第二十五章 微生物轉(zhuǎn)化

1、第二十五章第二十五章 藥物生物轉(zhuǎn)化藥物生物轉(zhuǎn)化張馳張馳 副教授副教授第一節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)概述生物轉(zhuǎn)化 是指外來化合物在體內(nèi)，細(xì)胞或酶的作用經(jīng)過一系列化學(xué)變化形成其衍生物或分解產(chǎn)物的過程，也成為代謝轉(zhuǎn)化。 生物轉(zhuǎn)化常利用生長中的菌體，休止的菌體，酶，固定化酶以及固定化菌體作為母體進(jìn)行藥物的轉(zhuǎn)化。主要的優(yōu)點(diǎn)有反應(yīng)的區(qū)域?qū)Ｒ恍院土Ⅲw專一性。早在2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們就已經(jīng)知道制醬和醋。在宋代，采用老的曲子進(jìn)行接種釀酒。不過當(dāng)時人們并沒有認(rèn)識到可以利用微生物來合成化學(xué)物質(zhì)。1864年巴斯德利用乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸。工業(yè)化的里程碑是50年代美國普強(qiáng)藥廠利用微生物黑根霉的羥化酶將黃體酮轉(zhuǎn)化

2、為11-羥基黃體酮，即對甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造。固定化細(xì)胞，基因重組等技術(shù)的發(fā)展，能將幾種不同合成基因構(gòu)建到同一個工程菌中使得一次培養(yǎng)同時進(jìn)行幾步轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使微生物轉(zhuǎn)化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用。微生物轉(zhuǎn)化的發(fā)展第一階段： 菌體生長階段，在該階段中主要是供給菌體豐富的營養(yǎng)，使其充分繁殖發(fā)育。（溫度，pH，通氣條件，培養(yǎng)及成分。）第二階段： 微生物轉(zhuǎn)化階段，一般在生長階段結(jié)束時加入底物溶液，有些還需加入誘導(dǎo)劑。微生物轉(zhuǎn)化的不同階段分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法利用酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用滲透細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用孢子進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用干燥細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法常用的轉(zhuǎn)化方法微生物轉(zhuǎn)化

3、實(shí)驗(yàn)概要過程如下： 選擇需要的菌株 培養(yǎng)成熟菌絲或孢子 選擇合適的轉(zhuǎn)化方式 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)或轉(zhuǎn)化菌絲及孢子懸浮液轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化液的分離提取 產(chǎn)品純化微生物轉(zhuǎn)化的過程由有活性中心都和特殊空間結(jié)構(gòu)的酶作為催化劑；酶催化作用的速度極快；在常溫常壓和中性條件下進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化反應(yīng)，簡化設(shè)備，降低成本；生物轉(zhuǎn)化的專一性，故底物不要求很純（Ex. 粗淀粉）轉(zhuǎn)化過程容易調(diào)節(jié)（簡單的用酸，堿，溫度，離子調(diào)節(jié)）轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生雜質(zhì)少，過程無毒，無臭，無味，可用于食品，醫(yī)療。把含酶細(xì)胞或酶本身固定在載體上，可使轉(zhuǎn)化過程連續(xù)化。酶來源廣泛。可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)無法做到的轉(zhuǎn)化。微生物轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)第二節(jié) 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型氧化反應(yīng)還原反應(yīng)縮合反

4、應(yīng)脫氫反應(yīng)烷烴雙端氧化碳鏈氧化降解123456最為常見的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在甾體藥物合成上應(yīng)用較多。環(huán)氧化反應(yīng)是生物轉(zhuǎn)化中的一個重要類型，C=C經(jīng)氧化可形成環(huán)氧化合物，可生產(chǎn)磷霉素。氧化反應(yīng)許多醛類，無論式脂肪族，還是芳香族，飽和或不飽和，羥基或鹵素取代都能被微生物還原成醇。還原反應(yīng)麻黃堿：利用微生物將苯甲醛和乙醛縮合成1-苯基-1-羥基丙酮，再與甲胺縮合，用活性鉛還原，得麻黃堿。縮合反應(yīng)可的松脫氫后苯環(huán)形成雙鍵，具有較高的抗炎活性。脫氫反應(yīng)該法是降解甾體物質(zhì)側(cè)鏈的重要反應(yīng)。采用鏈霉菌轉(zhuǎn)化阿魏酸制備香草醛為例。碳鏈氧化降解第三節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化在藥物中應(yīng)用 甾體指的是固醇或皮質(zhì)類激素，由于這類激素都含

