二環(huán)境條件PPT課件

1、二 環(huán)境條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。 溫度(temperature) 因為溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在2327之間進行，一般采用25 2。低于15時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35時對植物生長不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同，百合的最適溫度是20、月季足25-27、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進程。如煙草芽的形成以28為最好，在120以下，33以

2、上形成率皆最低。不同培養(yǎng)目標采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25以下的高。桃胚在25條件進行一定時間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35處理草莓的莖尖分生組織35d，可得到無病毒苗。 光照(light) 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光照時間方面 1光照強度(light intensity)光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植體及細胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。2光質(zhì)(light wave)光質(zhì)對愈傷組織誘

3、導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。3光周期(light period)試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光暗周期來進行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。 濕度 (humidity)濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要

4、受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進而影響組織培養(yǎng)的正常進行。濕度過高時，易引起棉塞長霉，造成污染。 滲透壓(penetrating pressure) 培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合

5、物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常12個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而56個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細胞就不能生存。pH值 (pH value) 不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的(表21)，大多在5、65左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。 pH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。一般來說當pH值高于65時，培養(yǎng)基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。因為高溫滅菌會降低pH值(約0.20.3個pH值)因此在配制時常提高pH值0203單位。p

6、H值大小調(diào)整可用01M的NaOH和0IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高02單位，lml的HCl可使pH值降低02單位。調(diào)節(jié)時一定要充分攪拌均勻。 種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7 不同植物的最適不同植物的最適pH值值 氧氣(oxygen) 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等

7、，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等 第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備 一、母液(stock solution)的配制和保存在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高

8、的化學純或分析純。藥品的稱量及定容都要準確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。 母液的配制方法： 單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。 混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用a mg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液a ml. 生長素配制時可先用少量95%酒精助溶。2，4D可用O1molL的

9、NaOH或KOH助溶，加入溫水定容。生長素常配成1mgml的溶液貯于冰箱中備用。 細胞分裂素類一般先用少量1N鹽配溶解后，再加入溫水冷卻后定容， 鐵鹽配法（MS為例）：在裝有400ml 蒸餾水的燒杯中加入2?？列遭c，溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至500ml，置于冰箱中備用。第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當通過一系列的實驗，對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能

10、得到一種能滿足實驗需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗方法主要有單因子試驗、多因子試驗及廣譜實驗等。 一、單因子試驗在單因子試驗中由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。例如Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。生物學試驗不同于物理學或化學試驗，最顯著的差別是在生物學試驗中必需設(shè)置對照組與試驗組，試驗組可以有一組或幾組，隨試驗的復(fù)雜性而設(shè)置，對照組也可能有一組以上。試驗中要求對照組與試驗組中的試驗個體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀

11、態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗結(jié)果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料的不一致導(dǎo)致的。試驗中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗結(jié)果。隨試驗規(guī)模和要求不同，大多每個項目要有410瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。2種激素種激素5種濃度的實驗組合種濃度的實驗組合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案

12、，也可選用正交設(shè)計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6BA的最佳濃度組合，每個因子各設(shè)5個濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個具有25項處理的試驗見表33。 二、多因子試驗完全試驗方案試驗因子越多，處理數(shù)越多，試驗越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗處理，但又能準確全面地獲得試驗信息，通常采用正交試驗。例如，采用正交設(shè)計，在使用此表時就可以安排4個因子，3種水平的試驗，一共做9種不同搭配的試驗，其結(jié)果相當于做了27次種種搭配的試驗。正交試驗雖然是多因素搭配在一起

13、的試驗，但是在試驗結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。因此，一次系統(tǒng)的試驗結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細胞分裂素、生長素、糖和其他成分的用量。三、逐步添加和逐步排除的試驗方法 在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時是使試驗成功，在逐步減少時是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時，也經(jīng)

