實(shí)驗(yàn)溶菌酶的粗提取、分離純化及酶活力、純度及分子量測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)1-3 溶菌酶的提取分離及鑒定（酶活力、純度及分子量測(cè)定）1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 溶菌酶的粗提取2. 溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測(cè)定3. 溶菌酶純度鑒定與分子量測(cè)定2背景知識(shí)溶菌酶（lysozyme）：胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。生物學(xué)效應(yīng)：主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+以及N-乙酰葡

2、萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活345溶菌酶理化性質(zhì)：溶菌酶理化性質(zhì)：相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量14700 Da，由，由129個(gè)個(gè)氨基酸氨基酸殘基構(gòu)殘基構(gòu)，pI:10.8，最適溫度為，最適溫度為50，最適，最適pH為為67左右。左右。280nm的消光系數(shù)的消光系數(shù)為為13.06背景知識(shí)：背景知識(shí)：酶的提取、分離純化酶的提取、分離純化l初步純化初步純化（rough fractionation） （提取）：（提?。喊衙笍纳衙笍纳锝M織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)的過(guò)程，即將盡可物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)的過(guò)程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。能多的酶，盡量

3、少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 l高度純化高度純化（fine fractionation） （精純化）：除去與（精純化）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。l純化方案評(píng)價(jià)純化方案評(píng)價(jià)：酶活力酶活力、蛋白濃度蛋白濃度、純度純度7 粗純化（粗純化（ 提取）目標(biāo)：提?。┠繕?biāo)： a. 將目的酶最大限度地溶解出來(lái)。 b. 保持生物活性。l注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（010）操作。提取原則提取原則a. 相似相溶。b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。8離心分離離心分離（一）一）基本原理基本原理1. 1. 離心力離心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r

4、r （2 N/60）2 2 N為離心機(jī)為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）； Fc通常以相對(duì)離心力通常以相對(duì)離心力RCF（relative centrifugal force）表）表示，示，即離心力即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少）的多少倍倍。一般用一般用g g（或數(shù)字（或數(shù)字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用旋轉(zhuǎn)半徑用r r平均平均

5、代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 9 通常：通常：低速離心以低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。高速離心（超速），常以高速離心（超速），常以相對(duì)離心力相對(duì)離心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 兩者可換算或查測(cè)算圖。兩者可換算或查測(cè)算圖。10名稱名稱 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速(r/min)(r/min) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 低速離心機(jī)低速離心機(jī) 60006000 常溫，注意樣品熱變性和離心常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡管平衡 高速離心機(jī)高速離心機(jī) 6000 25000冷凍（防止溫

6、度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機(jī)超速離心機(jī) 25000冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類離心機(jī)的種類 11l角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。 l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 12l角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。13l材質(zhì)：玻璃，材質(zhì)：玻璃，塑料塑料l強(qiáng)度：和離強(qiáng)度：和離心速度相配心速度相配l大小：和轉(zhuǎn)大?。汉娃D(zhuǎn)子配套子配套

7、l高速超速管高速超速管要加蓋要加蓋14l平衡、定溫、定速、定時(shí)。平衡、定溫、定速、定時(shí)。15實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)一、 溶菌酶的粗提取溶菌酶的粗提取略略16u 酶精純化常用技術(shù)l膜分離技術(shù)l柱層析技術(shù)l蛋白質(zhì)結(jié)晶透析超濾凝膠過(guò)濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析17GelFiltrationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase實(shí)驗(yàn)二、溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測(cè)定目的：1. 掌握離子交換層析原理及層析操作所需的必須原件。2. 掌握層析柱填裝方法及層析填料的保存3. 掌握比色法測(cè)定溶菌酶的濃

