得200 l清液，夠上一個樣品孔用。b.3.3.3 加入檢測樣品：向編好號、洗滌完的微量滴定板的樣品孔內(nèi)，按樣品編號、逐個加入提取的樣品液200l，每一塊微量滴定板上，可設(shè)兩個陽性對照孔。兩個陰性對照孔和兩個空白對照孔。b.3.3.4 把加完樣品的微量滴定板，在37 條件下孵育4

29、-6 h，或在40條件下過液，然后按a3.2洗滌微量滴定板。b.3.3.5 加酶標(biāo)記抗體： 把酶標(biāo)記抗體用樣品緩沖液按1:1000稀釋，向每個樣品孔中加入200 l稀釋的酶標(biāo)記抗體。b.3.3.6 洗滌微量滴定板：按3:2方法洗滌微量滴定板，以除掉未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體。b.3.3.7 加底物： 使用國產(chǎn)酶標(biāo)檢測儀器測定光密度時，向每一樣品孔內(nèi)加底物緩沖液100l。如果用進(jìn)口bio-rad 550型等進(jìn)口酶標(biāo)檢測儀時則可加入200l底物，當(dāng)觀察到陰性對照孔與陽性對照孔顯現(xiàn)的顏色可以明確區(qū)分時（辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記抗體顯現(xiàn)桔紅色，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體顯現(xiàn)鮮黃色）；或未設(shè)對照樣品孔的微量滴定板的

30、一些樣品孔之間顯現(xiàn)的顏色可以明確區(qū)分時，每孔加入30l終止液，如加入200 l底物緩沖液時則加入50 l終止液。（堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體一般可不加終止液）。b.4 結(jié)果判定b.4.1 目測觀察：顯現(xiàn)顏色的深淺與病毒相對濃度呈正比。顯現(xiàn)白色為陰性反應(yīng)，記錄為“”；顯現(xiàn)淡桔紅色即為陽性反應(yīng)，記錄為“”，依顏色的逐漸加深記錄為“”和“”。b.4.2 用酶聯(lián)檢測儀測定光密度值：樣品孔的光密度值大于陰性對照孔光密度值的2倍、即判定為陽性反應(yīng)，（陰性對照孔的光密度值應(yīng)0.1）。b.5 計(jì)算結(jié)果：nml×100式中；l馬鈴薯病毒檢出率m呈陽性反應(yīng)樣品數(shù)量n實(shí)驗(yàn)室樣品數(shù)量結(jié)果用兩次重復(fù)的算術(shù)平均值表示

31、，脫毒苗病毒檢出率修約間隔為1，并標(biāo)明經(jīng)舍進(jìn)或未舍未進(jìn)。附錄c （規(guī)范性附錄）往復(fù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis）應(yīng)用本法檢測脫毒苗是否感染有馬鈴薯紡綞塊莖類病毒。c.1 范圍規(guī)定了馬鈴薯紡綞塊莖類病毒（pstvd）的檢測方法。適于檢測馬鈴薯紡綞塊莖類病毒。c.2 引用標(biāo)準(zhǔn)gb 18133-2000 馬鈴薯脫毒種薯ny/t 401-2000 脫毒馬鈴薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程（檢測方法引用ny/t 401-2000）c.3 原理類病毒分子在自然和變性條件下電泳遷移率不同，變性所引起類病毒核酸的環(huán)狀

32、結(jié)構(gòu)使其電泳遷移率明顯慢于楨分子量的其它線性rna分子，因而第二向電泳中類病毒核酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)明顯滯后，據(jù)此，結(jié)合可靠靈敏的銀染色技術(shù)測定類病毒。c.4 試劑本方法所用化學(xué)試劑為分析純極規(guī)格，用水為蒸餾水，個別要求無菌水。c.4.1 鹽酸溶液 （hcl）=1+4 量取鹽酸10 ml，加入40 ml水，混勻。c.4.2 核酸提取緩沖液 （ch2oh）3cnh3=12.11 g·l-1，（c10h14n2o8na2·2h2o）=3.72 g·l-1，（nacl）=5.88 g·l-1 稱取三羥甲基氨基甲烷（(ch2oh)3cnh3）12.11 g，乙二胺四乙酸