14、常用到這種加加減減的簡單方法。 四、廣譜實驗法 在廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類：無機鹽、有機營養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長素、細胞分裂素。對每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項包括81個處理的實驗。在這81個處理中最好的一個可用4個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高等濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMH。達到這個階段，再試用不同類型的生長素和細胞分裂素即可找到培養(yǎng)基的最佳配方。這是因為不同類型的生K素和細胞分裂素對不同植物的活性有所不同。 第四章第四章 操作技術(shù)操作技

15、術(shù) 第一節(jié) 滅菌和接種 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。 無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒

16、或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學的滅菌方法處理后的物體(當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。 菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺

17、、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。 常用的滅菌方法 常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當選用。 濕熱滅菌（培養(yǎng)基） 培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫

18、度也隨之增加。在o1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。 注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到01MPa時壓力01-015MPa，20min。對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力

19、降低，不能隨意延長時間。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高043倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化

20、蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。 防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法： (1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時采取有效措施。 (2)設(shè)計培養(yǎng)基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。 (3)配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。 (4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變

21、化及回復(fù)動態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實驗中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。 灼燒滅菌（用于無菌操作的器械 ） 在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具） 干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用170持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，

22、以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，達到頂定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。 過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì) ） 一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。 防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，

23、將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。 紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可

24、。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按58mlm3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。 化學消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。噴霧滅菌（物體表面） 物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面

25、等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%1%的新潔爾滅也可以。植物材料表面用消毒劑滅菌 從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。 第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，然

26、后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。第三

27、步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取12種使用見表。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時間（min）去除的難易效果次氯酸鈣910530易很好次氯酸鈉2530易很好氯化汞0.1158較難最好抗菌素450mg/L3060中較好常用滅菌劑使用濃度及效果比較表上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗34次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當用無菌水涮洗810次，每次不少于3

28、min，以盡量去除殘毒。滅菌時，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前12min，開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時間是從倒人消毒液開始，至倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫80或Tnton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的材料表面。但吐溫加人后對材料的

29、傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。 二、無菌操作 接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行： (1)在接種4h前用甲醛

30、熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌； (2)在接種前20min，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈； (3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等； (4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面； (5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干； (6)接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等； (7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。 若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、接種 (1)將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖

31、洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或濾紙上。(2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含l2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1

32、3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計認為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和人力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。 1培養(yǎng)方法 (1)固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。

33、 (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50-100rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。 2培養(yǎng)步驟 (1)初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時發(fā)育的方向可分為：1)頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促使具

34、有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而形成 一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極

35、其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行接種。在實際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。 2)不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、

36、懸鉤子等。當在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進行繁殖，如非洲菊、草莓等。3)體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗

37、。但它是由體細胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生。 (2)繼代培養(yǎng)在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當數(shù)量的無根苗，最后能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于

38、有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖；在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進行過程。但在達到相當?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。 培養(yǎng)

39、過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至會使整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 褐變的主要原因植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后

40、褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。培養(yǎng)條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 合適的培養(yǎng)

41、條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。 連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。 繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化實踐表明，當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生

42、理失調(diào)癥。因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當培養(yǎng)基上細胞分裂素水平較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為： 增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢； 減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； 增加光照； 增加容器通風，最好進行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的

43、現(xiàn)象有明顯的作用； 降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生； 降低培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 3生根培養(yǎng) 當材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用12或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。誘導(dǎo)生根方法：將新梢基部浸入50或10010-6I IBA溶液中處理48h；在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d；直

44、接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。其原因是當根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。 另外也可采用下列方法就可生根：延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間；有意降低一些增殖倍率，減少細胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸

45、水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個體較小，所以也常需要一個低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。 試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將苗移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以1820為宜。實踐證明植物生長的溫度過高不但會牽涉到蒸騰加強。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活。春季低溫時苗床可加設(shè)電熱線，使墓質(zhì)溫度略高于氣溫23，這不但有利于生根和促進根系發(fā)達，而且還有利于提前成活。

46、移植到試管外的植物苗光強度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光合作用所需光照強度。但光線過強刺激蒸騰加強，會使水分平衡的矛盾更尖銳。 二、試管苗移栽馴化 試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個工作環(huán)節(jié)做不好，就會造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個組織培養(yǎng)工作的順利完成。 試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界