8、度與酶活18l原理：l 根據(jù)溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中攜帶？電，與陰/陽(yáng)離子層析填料可結(jié)合，通過(guò)吸附后，提高pH或離子強(qiáng)度將溶菌酶與其他蛋白進(jìn)行分離達(dá)到純化目的。l溶菌酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的酶解作用導(dǎo)致細(xì)菌完整性破壞，OD600值會(huì)下降，通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）OD600值的下降評(píng)價(jià)酶活性。l溶菌酶的活力單位（U）：在室溫，pH8.0的條件下，OD600每分鐘降低0.001為1個(gè)活力單位。l280nm的消光系數(shù)為13.0，根據(jù) A=ECL 可粗略測(cè)定溶菌酶濃度，用于酶比活的評(píng)價(jià)。1920離子交換層析離子交換層析 （ion exchange chromatography，

9、IEC）212.離子交換填料離子交換填料： 離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。 纖維素纖維素 瓊脂糖瓊脂糖 葡聚糖葡聚糖 載體載體 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ +反離子反離子1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。22離子交換劑離子交換劑-帶有電荷基團(tuán)的帶有電荷基團(tuán)的不溶性不溶性載體載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體載體Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑陰離子交換劑(可吸附可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)) 陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑(可吸附

10、可吸附帶正電的蛋白質(zhì)帶正電的蛋白質(zhì))23l陰離子交換劑：陰離子交換劑：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基羥丙基l陽(yáng)離子交換劑：陽(yáng)離子交換劑：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH324 化學(xué)原料合成化學(xué)原料合成 ： sephadex sepharose 載體載體 天然材料制成：天然材料制成： cellulosecellulose 如：如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose25 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理理

11、 利用不同的蛋白利用不同的蛋白質(zhì)質(zhì)分子在溶液中所分子在溶液中所帶電帶電荷荷不同，因而不同，因而與離子交換劑與離子交換劑有不同吸附力有不同吸附力而而分離。分離。pH8.0pI 8.0 蛋白蛋白質(zhì)帶質(zhì)帶正正電電pI 8.0 蛋白蛋白質(zhì)帶負(fù)電質(zhì)帶負(fù)電溶菌酶溶菌酶pI:10.8262. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的的過(guò)程過(guò)程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分離結(jié)束分離結(jié)束再生再生+低鹽低鹽高鹽高鹽利用不同利用不同鹽濃度將鹽濃度將不同蛋白不同蛋白質(zhì)質(zhì)洗洗脫下脫下來(lái)來(lái)Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-273

12、. 操作操作 平衡平衡 上樣上樣 沖洗沖洗 洗脫洗脫 再生再生1）上樣：）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。上樣體積不十分嚴(yán)格。2）洗脫）洗脫: 增加溶液的離子強(qiáng)度增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法梯度洗脫法 （連續(xù)、不連續(xù)）（連續(xù)、不連續(xù)）改變?nèi)芤旱母淖內(nèi)芤旱膒H值值 3）再生：）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液處理。溶液處理。4.4.應(yīng)用應(yīng)用 制備純化生物大分子制備純化生物大分子28梯度洗脫方式29圖圖4-39 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（）線性梯度；（b）凸形梯度；（）凸形梯度；（c）凹形梯度；（）凹形梯度；（d）編程梯度）編程梯度30 層析柱的

13、制備與層析操作層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備柱層析的設(shè)備: 層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、檢測(cè)儀、層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、檢測(cè)儀、部分收集器、梯度洗脫器。部分收集器、梯度洗脫器。31l層析裝置：層析裝置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕動(dòng)泵蠕動(dòng)泵l 層析柱層析柱l 監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)儀l 記錄儀記錄儀l 收集器收集器 32現(xiàn)代化層析設(shè)備AKTA層析柱層析柱XKBPG實(shí)驗(yàn)2.1 層析柱的填裝l1.觀摩l2.實(shí)驗(yàn)步驟l1）測(cè)定酶濃度（S-2）lC(mg/ml)=A280/13l2）若填料載量為20mg/ml，計(jì)算擬純化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。34l3）裝柱要點(diǎn)：la. 用純水將乙醇保存液置

