全自動(dòng)生化分析儀的常用檢測(cè)方法

1、 董蘋董蘋 2010-8內(nèi)容 一 概述 二 基本原理 終點(diǎn)法 三 檢測(cè)方法 固定時(shí)間法 連續(xù)監(jiān)測(cè)法 功能特點(diǎn) 特點(diǎn)：自動(dòng)化機(jī)械化的儀器設(shè)備模仿 代替手工操作 優(yōu)點(diǎn)：提高了工作效率 減少了主觀誤差 靈敏 準(zhǔn)確 快速 標(biāo)準(zhǔn)化分類 管道連續(xù)流動(dòng)式 按結(jié)構(gòu)原理分 分立式常用 離心式 干片式急診常用 小型 按測(cè)定速度分 中型 大型 超大型（模塊式） 按自動(dòng)化程度分 半自動(dòng) 全自動(dòng)主要構(gòu)成 加樣系統(tǒng)（樣品轉(zhuǎn)盤 試劑倉 取樣裝置） 比色系統(tǒng)（光源 比色杯 單色器 檢測(cè)器） 供排水系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)內(nèi)容 一 概述 二 基本原理 終點(diǎn)法 三 檢測(cè)方法 固定時(shí)間法 連續(xù)監(jiān)測(cè)法 基本原理 臨床生化分析儀最常使用的是

2、分光光度法 分光光度法是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 組成光吸收曲線 溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。光吸收曲線來描述。討論 不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似max不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同。 不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度 A 不同，在max處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。 在分光光度法中, 以_為縱坐標(biāo), 以 _為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。 濃度不同的同種溶液, 在該種曲線中其最 大吸收波長_，相應(yīng)的吸光

3、度大小 則_，同一波長下摩爾吸數(shù) 。波長不同相同吸光度相同Lamber-Beer定律：吸收光譜法基本定律定律：吸收光譜法基本定律 描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和待測(cè)物濃度的關(guān)系待測(cè)物濃度的關(guān)系 Lamber定律：Al Beer定律：A C 入射光強(qiáng)度I0 透射光強(qiáng)度I 物體截面為S 厚度為lLambert-Beer（朗伯-比爾）定律 當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，樣品對(duì)光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比 A = kcb A-吸光度 k-吸光系數(shù) c-溶液濃度 b-液層厚度吸光度 透光度的負(fù)對(duì)數(shù) 表示物質(zhì)對(duì)光的吸收程度 A=-lgT=lg1/T

4、=lgI0/It T-透光度 I0-入射光強(qiáng)度 It-透射光強(qiáng)度 T=It/I0吸光系數(shù) 定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí) 測(cè)得的吸光度。 K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射 光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液 濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因 溶液濃度所采用的單位的不同而異。 吸光系數(shù) 三種表現(xiàn)形式：摩爾吸光系數(shù) 吸光系數(shù)a 百分吸光系數(shù)E1%1cmLambert-Beer（朗伯-比爾）定律 郎伯-比爾定律表明：當(dāng)液層厚度固定時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。 即：A/C=const 故：只要測(cè)出某種溶液的吸光度，將它與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度進(jìn)行比較，就可以算出該溶液的濃度。

5、討論：討論：1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性如果 溶液中同時(shí)存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì) ,則測(cè)得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物質(zhì)吸光度的總和，即： A（a+b+c）AaAbAc應(yīng)用：多組分測(cè)定偏離偏離BeerBeer定律的因素定律的因素 依據(jù)Beer定律,A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點(diǎn)的直線 偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面：（一）光學(xué)因素（一）光學(xué)因素（二）化學(xué)因素（二）化學(xué)因素 （一）光學(xué)因素（一）光學(xué)因素1非單色光的影響非單色光的影響： Bee

6、r定律應(yīng)用的重前提入射光為單色光 照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后 并非真正單色光 其波長寬度由入射狹縫的寬度 和棱鏡或光柵的分辨率決定 為了保證透過光對(duì)檢測(cè)器的響 應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度 這就使分離出來的光具一定的 譜帶寬度討論 入射光的譜帶寬度嚴(yán)重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀 E1E2 A=E1CL E1E2 A與C不成線性關(guān)系，偏離Beer定律 （E2-E1) A與C偏離線性關(guān)系越嚴(yán)重 結(jié)論：結(jié)論： 選擇較純單色光（，單色性） 選max作為測(cè)定波長（一）光學(xué)因素（一）光學(xué)因素2. 2. 雜散光的影響雜散光的影響雜散光是指從單色器分出的光不在入射 光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)。雜散光來