47、環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長，當將它們移栽到試管外環(huán)境時，試管苗失水率會很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理另外，對栽培馴化基質(zhì)要進行滅菌，因為試管苗在無菌的環(huán)境中生長，對外界細菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，

48、以進行滅菌處理。 ，通常采取的措施有：對外界要增加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。 移栽用基質(zhì) 適合于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點，一般可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時需按比例搭配，一般用珍珠巖，蛭石，草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1:1。這些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽?h烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習性來進行配制，這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。 (1)河砂:河

49、砂分為粗砂、細砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為12mm。細砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.10.2mm。河砂的特點是排水性強，但保水蓄肥能力較差，一般不單獨用來直接栽種試管苗。(2)草炭土:草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長時間的腐爛所形成，其保水性好，蓄肥能力強，呈中性或微酸性反應(yīng)，但通常不能單獨用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。(3)腐殖土:腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所形成。一種是自然形成，一種是人為造成，人工制造時可將秋季的落葉收集起來，然后埋人坑中，灌水壓實令其腐爛。第二年春季將其取出置于空氣中，在經(jīng)常噴水保濕的條件下使其風化，然后過篩即可獲

50、得。腐葉上含有大量的礦質(zhì)營養(yǎng)、有機物質(zhì)，它通常不能單獨使用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。移栽前的練苗 移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉23d，讓試管苗接受強光的照射，使其長得壯實起來，然后再開口練苗12d，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然濕度的條件。移栽和幼苗的管理 從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應(yīng)避免造成傷根。栽植時用一個筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達90%以上。 (1

51、)保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培養(yǎng)瓶的條件，讓小苗始終保持挺拔的狀態(tài)。保持小苗水分供需平衡首先營養(yǎng)缽的培養(yǎng)基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，并且初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當57d后，發(fā)現(xiàn)小苗有長趨勢，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端打開通風，使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。約15d以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進小苗長得粗壯。(2)防止菌類滋生。由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以保持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量滋生，以利成活。所以

52、應(yīng)對基質(zhì)進行高壓滅菌或烘烤滅菌。可以適當使用一定濃度的殺菌劑以便有效地保護幼苗，如多菌靈、托布津，濃度8001000倍，噴藥宜7l0d一次。在移苗時盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是造成死苗的原因。噴水時可加入0.1%的尿素，或用12MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生長與成活。 (3)一定的溫、光條件。試管苗移栽以后要保持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18200C，冬春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。溫度過低會使幼苗生長遲緩，或不易成活。溫度過高會使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會促使菌類滋生。另外在光照管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報紙等，以防陽光灼傷小

53、苗和增加水分的蒸發(fā)。當小植株有了新的生長時，逐漸加強光照，后期可直接利用自然光照。促進光合產(chǎn)物的積累，增強抗性，促其成活。(4)保持基質(zhì)適當?shù)耐庑?。要選擇適當?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系呼吸。綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只要把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。 愈傷組織（愈傷組織（callus）的形成和形的形成和形態(tài)發(fā)生態(tài)發(fā)生 植物的脫分化形式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細胞中，無須經(jīng)歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細

54、胞中發(fā)生的。 一一 愈傷組織形成的條件愈傷組織形成的條件 雖然如全能性所言，發(fā)育和分化過程并不導(dǎo)致細胞全能性的喪失，但是，在一個完整的植物中，每個分化細胞都是某個器官和組織中的一個成員，它只能在與其周圍成員相互協(xié)調(diào)和彼此制約當中，恰如其分地發(fā)揮整個植株所賦予它的一定的功能，而不具備施展其全能性的外部條件。然而，這些細胞若是一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所受到的遺傳上的控制和生理上的制約，在不定期下的培養(yǎng)條件下，就會發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化狀態(tài)，變?yōu)榉稚毎瑢崿F(xiàn)脫分化過程。然后，這些脫分化細胞經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織（離體隔離）。 大量研究表明，幾乎所有高等植物的各種器官，如根、