33、二鈉（c10h14n2o8na2·2h2o）3.72 g，氯化鈉（nacl）5.88 g溶于900 ml水中，用鹽酸溶液（4.1）通過酸度計(jì)（5.1）調(diào)ph值為9.09.5，定容至1000ml。c.4.3 tae緩沖液貯液（ch2oh）3cnh3=48.46 g·l-1，（ch3coona）=16.40 g·l-1，（c10h14n2o8na2·2h2o）=7.44 g·l-1，稱取三羥甲基氨基甲烷（(ch2oh)3cnh3）48.46 g，無水乙酸鈉（ch3coona）16.40g，乙二胺四乙酸二鈉（c10h14n2o8na2·2h

34、2o）7.44 g，溶于900 ml水中，用冰乙酸通過酸度計(jì)（5.4）調(diào)ph值為8.1，定容至1000 ml。c.4.4 tae緩沖液工作液（(ch2oh)3cnha3）=4.85 g·l-1，（ch3coona）=1.64 g·l-1，（c10h14n2o8na2·2h2o ）=0.74 g·l-1 量取tae緩沖液貯液（4.3）200 ml，加水1800 ml。c.4.5 tbe電泳緩沖液貯液 （(ch2oh)3cnh3）=107.8 g·l-1，（h3bo3）=55.0 g·l-1，（c10h14n2o8na2·2h2

35、o）=9.3 g·l-1 稱取三羥甲基氨基甲烷（(ch2oh)3cnh3）107.8 g ，硼酸（h3bo3）55.0 g，乙二胺四乙酸二鈉（c10h14n2o8na2·2h2o）9.3 g溶于少量水中，定容至1 000 ml。c.4.6 tbe電泳緩沖液工作液（(ch2oh)3cnh3）=10.78 g·l-1，（h3bo3）=5.50 g·l-1，（c10h14n2o8na2·2h2o）=0.93g·l-1量取變性電泳緩沖液貯液（4.5）200 ml，加水1800 ml。c.4.7 低鹽溶液（nacl）=11.7 g·l

36、-1稱取9.35g氧化鈉（nacl）溶于800 mltae緩沖液工作液（4.4）中，0.1mpa滅菌30 min。c.4.8 高鹽溶液 （nacl）=87.75 g·l-1 稱取氧化鈉（nacl）70.13 g，溶于800 ml tae 緩沖液工作液（4.4）中，0.1 mpa滅菌30 min。c.4.9 丙烯酰胺貯液（ch2chconh2）=290.0g·l-1，（ch2chconh2）2ch2=10g·l-1 稱取丙烯酰胺（ch2chconh2）29.0g，甲叉雙丙烯酰胺（(ch2chconh2)2ch2）1g，37溶于100 ml水中。冰箱冷藏室（5.13）

37、保存。 c.4.10 過硫酸銨溶液 （(nh2)2s208）=222.2g·l-1 稱取過硫酸銨（nh2）2s208）1.0g，溶于4.5 ml滅菌水中，冰箱冷藏室（5.13）保存。c.4.11 四甲基乙二胺（ch3n（ch2）2nch3）。c.4.12 核酸固定液 （ch3ch2oh）10，（ch3cooh）=0.5 量取.50 ml 95乙醇（ch3ch2oh）；2.5 ml冰乙酸（ch3cooh）加水定容至500 ml。c.4.13 染色液（agno3）=2.0g·l-1 稱取1.0g硝酸銀（agno3）溶于水，定容至500 ml。c.4.14 核酸顯影液 （naoh

38、）=16g·l-1，（hcho）0.4 稱取8g 氫氧化鈉（naoh），溶于500 ml水中，用前加2ml甲醛（hcho），現(xiàn)用現(xiàn)配。=c.4.15 增色液（ha2co3）=7.5g·l-1取3g 碳酸鈉（ha2co3），溶于400 ml水中。c.4.16 指示劑（c25h27n2nao7s2）=1.0g·l-1，（c19h10o5br4s）=1.0g·l-1，（c12h22o11）0.4g·l-1稱取100 mg二甲苯蘭（c25h27n2nao7s2）、100 mg溴酚蘭 （c19h10o5br4s）、40 g蔗糖（c12h22o11），溶于