7、源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件 污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值。（一）光學(xué)因素（一）光學(xué)因素3 3反射光和散色光的影響：反射光和散色光的影響：反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi) 的光直接對(duì)T產(chǎn)生影響。散射和反射使T，A，吸收光譜變形 注：一般可用空白對(duì)比校正消除4非平行光的影響：非平行光的影響：使光程，A，吸收光譜變形（二）化學(xué)因素（二）化學(xué)因素 溶液中的溶質(zhì)可因 c 的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離 L-B 定律的現(xiàn)象 。 例：在水溶液中，Cr()的兩種離子存在 如下平衡 Cr2O42- + H2O 2CrO42- + 2H+ 定量分析方法 (1) 標(biāo)準(zhǔn)曲

8、線法 (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法（外標(biāo)一點(diǎn)法） (3) 吸光系數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法最經(jīng)典方法最經(jīng)典方法 前提：固定儀器和固定條件 過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列 分別測(cè)定 A 得CA曲線 樣品 測(cè)定A樣 查得C樣CABCKA標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶 液和濃度為cx的試樣溶液，在最大吸收波長處，分別測(cè)定二者的吸光度值為As、Ax ，依據(jù)朗伯-比爾定律得: As=KbcsAx=Kbcx 則: cx = cs*Ax /As標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法sCiCC吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對(duì)法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式AKbc進(jìn)行計(jì)算的定量分析方法。在手冊(cè)中查出待測(cè)

9、物質(zhì)在最大吸收波長 處的吸光系數(shù) 或 ,并在相同條件下測(cè)量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為： 或AcLLEA%1cm1max%1cm1E內(nèi)容 一 概述 二 基本原理 終點(diǎn)法 三 檢測(cè)方法 固定時(shí)間法 連續(xù)監(jiān)測(cè)法 終點(diǎn)法 終點(diǎn)法通過檢測(cè)終點(diǎn)吸光度的改變大小來求出被測(cè)物含量。 何為終點(diǎn)？如何判斷？ 通常在反應(yīng)終點(diǎn)附近連續(xù)選擇兩個(gè)吸光度值，求其平均值，根據(jù)兩點(diǎn)的差值來判斷反應(yīng)終點(diǎn)。 終點(diǎn)法 終點(diǎn)時(shí)間的確認(rèn)： 一、根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線 如:Trinder反應(yīng)測(cè)尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘 時(shí)其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點(diǎn)。 二、根據(jù)被測(cè)物反應(yīng)終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反應(yīng) 情況來確定 如:溴甲酚綠法測(cè)血清

10、白蛋白 分類 終點(diǎn)法： 一點(diǎn)終點(diǎn)法 二點(diǎn)終點(diǎn)法 免疫比濁法 雙波長法一點(diǎn)終點(diǎn)法 一點(diǎn)終點(diǎn)法在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)，選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度值。 通常在反應(yīng)終點(diǎn)附近連續(xù)讀兩個(gè)吸光度，求出兩點(diǎn)的平均值，并根據(jù)兩點(diǎn)的差值判斷反應(yīng)是否達(dá)到平衡。一點(diǎn)終點(diǎn)法的設(shè)置： 以R和S混合之前的空氣空白、水空 白或試劑空白的吸光度值為測(cè)定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)達(dá)到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成直線，對(duì)于反應(yīng)速度快的多用。 如：GLU TG CH等2021-11-1037Al T（時(shí)間）（時(shí)間）AS+R(吸光度）吸光度）一點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)曲線 計(jì)算公式： C=(Am-Ab)*K Am-終點(diǎn)讀數(shù)

11、點(diǎn)的吸光度 Ab-試劑空白吸光度 K-校正系數(shù)二點(diǎn)終點(diǎn)法 第二試劑加入以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時(shí)間后反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后測(cè) 第二個(gè)吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計(jì) 算結(jié)果。 第一點(diǎn)吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。2021-11-1040AnTAR2AmS+R1(吸光度）吸光度）（時(shí)間）（時(shí)間）兩點(diǎn)終點(diǎn)兩點(diǎn)終點(diǎn)Ax=樣本空白樣本空白An - k0 Am（體積校正因子）（體積校正因子）k0 =Sv+RlSv+R1+R2兩點(diǎn)終點(diǎn)法 計(jì)算公式： C=(An-K0*Am)*K K0-體積校正因子 K0