14、換lb. 柱頭及柱底適配器確保無(wú)氣泡，可用注射器推注趕氣泡，并確保連接管路密閉無(wú)泄漏。lc. 填料傾倒入柱管內(nèi)前先加入少量水覆蓋柱底ld. 柱拆卸后填料務(wù)必回收，并保存于20%乙醇中。35二、酶的活力單位及酶活測(cè)定：二、酶的活力單位及酶活測(cè)定：1. 1. 酶活單位：酶活單位：19611961年國(guó)際生化協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)統(tǒng)一規(guī)年國(guó)際生化協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)統(tǒng)一規(guī)定，酶的國(guó)際單位（定，酶的國(guó)際單位（IUIU）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度2525）下，每分鐘內(nèi)催化）下，每分鐘內(nèi)催化1 1微摩爾（微摩爾（molmol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或所需的酶量（或1 1

15、分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1 1微摩爾產(chǎn)物的酶量）微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為稱為1 1標(biāo)準(zhǔn)單位標(biāo)準(zhǔn)單位。 372.2.酶的比活力：酶的比活力： 每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。 對(duì)對(duì)固體酶固體酶：用活力單位：用活力單位/mg/mg酶蛋白、或活力單酶蛋白、或活力單位位/mg/mg酶蛋白氮來(lái)表示；酶蛋白氮來(lái)表示； 對(duì)對(duì)液體酶液體酶：用活力單位：用活力單位/ml/ml酶液來(lái)表示。酶液來(lái)表示。 很明顯，比活力越大，酶的活力越大。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì) 或產(chǎn)物有紫外吸收的

16、能力可采用此法。或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。測(cè)壓法：產(chǎn)物中有氣體，測(cè)氣壓增加量。測(cè)壓法：產(chǎn)物中有氣體，測(cè)氣壓增加量。滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑 反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。 除了以上方法外，還可根據(jù)除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。采用其它方法。 3.具體測(cè)定方法具體測(cè)定方法4. 回收率和純化倍數(shù)回收率和純化倍數(shù)回收率回收率 100提純后酶總

17、活力提純后酶總活力提純前酶總活力提純前酶總活力純化倍數(shù)純化倍數(shù)每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力40實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)2.2溶菌酶的活性測(cè)定溶菌酶的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：1. 枯草芽孢桿菌懸液枯草芽孢桿菌懸液2. S1，S23. PBS等等4. 分光光度計(jì)、比色皿、計(jì)時(shí)器、離心機(jī)等分光光度計(jì)、比色皿、計(jì)時(shí)器、離心機(jī)等41實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取取6ml 菌懸液，菌懸液，3500rpm*5min，棄上清，沉淀，棄上清，沉淀 6ml PBS重懸。重懸。2. 測(cè)定測(cè)定OD600并記錄（吸光度并記錄（吸光度0.51.0，若讀數(shù)過(guò)高可適當(dāng)稀釋），若讀數(shù)過(guò)高可適當(dāng)稀釋）3. 測(cè)定樣品準(zhǔn)備（酶液務(wù)

18、必在儀器等條件準(zhǔn)備好，臨測(cè)定前加測(cè)定樣品準(zhǔn)備（酶液務(wù)必在儀器等條件準(zhǔn)備好，臨測(cè)定前加入）入）比色皿1234PBS緩沖液/ml5-細(xì)胞PBS懸液/ml-54.84.8酶液S1/ml-0.2酶液S2/ml0.242實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：4. 酶活性測(cè)定，以管（酶活性測(cè)定，以管（PBS）為對(duì)照，每隔）為對(duì)照，每隔30s 測(cè)定測(cè)定2,3,4管的管的OD600并記錄并記錄5. 酶活力及比活性計(jì)算：酶活力及比活性計(jì)算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136. 純化回收率及純化倍數(shù)計(jì)算純化回收率及純化倍數(shù)計(jì)算時(shí)間（s）03060901201501802號(hào) 3

19、號(hào) 4號(hào) 回收率回收率 100US2*V2US1*V1純化倍數(shù)純化倍數(shù)S2比活力比活力S1比活力比活力43樣品體積ml蛋白濃度mg/ml總蛋白 mg活力 u/ml比活力 u/mg總活力 U回 收 率%提 純 倍數(shù) S1V1 1001S2V2 7. 完成下表完成下表44實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3溶菌酶的純度鑒定與分子量測(cè)定溶菌酶的純度鑒定與分子量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、通過(guò)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)與操作，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程更好的理解、通過(guò)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)與操作，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程更好的理解SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝膠（烯酰胺凝膠（PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；）測(cè)定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；2、掌握電泳原理以及、掌握電泳原理