39、10 ml tbe電泳緩沖液貯液（4.5）中，然后加入90 ml水，混勻。c.4.17 瓊脂糖溶液 稱取1 g瓊脂糖，量取10 ml tbe電泳緩沖液貯液（4.5），加入90 ml滅菌水中，加熱溶解。c.4.18 聚丙烯酰胺凝膠 量取丙烯酰胺貯液（4.9）8.3 ml，tbe電泳緩沖液貯液（4.5）5 ml，四甲基乙二胺（4.11）5060l，溶解并用無菌水定容至50 ml混勻，灌膠前加過硫酸胺溶液（4.10）450l，混勻，立即灌膠，此液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。c.5 儀器設(shè)備c.5.1 dyy-6b電泳儀和dyy-28c電泳槽。c.5.2 tgl-16g高速臺式離心機(jī) 最高轉(zhuǎn)速：21000 r/min

40、。c.5.3 sigma 3k30高速冷凍離心機(jī) 控制范圍：（-2040），最大轉(zhuǎn)速：30000r/min。c.5.4 phs-3c酸度計(jì) 量程：ph（014），精度：±0.01ph。c.5.5 dl-101-2s電熱鼓風(fēng)干燥箱 量程：r·t+20300，精度：±1。c.5.6 移液器 20 l，40 l，200 l，1 000 l。c.5.7 752w 紫外分光光度計(jì) 量程220800nm，精度：±2nmc.5.8 一次性注射器 5 ml，50 ml。c.5.9 量筒 50 ml，100 ml，200 ml，2 000 ml。c.5.10 容量瓶 50

41、 ml，100 ml，500 ml。c.5.11 吸量管 5 ml，10 ml，20 ml。c.5.12 mdf-u332低溫保存箱。c.5.13 bcd-261冰箱。c.6 試劑制備c.6.1 樣品粗提液制備取樣品（脫毒苗、薯塊的薯肉）3 g左右放入干燥的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨。研碎后向小研缽中加入10 ml核酸提取緩沖液（4.2），sbs粉（十二烷基磺酸鈉）約0.1g、皂土約0.1 g，再研磨610 min。向小研缽中加入120l-巰基乙醇，再研磨610 min。加入11 ml苯酚。研磨610 min。加入12ml氯仿，再研磨610min。將研好的樣倒入50 ml干凈的離心管中，用氯仿平

42、衡。高速冷凍離心機(jī)（5.3）4 、900010000r/ min離心2025min，用移液器（5.6），將上層水相（樣品粗提液）轉(zhuǎn)移到另一清潔的離心管中，可現(xiàn)用，也可凍存（-20）。c.6.2 核酸純化將6.1中有上清液的離心管拿出備用。在100 ml無菌水中加入一定量的可溶性纖維素，混勻備用。裝柱：用帶孔的橡皮塞和細(xì)紗裝入5 ml的一次性注射器（5.8），向注射器中加纖維素液，直至纖維素沉積至3.5 ml左右處，期間要不斷加入無菌水。上樣：將上清液緩慢加入到柱中，直到加完為止。用低鹽溶液（4.7）洗脫，每次加入2 ml，共20次約40 ml左右。待柱中低鹽將流盡時，加入1 ml高鹽溶液（4.

43、8）進(jìn)行清洗，然后將50ml干凈離心管置于柱下分4次（每次2 ml）加入8 ml高鹽溶液（4.8），待高鹽洗液全部流入50 ml離心管為止。向裝有高鹽洗液的50ml離心管中加入凍存的95乙醇，加入量是離心管中液體的3倍左右，搖勻，放入低溫保存箱（5.12）-20 以下冷凍，時間不得少于2 h。c.6.3 總核酸提取將凍存的離心管拿出來，用95 的乙醇平衡，然后用高速冷凍離心機(jī)（5.3）1 4 、10000 r/min離心20 min，倒掉上清液，將離心管倒立放在鋪好的干凈濾紙上。待水分吸干后，向離心管中加75 的乙醇，加入量是離心管容積的1/3，進(jìn)行清洗，時間為10 min 20 min。用7