5、有相同的結(jié)構(gòu)，所以統(tǒng)稱 為甾體類激素。甾體在臨床上應(yīng)用十分廣泛，解熱鎮(zhèn)痛，消炎殺菌等。甾體微生物轉(zhuǎn)化1950年Kendall, Reichstein與Hench因發(fā)現(xiàn)類固醇的消炎作用而獲得諾貝爾獎。1952年以化學(xué)方法以牛膽汁中的脫氧膽酸為原料合成腎上皮質(zhì)激素，反應(yīng)共需31個步驟，產(chǎn)品售價每克$200；1952年利用Peterson利用黑根霉產(chǎn)生的羥化酶將反應(yīng)過程縮短為3個步驟，產(chǎn)品售價每克$6；1980年使用突變的分支桿菌分解植物油中的固醇以作為原料，產(chǎn)品價格每克$0.46。甾體合成技術(shù)的演進(jìn)羥化反應(yīng)環(huán)氧化反應(yīng)脫氫反應(yīng)A環(huán)芳構(gòu)化還原反應(yīng)水解反應(yīng)甾體生物轉(zhuǎn)化的類型羥化反應(yīng)孕酮皮質(zhì)激素環(huán)氧化反應(yīng)

6、A環(huán)芳構(gòu)化脫氫甾體生物轉(zhuǎn)化的原理和方法 甾體生物轉(zhuǎn)化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白質(zhì)等的發(fā)酵。而是利用微生物中特殊的酶對甾體的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)獲得的產(chǎn)物。在這一過程中為獲得較多的轉(zhuǎn)化酶，我們需要確保菌體產(chǎn)酶的最佳條件，誘導(dǎo)所需要的酶，抑制不需要的酶。 在菌體生長期結(jié)束后加入甾體底物，由于其不溶于但能溶于可與水按一定比例混溶的有機(jī)溶劑，再加入培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化。根據(jù)轉(zhuǎn)化時微生物的狀態(tài)可分為4種轉(zhuǎn)化方式：生長培養(yǎng)方式：在微生物培養(yǎng)的中后期加入底物，一邊培養(yǎng)，一遍轉(zhuǎn)化。靜態(tài)菌體懸浮方式：菌體充分生長后，離心得到的菌體懸浮在水或適當(dāng) 的緩沖液中，再加入甾體進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；旌吓囵B(yǎng)方式：以A出發(fā)轉(zhuǎn)化成B

7、，需要兩種以上的酶參與，單獨(dú)轉(zhuǎn)化費(fèi) 時費(fèi)力，所以常采用混合培養(yǎng)的方法，可以一步得到B 省略了中間過濾步驟。固定化方式：一次制成的菌液反復(fù)用于轉(zhuǎn)化是可行的，為了避免溶菌， 需要將其固定在水不溶載體上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。影響甾體生物轉(zhuǎn)化的因素物理因素攪拌：增加攪拌速度，可以增加溶氧使基質(zhì)均勻，提高轉(zhuǎn)化率。通氣：增加氧的溶解，促進(jìn)菌體生長及生物轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基的組成碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，糊精。氮源：（有機(jī)，無機(jī)金屬離子：增加對轉(zhuǎn)化有益的離子，去除負(fù)向影響的離子。產(chǎn)物的分析與分離方法純化 需要用適當(dāng)?shù)呐c水不溶的有機(jī)溶劑將甾體從轉(zhuǎn)化液種提取出來。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶劑的用量需根據(jù)產(chǎn)物

