NT4ApoptinHA2TAT融合基因重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建及鑒定

1、nt4 apopt in ha2 tat融合基因重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建及鑒定【摘要】 目的：構(gòu)建編碼融合基因nt4 apoptin ha2 tat的重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體。方法: 利用限制性?xún)?nèi)切酶切相應(yīng)載體后將apopt in和ha2 tat連 入puc19/nt4質(zhì)粒，再將融合基因nt4 apopt in ha2 tat 亞克隆至腺相關(guān)病毒的穿梭質(zhì)粒內(nèi)，與輔助質(zhì)粒paav/ad. 腺病毒質(zhì)粒pfg140共同轉(zhuǎn)染hek 293細(xì)胞，通過(guò)同源重組 獲得nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒載體，收集 病毒上清，dot blot法測(cè)定其滴度。mtt比色法觀察 nt4 apoptin ha

2、2 tat重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，對(duì) hepg2細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果：經(jīng)酶切及測(cè)序證實(shí)克隆出 nt4 apoptin ha2 tat融合基因；得到高滴度的 (3. 14x1015 pfu/l)重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體。nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，對(duì) hepg2細(xì)胞有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)凋亡作用，與對(duì)照組比較，處理組 細(xì)胞的存活率明顯降低。結(jié)論：通過(guò)分子克隆體外重組技術(shù) 成功制備了 nt4 apopt in ha2 tat重組腺相關(guān)病毒載體， 為下一步的apoptin應(yīng)用于基因治療奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒腫 瘤融合基因近年

3、來(lái)不損傷正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)和相關(guān)肽的發(fā)現(xiàn)為 腫瘤的基因治療帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)，利用重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)這類(lèi)基 因，注射實(shí)體瘤之后，可以在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá) 殺傷腫瘤的蛋白lo體外合成或基因工程表達(dá)的cav vp3 蛋白apopt in能特異地誘導(dǎo)多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡, 但對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無(wú)作用2。本研究在前期工作的基 礎(chǔ)上擬構(gòu)建神經(jīng)生長(zhǎng)因子4(nt4)信號(hào)肽引導(dǎo)的可分泌表達(dá) apopt in ha2 tat的重組腺相關(guān)病毒高效表達(dá)載體，為下 一步進(jìn)行apoptin應(yīng)用于基因治療奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1. 1材料克隆載體pgem t/apoptin質(zhì)粒有本課題 組構(gòu)建3；限制性?xún)?nèi)切酶nael、x

4、ho i、ecor i、sal i 購(gòu)自寶泰克生物公司；taq dna聚合酶、t4 dna連接酶購(gòu) 自華美生物公司；puc19/nt4質(zhì)粒、pgem t/ha2 tat、腺 病毒穿梭質(zhì)粒psscmv及輔助質(zhì)粒paav/ad.腺病毒質(zhì)粒 pfg140,大腸桿菌dh5a及293細(xì)胞系、小鼠成纖維細(xì)胞 nih3t3、hepg2人肝癌細(xì)胞系均由西安華廣生物工程公司提 供。1. 2方法1.2. 1 puc19/nt4 apoptin ha2 tat 載體構(gòu)建 堿 裂解法大量制備重組質(zhì)粒pgem t/apoptin、 pgem t/ha2 tat,分別用限制性?xún)?nèi)切酶nae i、kpn i、 xho i消化

5、，切取apoptin. ha2 tat用t4 dna連接酶連 入帶有相同末端的已線(xiàn)性化puc19/nt4載體。用連接反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化制備好的感受態(tài)細(xì)菌e. coli dh5a菌株，隨機(jī)挑選 單個(gè)菌落，接種于含有氨節(jié)西林的lb培養(yǎng)基內(nèi)，379增殖 培養(yǎng)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶ecor i和 xhol雙酶切，篩選出含有約710 bp左右的重組質(zhì)粒 puc19/nt4 apoptin ha2 tat。1.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒 psscmv/nt4 apoptin ha2 tat 的構(gòu)建 ecor i 和 sal i 雙 酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒psscmv和ecor i和xhol雙酶切 pu

6、c19/nt4 apopt in ha2 tat, 低 熔點(diǎn)凝 膠回收 nt4 apoptin ha2 tat 和線(xiàn)性化的 psscmv, t4 dna 連接 酶連接，轉(zhuǎn)化e. coli dh5a感受態(tài)細(xì)菌，挑選轉(zhuǎn)化的菌落, 提取質(zhì)粒，ecor i和hind iii雙酶切篩選并鑒定陽(yáng)性克隆。1.2.3重組腺相關(guān)病毒的包裝與鑒定及滴度測(cè)定采 用磷酸鈣沉淀法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek 293細(xì)胞獲取重組腺相 關(guān)病毒。轉(zhuǎn)染3d后，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)同源重組構(gòu)建出重組腺 相關(guān)病毒，毒斑出現(xiàn)，反復(fù)凍融含病毒栓子的培養(yǎng)基，提 取病毒，收集含病毒的上清液感染80%成片的hek 293細(xì) 胞。dot blot法測(cè)定重組病毒

7、滴度。1.2.4重組腺相關(guān)病毒對(duì)hepg2細(xì)胞存活率的影響 將hepg2細(xì)胞以每孔10 000個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔培養(yǎng)板 中，每孔體積200 ul,培養(yǎng)24 h后分實(shí)驗(yàn)組、正常細(xì)胞 小鼠成纖維細(xì)胞nih3t3組和空病毒組，各加入10moi的空 病毒或重組病毒，病毒作用2 h后更換新鮮正常培養(yǎng)液，在 病毒作用后的24、48、72 h分別終止培養(yǎng)（以上每組各設(shè) 3個(gè)復(fù)孔）,加入mtt試劑（5 g/l）20 nl, 379孵育4 h,將 含mtt的培養(yǎng)液移去，加入二甲基亞楓150 pl,搖勻15 min,使反應(yīng)產(chǎn)物充分溶解。在測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀 上測(cè)定光密度a值。2結(jié)果2. 1 重組質(zhì)