12、=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)免疫比濁法 通過物質(zhì)對(duì)光的散射或透射來測(cè)定物質(zhì)含量的 方法： 散射比濁：特定蛋白分析儀 透射比濁：自動(dòng)生化分析儀 通常作兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析，多采用多點(diǎn)校準(zhǔn)。 應(yīng)用：用Ab測(cè)定Ag（主要為微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab 過量，此時(shí)Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加 而遞增，光散/透射射強(qiáng)度與抗原量成正比。免疫比濁法 優(yōu)點(diǎn)： 方法簡(jiǎn)便 結(jié)果準(zhǔn)確 可用于自動(dòng)化儀器檢測(cè) 缺點(diǎn)：抗體用量大 達(dá)平衡時(shí)間長雙波長法 消除樣品中對(duì)測(cè)定有干擾的物質(zhì)的影響； 在試樣中含有兩個(gè)組分a和b時(shí)，若要測(cè)定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的

13、吸收干擾。首先選擇待測(cè)組分b的最大吸 收波長1作為測(cè)量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長2 ，使組分a在這兩個(gè)波長處的吸光度相等。雙波長法 試樣溶液在2和1兩個(gè)波長處的吸光度之差，只與待測(cè)組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300600nm呈下降趨勢(shì)2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰3.膽紅素：300500nm有吸收峰 可見它們的吸收峰都較寬，且同測(cè)定波長 有重疊現(xiàn)象。雙波長法 主波長的選擇 反應(yīng)體系中待測(cè)組分吸收峰對(duì)應(yīng)的波長，盡量避開或減少來自試劑空白和樣本空白對(duì)測(cè)定組分的干擾，提高特異性和靈敏度。雙波長法 輔助波長的選擇： 根據(jù)測(cè)

14、定波長選擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測(cè)定波長同輔助波長有相同的吸光度，待測(cè)物吸光度差異很大。 如:鉬酸銨法測(cè)P3用340nm，而Hb在340 及380nm均有較高吸收峰，選380nm作為輔助波長。雙波長法 雙波長測(cè)定優(yōu)點(diǎn) ： 消除噪音干擾 減少雜散光影響 減少樣品本身光吸收的干擾 固定時(shí)間法 指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，這兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，利用這兩點(diǎn)吸光度差值計(jì)算結(jié)果。 如：苦味酸法測(cè)肌酐 固定時(shí)間法 計(jì)算公式： C=(A2-A1)*K A1A2T(吸光度）吸光度）連續(xù)監(jiān)測(cè)法 根據(jù)反應(yīng)速度與待測(cè)物的濃度成正比，通過測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)吸光度的變化速率（ A/min ）來計(jì)

15、算待測(cè)物的濃度。 酶活性測(cè)定常用酶促反應(yīng)曲線連續(xù)監(jiān)測(cè)法 零級(jí)反應(yīng)期-酶促反應(yīng)速度達(dá)到并保持恒定速率進(jìn)行反應(yīng)，單位時(shí)間內(nèi)的變化速率恒定不變。 在零級(jí)反應(yīng)期單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率A/min)與酶活力呈正比。連續(xù)監(jiān)測(cè)法 測(cè)定時(shí)間的選擇： 監(jiān)測(cè)時(shí)間應(yīng)根據(jù)所用儀器不影響檢測(cè)速度和結(jié)果的準(zhǔn)確性選在時(shí)間反應(yīng)進(jìn)程曲線的線性期。通常： 延遲時(shí)間：30-60秒 監(jiān)測(cè)時(shí)間：120秒1.連續(xù)監(jiān)測(cè)法 即零級(jí)反應(yīng)速率法,亦稱斜率法 在較長反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時(shí)間(530秒)讀取一次吸光度值，至 少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)以上A，最后算出 反應(yīng)速率A/min。uTuuuVVltALU610/202

16、1-11-1058AlTAS+R1R2A2(吸光度）吸光度）（時(shí)間）（時(shí)間）速率法速率法A/min=(A2-A1 )-(空白空白)/(t2-t1)1.連續(xù)監(jiān)測(cè)法特點(diǎn) 與固定時(shí)間法相比，屬于即時(shí)觀測(cè)，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進(jìn)程，很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級(jí)反應(yīng)。2.兩點(diǎn)速率法主要用于其反應(yīng)過程不成線性，這樣只注意其反應(yīng)的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)，而忽視其中間過程的線性變化。如：測(cè)定苦味酸法測(cè)Cr，反應(yīng)過程中Vit C、丙酮酸、蛋白質(zhì)等均可與苦味酸生成紅色化合物而干擾反應(yīng)，通常選擇1min內(nèi)的兩點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。A2TAS+R1A1R2(吸光度）吸光度）（時(shí)間）（時(shí)間）兩點(diǎn)速率法兩點(diǎn)速率法 Ax=A2-A1tt兩點(diǎn)速率法 缺點(diǎn)：人為確定t 1、