8、在轉(zhuǎn)化液于提取液中的分配系數(shù)而定。提取時防止乳化。濃縮后利用各種色譜法得到較純的甾體轉(zhuǎn)化物。分析 轉(zhuǎn)化過程中需要實(shí)時監(jiān)測殘余底物及生成產(chǎn)物的量及比例，以確定轉(zhuǎn)化終點(diǎn)。常用紫外分光光度法，HPLC等。第四節(jié)第四節(jié) 新技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化的新技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化的中中應(yīng)用應(yīng)用 隨著現(xiàn)代生物科學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，以及一些分析測試技術(shù)的應(yīng)用，微生物轉(zhuǎn)化也得到了進(jìn)一步的發(fā)展?；蚬こ碳夹g(shù)、固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)、雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)、超聲波技術(shù)、有機(jī)介質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化以及生物反應(yīng)器等綜合應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，不僅可使轉(zhuǎn)化的效率成倍增長，而且還有可能使整個反應(yīng)過程連續(xù)、自動化。同時，一些分析測試技術(shù)如核磁共振、質(zhì)譜等已

9、經(jīng)應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化的在線檢測。一、基因工程技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用隨著近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對基因工程的認(rèn)識也逐步加深，這為微生物轉(zhuǎn)化提供了新的思路?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展和實(shí)用化為此開辟了有效途徑。只要生物細(xì)胞中存在有催化某一生化反應(yīng)的酶，即使其量微不足道，應(yīng)用基因重組技術(shù)，通過基因擴(kuò)增與增強(qiáng)表達(dá)，人們就可能建立高效表達(dá)特定酶制劑的基因工程菌或基因工程細(xì)胞，從而進(jìn)一步構(gòu)建成新一代的催化劑固定化工程菌或固定化工程細(xì)胞。如，應(yīng)用DNA重組技術(shù)建立了絲氨酸和色氨酸合成酶工程菌，這種工程菌組裝的生物反應(yīng)器可以用甘氨酸和甲醛為原料制造絲氨酸，反應(yīng)液含絲氨酸超過400gL，再從絲氨酸與吲哚轉(zhuǎn)化生成色氨

10、酸，反應(yīng)液中色氨酸濃度達(dá)到200gL。此外利用基因工程還可以將能進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶從微生物、植物甚至動物細(xì)胞中克隆出來再導(dǎo)入一個微生物中進(jìn)行表達(dá)，從而產(chǎn)生能對底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的一系列酶，將原來復(fù)雜的幾種轉(zhuǎn)化過程縮短為一個轉(zhuǎn)化反應(yīng)。目前在這方面的研究也是微生物轉(zhuǎn)化的一個趨勢，并且具有廣闊前景。二、固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)自20世紀(jì)70年代問世以來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)以及理論研究等方面，并取得了豐碩成果。利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，省去了破碎細(xì)胞提取胞內(nèi)酶的過程，完整細(xì)胞得到固定后，酶活損失較少，活性回收率高，并且保持了細(xì)胞內(nèi)原有的多酶體系，

11、對于一些需要多步催化的反應(yīng)過程，一步即可完成。被固定的微生物細(xì)胞可以是處于生長狀態(tài)或體眠狀態(tài)的活細(xì)胞也可以是死亡的細(xì)胞(但胞內(nèi)酶的活力仍 存在) 在微生物轉(zhuǎn)化過程研究最多的是固定化活細(xì)胞包埋技術(shù)。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸鹽凝膠、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝膠、聚乙烯醇(PVA)等。 以海藻酸鈣凝膠為例，其制備過程如下：在室溫條件下，將一定濃度的海藻酸鈉溶液與微生物細(xì)胞混合均勻后，滴加到氧化鈣溶液中，形成球珠。Kaul等采用了海藻酸鹽固定化生物催化劑(簡單節(jié)桿菌)和底物(氧化可的松)進(jìn)行碳一位和二位脫氫反應(yīng)研究。每個凝膠珠都可以看成是一個小的生物反應(yīng)器，由于