20、以及SDS-PAGE垂直板電泳垂直板電泳分析分析蛋白質(zhì)技術(shù)；蛋白質(zhì)技術(shù)；3、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，SDS-PAGE分子量測(cè)定分子量測(cè)定圖譜的繪制與計(jì)算；圖譜的繪制與計(jì)算；4、了解在電泳中分子量標(biāo)準(zhǔn)物的使用。、了解在電泳中分子量標(biāo)準(zhǔn)物的使用。45SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）簡(jiǎn)稱）簡(jiǎn)稱SDS PAG

21、E。 用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（relative molecular mass, Mrrelative molecular mass, Mr）測(cè)定。）測(cè)定。1.1.原理原理461.1.原理原理 SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。 SDSSDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變

22、，使蛋白破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)質(zhì)SDSSDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm1.8nm），長(zhǎng)軸與蛋），長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。白質(zhì)分子量成正比。 因此，因此，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物復(fù)合物(SDS-denatured protein)在凝膠中在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長(zhǎng)度的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長(zhǎng)度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。47 SDS-PAGE separates proteins by MW48 49502. 分離效應(yīng)分離效應(yīng) 連續(xù)電泳

23、（連續(xù)電泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（不連續(xù)電泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)不連續(xù)不連續(xù)PAGE PAGE 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 連續(xù)連續(xù)PAGEPAGE 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。徑的分離膠。l濃縮效應(yīng)：使樣品

24、在濃縮膠中被濃縮成一條窄濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。l電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) : 分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。遷移率不同。l分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) ：大小和形狀不同的樣品分子通大小和形狀不同的樣品分子通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。表現(xiàn)出不同的遷移率。 522. 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：（SDS-PAGE）1）母液配制）母液配制2）制膠準(zhǔn)備制膠準(zhǔn)備: 玻璃板清洗、干燥玻璃板清洗、干燥 制膠架的準(zhǔn)備：嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)組裝制膠

25、架制膠架的準(zhǔn)備：嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)組裝制膠架。532. 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：（SDS-PAGE）3）制膠制膠: 分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇15%的分離膠，如表配制的分離膠，如表配制54濃縮膠（10 ml）雙蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%膠貯液10% SDSTEMED10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5 l50 l分離膠（20 ml）雙蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl膠貯液10% SDS TEMED10% AP12%3.3ml2.8ml2.5 ml2.0ml4 ml5

26、 ml100 l4 l100 l553、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5 cm左右，左右，之后加少許蒸餾水，靜置之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。凝膠配制過(guò)程分鐘。凝膠配制過(guò)程要迅速要迅速，催化劑，催化劑TEMED要在注膠前再加入要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無(wú)法注膠。注膠過(guò)程最好，否則凝結(jié)無(wú)法注膠。注膠過(guò)程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。界面。4、

27、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5 mm處，迅速插入樣梳，靜置處，迅速插入樣梳，靜置10分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。5、電泳液緩沖（、電泳液緩沖（*10）配制：）配制：30g Tris, 150g Gly, 10g SDS+800ml dH2O, 定容至定容至1000ml565、樣品處理：取、樣品處理：取30ul樣品（樣品（S1，S2），加入），加入30ul 上樣緩沖液，上樣緩沖液，100水浴水浴30min，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會(huì)影響加樣效果。，否則會(huì)影響加樣效果。6、加樣、加樣3個(gè)，空出第一個(gè)孔，從第二個(gè)開(kāi)始按已編排好的順序依次個(gè)，空出第一個(gè)孔，從第二個(gè)開(kāi)始按已編排好的順序依次加入相應(yīng)體積的樣品和蛋白加入相應(yīng)體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清（。其中蛋清（S1）和）和Marker加樣加樣量為量為2 l，S1、S2、S3、和、和S4加樣量