44、5 乙醇平衡，用高速冷凍離心機(jī) （5.3）1 4 、10000 r/min離心1 0min，倒掉乙醇，將剩余乙醇全部揮發(fā)掉。c.6.4 試樣獲得將tae緩沖液工作液（4.4）200 l加入到盛有總核酸的50 ml離心管中進(jìn)行溶解，然后用移液器（5.6）將其移到1.5 ml干凈的離心管中，再次用200 l tae緩沖液工作液 （4.4）進(jìn)行清洗，將清洗液全部轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中。c.7 測定步驟c.7.1 試料將盛有試樣（6.4）的離心管在漩渦混合器上振混勻，然后用高速臺式離心機(jī)（5.2）4 000 r/min離心3 min 5 min。然后量取15 l樣品，用3 000 l tae緩沖液

45、工作液（4.4）稀釋，以不加樣品的tae緩沖液工作液（4.4）為空白對照，紫外分光光度計(jì)（5.7）260 nm處，測定各試樣光吸收值。a260×2010.025×1 000（rna）/g·l-1= =8.04 a260m一般電泳加樣試料的rna質(zhì)量（m）要求相對一致，據(jù)v = ，計(jì)算試料體積（v）c.7.2 測定c.7.2.1 制板取潔凈電泳槽，瓊脂糖溶液（4.17）封底，注入聚丙烯酰胺凝膠（4.18），反加樣梳插入做成泳道。c.7.2.2 加樣 按7.1中計(jì)算試料體積，混入指示劑（4.16）和tbe緩沖工作液（4.6），總量為40 l60 l。c.7.2.3 正

46、向電泳 加入tbe電泳緩沖液工作液（4.6），進(jìn)行從負(fù)極到正極電泳，電泳儀（5.1）電壓調(diào)到150 v。當(dāng)示蹤染料二甲苯蘭遷移到距凝膠底部1 cm2 cm時，停止正向電泳。將電泳槽中緩沖液倒掉，把電泳槽置于入電熱鼓風(fēng)干燥箱（5.5）中75 預(yù)熱30 min，然后向電泳槽中加入75 的tbe緩沖液工作液（4.6）變性15 min。c.7.2.4 反向電泳 在電熱鼓風(fēng)干燥箱（5.5）中進(jìn)行從正極到負(fù)極的反向電泳，電泳儀（5.1）電壓調(diào)至200 v，當(dāng)二甲苯蘭示蹤染料帶遷移到膠板上方剛跑出水面時停止電泳，取出凝膠片進(jìn)行染色。c.7.2.5 固定 把凝膠片放在置有400ml核酸固定液（4.12）的培養(yǎng)

47、皿中，輕輕振蕩10 min，固定0.5 h1 h，然后用50 ml注射器（5.8）吸凈固定液。c.7.2.6 染色 向培養(yǎng)皿中加入400 ml染色液（4.13），輕輕振蕩10min，染色30 min40，然后吸出染色液（可重復(fù)使用）。c.7.2.7 漂洗 用蒸餾水清洗凝膠板，以除掉殘留的染色體，共沖洗四次，每次用水400 ml，每次沖洗15 s。c.7.2.8 顯影 加入核酸顯影液（4.14）400 ml，輕輕搖蕩，直到核酸帶顯現(xiàn)清楚為止。c.7.2.9 增色 吸出顯影液，加入增色液（4.15）400 ml，增色5 min左右。吸掉增色液拍照。c.8 計(jì)算結(jié)果與陽性對照相同位置有譜帶出現(xiàn)者為陽

48、性。呈陽性反應(yīng)樣品數(shù)量實(shí)驗(yàn)室樣品數(shù)量馬鈴薯紡鍾塊莖類病毒（pstvd）檢出率×100結(jié)果用兩次重復(fù)的算術(shù)平均值表示，修約間隔為1，并標(biāo)明經(jīng)舍進(jìn)或未舍未進(jìn)。陽性對照（pstvd的rna）泳道下方約1/4處應(yīng)有拖后的黑色核酸帶。c.9 判定用全數(shù)值比較法，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定各級別種薯馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（pstvd）允許率應(yīng)為零，檢出變大于零。或經(jīng)舍棄為零者均不合格。附錄d 種薯切塊操作程序d.1 器材：切刀：2 把；塑料盆：2 個；籮筐：2 個消毒藥液：2000 m1(0.1 酸性升汞、0.1 高錳酸鉀、75 乙醇、5 碳酸任選一種即可)。d.2 操作程序d.2.1 將配好的藥液倒入盆，切刀柄朝