12、縮短了擴(kuò)散距離，轉(zhuǎn)化率明顯提高，反應(yīng)結(jié)束后細(xì)胞還可以回收并重復(fù)使用三、雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)早期主要用于生物分子和細(xì)胞的分離與純化。這是由于生物產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需要經(jīng)細(xì)胞破碎后才能提取、純化，細(xì)胞顆粒尺寸的變化給固一液分離帶來了困難，另外這些產(chǎn)品的活性和功能對pH值、溫度和離子強(qiáng)度等環(huán)境特別敏感為了克服這些缺點(diǎn)出為了克服這些缺點(diǎn)出現(xiàn)了雙水相技術(shù)。現(xiàn)了雙水相技術(shù)。近年來，該技術(shù)開始應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化過程為生物催化過程引入了一種全新的反應(yīng)體系 雙水相技術(shù)的核心是成相介質(zhì)的選擇以及介質(zhì)濃度的控雙水相技術(shù)的核心是成相介質(zhì)的選擇以及介質(zhì)濃度的控制制，它直接影響到底

13、物和產(chǎn)物在兩相中的分配。雙水相體系基本上可以分為兩大婁：高聚物-高聚物體系和高聚物-低分子物質(zhì)體系。高聚物一高聚物體系是較常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，當(dāng)它們濃度達(dá)到一定時溶液變渾濁，靜止后形成兩個液層，上層富集了PEG，下層則是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35組成的雙水相體系，利用分支桿菌(Mycobacterium sp.)進(jìn)行膽固醇側(cè)鏈降解制備雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上層聚乙二醇富集了菌體，使得菌體具有較高的轉(zhuǎn)化活力，轉(zhuǎn)化速率可達(dá)到1.0mg(gh)。四、超聲波技術(shù)在微生

14、物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 超聲波是指頻率高于2104Hz的機(jī)械波。 與其他聲波一樣，超聲波可以在彈性介質(zhì)中傳播。因?yàn)槌暡ǖ牟ㄩL很短，所以具有很強(qiáng)的定向傳播能力。同時由于超聲波在液體和固體中傳播時吸收衰減很小，因此具有很強(qiáng)的穿透力。根據(jù)超聲波的使用范圍，常可以將其分為兩類：一類是高頻超聲，頻率范圍為I10MHz，這一類主要用于醫(yī)學(xué)成像和化合物結(jié)構(gòu)的分析；另一類是功率超聲，頻率范圍為1560kHz，主要用于過程強(qiáng)化反應(yīng)。應(yīng)用超聲波技術(shù)，首先受到機(jī)械力的作用，而機(jī)械能又可以轉(zhuǎn)化為熱能。此外，當(dāng)聲強(qiáng)足夠大時，又能產(chǎn)生空化效應(yīng)。超聲波的機(jī)械效應(yīng)機(jī)械效應(yīng)包括振動效應(yīng)和聲流效應(yīng)，指超聲在媒介中傳播時引起質(zhì)點(diǎn)振動以及

15、聲流對質(zhì)點(diǎn)的剪切力；超聲波的熱效應(yīng)熱效應(yīng)指超聲波在媒介中傳播的過程中被傳播介質(zhì)吸收轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?；超聲波的空化效?yīng)空化效應(yīng)指超聲波激活氣泡各種動力學(xué)的表現(xiàn)形式。 超聲波技術(shù)應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化過程，主要是涉及固液傳質(zhì)的生物體系。超聲波可以產(chǎn)生上述的效應(yīng)，較常規(guī)方法更有效地細(xì)化顆粒、增大傳質(zhì)表面。這一過程主要發(fā)生于固液兩相界面及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜附近的區(qū)域。在超聲場中，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的環(huán)境和菌體均處于不斷的振動中。對于環(huán)境而言，可加強(qiáng)分子的擴(kuò)散效應(yīng)，加速體系的混勻過程，減少各種代謝在液相中的梯度；對于菌體而言，可降低其細(xì)胞內(nèi)胞液的黏度，提高膜的通透性。陽葵等等報道了采用超聲強(qiáng)度，超聲方式和時間對綠僵菌(Me