55、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和形成層等，離體后在適當條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。由此可見，愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置（反映了內(nèi)源激素水平）對愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。二愈傷組織形成的過程愈傷組織形成的過程 外植體中已分化的活細胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個時期（誘導(dǎo)期、分裂期和形成期）。 誘導(dǎo)期：細胞分裂的準備期 誘導(dǎo)期是細胞準備進行分裂的時期。接種的外植體材料的細胞通常都是成熟細胞，處于靜止狀態(tài)，細胞大小沒有多大變化，外

56、觀無明顯特征，但細胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等（1981）在研究離體培養(yǎng)的油橄欖莖段時發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大。 誘導(dǎo)期的長短，因植物種類和外植體的生理狀況和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長到40h以上。 分裂期：細胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時期 分裂期是指細胞通過一分為二的分裂，不斷增生子細胞的過程。外植體的細胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細胞開始迅速分裂，使細胞脫分化。分裂期主要表現(xiàn)如下： 1.細胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細胞數(shù)可增加10倍。 2.每個細胞平均鮮重下降。這

57、是由于細胞鮮重的增加不如細胞數(shù)目的增加快的緣故。 3.細胞體積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生組織細胞特性。 4細胞的核和核仁增大到最大。 5.細胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變。 6. 隨著細胞不斷分裂和組織生長，細胞的總干重、蛋白質(zhì)和 核酸含量大大增加，新細胞壁的合成極快。 總之，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。 形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生 形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時期。進入形成期后，細胞的平均大小相對穩(wěn)定，不再減少，細胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細胞的

58、分裂，結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（meristemoid），稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長中心，或者進一步分化為維管組織結(jié)節(jié)由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細胞作平周分裂成為形成層狀細胞，并形成了部分維管組織如管胞、纖維細胞等，但不形成維管系統(tǒng)。由于此期細胞分裂已基本停止，細胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細胞，因此有人又將此期稱為分化期。 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 脫分化細胞不斷進行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個過程叫做繼代。通過繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織

59、無限期地保持在不分的增殖狀態(tài)。然而，如果讓愈傷組織留在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)而不繼代，它們則不可避免地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。 三三 愈傷組織的生長愈傷組織的生長 一般來說，愈傷組織的增殖生長只發(fā)生發(fā)生在不與瓊脂接觸的表面，而與瓊脂接觸的一面極少細胞增殖，只是細胞分化形成緊密的組織塊。它是愈傷組織表面或近表面瘤狀物生長的結(jié)果。愈傷組織之間的質(zhì)地質(zhì)地有顯著不同，有的很松脆，有的很堅實，且這兩類愈傷組織可互相轉(zhuǎn)變。其方法是：加入高濃度的生長物質(zhì)，可使堅實的愈傷組織變?yōu)樗纱?。反之，減低或除去生長物質(zhì)，則松脆的愈傷組織可以轉(zhuǎn)變?yōu)閳詫?。松脆愈傷組織都有大量的分生組織上中心，進行活躍的細胞分裂，為大而未分化的

60、細胞所分開；而不脆的確良愈傷組織很少分化，大都是高度液泡化的細胞。脆的愈傷組織是進行懸浮培養(yǎng)最適合的材料，稍經(jīng)機械振蕩，即可使組織分散成單細胞或少數(shù)幾個細胞組成的小細胞團。在培養(yǎng)中細胞產(chǎn)生迅速增殖，而堅實的愈傷組織中的細胞間被果膠質(zhì)緊緊地粘著，因而往往不能形成良好的懸浮系統(tǒng)。愈傷組織的質(zhì)地不同是由其內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的差異所引起的。堅實致密的愈傷組織內(nèi)無大的細胞間隙，而由管狀細胞組成維管組織；松脆愈傷組織內(nèi)有大量的細胞間隙，細胞排列毫無次序。生長旺盛的愈傷組織生長旺盛的愈傷組織一般呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。 外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