49、上浸入藥液中。d.2.2 先取出一把刀，切完一個種薯后放回藥液；取另一把切刀，再切完一個種薯又放回藥液。如此兩把刀交替使用。d.2.3 切薯塊時，邊切邊肉眼觀察切面，發(fā)現(xiàn)病薯或可疑薯塊即全部淘汰。d.2.4 切好的薯塊用放入清潔籮筐備用。附錄e 主要病蟲害防治防治對象藥劑及劑量防治時期、方法蚜蟲40 樂果乳油、威力特、萬靈等按產(chǎn)品說明交替使用脫毒苗扦插成活出棚后至收前15 d，網(wǎng)室內(nèi)外每隔d 710 d噴一次。早、晚疫病安克錳鋅、克露、抑快凈、甲霜銅等按產(chǎn)品說明交替使用發(fā)病初期開始用藥，每隔7 d 10 d噴一次。螨類尼索朗、阿巴丁、瀏陽霉毒、阿維噠螨等按產(chǎn)品說明交替使用初見蟲或卵時用藥，每隔

50、7 d 10 d噴一次。潛葉蠅、塊莖蛾萬靈+阿維噠螨或威力特等按產(chǎn)品說明使用早上9點(diǎn)以前用藥，每隔7 d 10 d噴一次附錄f （規(guī)范性附錄）馬鈴薯主要蟲害癥狀與防治方法f.1 馬鈴薯瓢蟲f.1.1 癥狀又名28星瓢蟲，俗稱花大姐，其成蟲和幼蟲均能危害馬鈴薯，咬食葉片背面葉肉，使被害部位只剩葉脈，形成有規(guī)則的平等透明網(wǎng)狀細(xì)紋，植株逐漸枯黃。f.1.2 防治措施f.1.2.1 捕殺成蟲 消滅成蟲越冬場所。f.1.2.2 藥劑防治 發(fā)現(xiàn)成蟲開始為害后，利用殺蟲劑，參照使用標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行防治。f.2 馬鈴薯塊莖蛾f.2.1 癥狀俗名馬鈴薯蛀蟲、串皮蟲等，幼蟲蛀食馬鈴薯葉和塊莖，當(dāng)幼蟲潛入馬鈴薯葉片內(nèi)造成隧

51、道為線形，幼蟲孵化后在芽眼處吐絲結(jié)網(wǎng)蛀入內(nèi)部，造成彎曲的隧道，嚴(yán)重的可被蛀空，外形皺縮，并能引起腐爛。f.2.2 防治措施f.2.2.1 嚴(yán)格檢疫，杜絕有塊莖蛾為害地區(qū)種薯外運(yùn)。f.2.2.2 種薯入窖前用殺蟲劑熏蒸，消滅成蟲。f.2.2.3 種薯田進(jìn)行高培土，防止塊莖露出土面。f.3 馬鈴薯蚜蟲f.3.1 癥狀又名膩蟲，以成、若蚜密集在幼苗、嫩莖、嫩葉和近地面的葉背，剌吸寄主汁液。由于繁殖量大，密集為害，故使受害株嚴(yán)重失去養(yǎng)分和水分，形成葉面皺縮、發(fā)黃。f.3.2 防治措施f.3.2.1 早春和晚秋清除殘株，枯葉和雜草，消滅部分越冬蚜蟲和卵。f.3.2.2 在點(diǎn)片發(fā)生階段，利用殺蟲劑防治。f.4 馬鈴薯金針蟲f.4.1 癥狀以幼蟲為害幼苗根莖，但不完全咬斷，斷口處不整齊，呈絲狀，并可蛀入塊莖中取食為害。f.4.2 防治措施f.4.2.1 春耕或春播前耙地時，藥劑處理土壤。f.4.2.2 苗期撒施毒谷、毒餌誘殺。f.4.2.3 及早秋耕，消滅即將入深土層越冬的幼蟲或成蟲。f.5 地老虎f.5.1 癥狀12齡幼蟲晝夜在植株上取食為害，咬食嫩葉的葉肉，殘留表皮，造成針孔狀花葉，3齡可將葉片咬成小孔或缺刻，4齡后則可咬斷幼苗基部嫩莖