16、tarhizium sp)氧化16,17-環(huán)氧黃體酮的影響，并對微生物轉(zhuǎn)化體系中的超聲效應(yīng)進(jìn)行分析，認(rèn)為超聲使得反應(yīng)物顆粒細(xì)化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的傳遞；空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊力對細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，促進(jìn)胞內(nèi)酶的釋放及反應(yīng)物向胞內(nèi)的擴(kuò)散。五、有機(jī)介質(zhì)中的微生物轉(zhuǎn)化 自從Buckland第一次利用有機(jī)溶劑四氯化碳(CCl4)為介質(zhì)，采用諾卡菌(Nocardia sp.)將膽甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮以來，在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化成為了近幾年在該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。因?yàn)樵谟袡C(jī)體系中可以有效地將產(chǎn)物及時分離出來，底物相應(yīng)得到補(bǔ)充，從而消除底物和產(chǎn)物的抑制作用，提高轉(zhuǎn)化率。此外，由于一些底物

17、或前體在水相中的溶解度很小，通過用有機(jī)相作為介質(zhì)可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前體的加入濃度，在一定程度上也提高了轉(zhuǎn)化率。 一般來說，在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的過程中，有機(jī)溶劑與水形成兩相體系。包括有機(jī)介質(zhì)(水不溶性)-發(fā)酵液和有機(jī)介質(zhì)(水不溶性)-緩沖液兩種類型。Boren等在辛烷發(fā)酵液(1：1)組成的兩相體系中，將醋酸雄烯通過脫氫黃桿菌(Flavobacterium dehydrogenans)轉(zhuǎn)化為4-雄烯-3,17-二酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用發(fā)酵液作為第二相有利于微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)98，產(chǎn)物形成速率約是純水介質(zhì)的6倍這是因?yàn)樵诎l(fā)酵液中輔酶容易再生。孫小梅等應(yīng)用聚山梨酯一80(

18、吐溫80)磷酸鉀體系進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，利用棒狀桿菌將丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺，也實(shí)現(xiàn)了較高的轉(zhuǎn)化率。但是由于有機(jī)介質(zhì)自身的特點(diǎn)，對菌體和酶的活力影響很大，甚至對微生物轉(zhuǎn)化過程有一定的毒害作用，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。因此，在選擇有機(jī)介質(zhì)參與微生物轉(zhuǎn)化時，必須慎重考慮選擇有機(jī)溶劑的種類和濃度 除此以外有機(jī)溶劑跟水混合在一起還可以形成一種特殊的體系微乳液。微乳液是一種熱力學(xué)比較穩(wěn)定、光學(xué)透明、宏觀均句但微觀不均勻的混合液，它可以提供一些微生物轉(zhuǎn)化過程所需要的大量的油水界面，同時也促進(jìn)了水難溶性底物的溶解。例：Smolders等利用簡單節(jié)桿菌在磷脂、苯和少量水組成的微乳液中進(jìn)行16-甲基-萊氏化合物S

19、-21醋酸酯C1，2位脫氫研究，經(jīng)過反應(yīng)15h左右，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到98(圖1 13)。六、生物反應(yīng)器的應(yīng)用 對于任何一十非常有應(yīng)用前景，小試階段取得成功的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)來說，要實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行其生物反應(yīng)器研究是非常必要的。例如丙烯腈通過棒狀桿菌轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的過程中，先后對攪拌式反應(yīng)器、填充式反應(yīng)器、密集多相流反應(yīng)器以及膜反應(yīng)器的應(yīng)用進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用膜生物反應(yīng)器進(jìn)行 丙烯酰胺的微生物轉(zhuǎn)化可以使得連續(xù)化生產(chǎn)成為可能，減少了雜質(zhì)和丙烯酰胺的聚合體，提高了轉(zhuǎn)化液的純度，減輕了下游精制工序的壓力，從而提高了產(chǎn) 品質(zhì)量和轉(zhuǎn)化率。 此外，隨著兩相生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展人們對兩相生物反應(yīng)器的開發(fā)也逐 步加強(qiáng)。兩相生物反應(yīng)器對于一些水溶性較差或水不溶性的底物的微生物轉(zhuǎn)化，如酯的合成及水解、甾類化臺物的微生物轉(zhuǎn)化具有很大的吸引力。因?yàn)榇蠖鄡上喾磻?yīng)器都結(jié)合了產(chǎn)物的萃取，有