8、粒 puc 19/nt4 apoptin ha2 tat 的構(gòu) 建apoptin和ha2 tat被酶切后插入puc19/nt4載體，轉(zhuǎn) 化e. coli,挑選克隆，用限制性?xún)?nèi)切酶ecor i和xho i雙酶 切，篩選出含有約710 bp左右的重組質(zhì)粒 puc19/nt4 apoptin ha2 tat （圖 1）。2.2重組腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒 psscmv/nt4 apoptin ha2 tat 的構(gòu)建與鑒定 nt4 apoptin ha2 tat 插入 psscmv 載體，轉(zhuǎn)化 e. coli, 挑選克隆，進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒 psscmv/nt4 apoptin ha2 tat 的大小為

9、 5 860 bp。用 ecor i和hind iii雙酶切獲得5 100 bp和760 bp兩個(gè)片段（圖 2）o圖 1 puc19/nt4 apoptin ha2 tat 重組質(zhì)?；?酶切鑒定（略）fig 1 the result of puc19/nt4 apoptin ha2 tat digested with restriction enzyme1: x dna/hind iii marker； 2： 100 bp dna marker； 3： digested with ecor i /xho i ； 4： digested with ecori ； 5： puc19/nt4 ap

10、optin ha2 tat.圖 2 psscmv/nt4結(jié)果（略）apoptinha2tat質(zhì)粒酶切鑒定fig2theresultofpsscmv/nt4 apoptinha2 tatdigestedwithrestriction enzyme1： psscmv/nt4apoptinha2tat； 2： digestedwith ecor i /hind iii； 3：入 dna/hind iii marker； 4： 100bp dna marker.2. 3 nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒包裝 與滴度測(cè)定 將構(gòu)建好的psscmv/nt4 apopt in ha2 ta

11、t 質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒paav/ad.腺病毒質(zhì)粒pfg140,應(yīng)用磷酸 鈣dna共沉法共轉(zhuǎn)染80%融合的293細(xì)胞，包裝得到 nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒。用收獲的毒種感 染293細(xì)胞，至m0i為10時(shí)，加pbs液細(xì)胞冰融，離心取 上清-20"保存?zhèn)溆谩⑺@得的病毒液對(duì)數(shù)比稀釋后，利 用 dot blot 法測(cè)定滴度為 3. 14x1015 pfu/lo2.4 mtt比色法測(cè)定重組腺相關(guān)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺 傷作用aav mock和nt4 apopt in ha2 tat重組腺相關(guān) 病毒分別感染hepg2細(xì)胞和nih3t3細(xì)胞。隨著作用時(shí)間的 延長(zhǎng)，nt4 apo

12、ptin ha2 tat重組腺病毒組比aav mock 組的hepg2細(xì)胞的存活率明顯降低，而對(duì)nih3t3組無(wú)影響, 說(shuō)明nt4 apoptin ha2 tat重組腺相關(guān)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞 有選擇性誘導(dǎo)凋亡作用（圖3）。3討論目的基因或載體對(duì)正常組織的毒性和腫瘤細(xì)胞對(duì)治 療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應(yīng)用的瓶頸，而 apoptin的發(fā)現(xiàn)給抗腫瘤的基因治療帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。體外合成 或基因工程表達(dá)的apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫 瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無(wú)作用；而且這種選擇 性凋亡作用既不依賴(lài)于p53的介導(dǎo)，也不被bel 2過(guò)表達(dá) 所抑制，而大部分腫瘤的耐藥產(chǎn)生都是由p53的缺失（突

13、變） 或bel 2的過(guò)表達(dá)引起。對(duì)惡性細(xì)胞的選擇性凋亡且對(duì)抗 耐藥的特點(diǎn)使apoptin成為基因治療的理想目的基因（蛋 白）。近來(lái)的大量研究表明，無(wú)論是和免疫制劑4還是和 化療藥物5聯(lián)用都能增強(qiáng)治療效果，顯示出了凋亡素的 巨大應(yīng)用前景。圖 3 aav/nt4 apoptin ha2 tat 對(duì) hepg2 細(xì)胞和 nih3t3細(xì)胞存活率的影響（略）fig 3 the effect of aav/nt4 apoptin ha2 tat on hepg2 cells and nih3t3 cellsa： the effect on nih3t3 cells； b： the effect on he

14、pg2 cells bp&lt；0. 01 mock vs apoptin and control vs apoptin.但是，現(xiàn)行的apoptin腫瘤基因治療中，多數(shù)以腫瘤 細(xì)胞為靶細(xì)胞，在這種治療模式下，雖然降低毒副作用， 但治療效應(yīng)往往隨腫瘤細(xì)胞的凋亡而終止，增加了治療的 難度和費(fèi)用?；诖耍狙芯吭赼popt in基因的兩端融合進(jìn) 3個(gè)基因片段：nt4為信號(hào)肽，可以引導(dǎo)nt4 apoptin ha2 tat通過(guò)膜性結(jié)構(gòu)并在經(jīng)過(guò)脂質(zhì)膜時(shí) 通過(guò)信號(hào)肽酶切位點(diǎn)切下信號(hào)肽(nt4),從而使成熟肽分 泌(apoptin ha2 tat)到細(xì)胞外；tat 6為 hiv 中的 穿膜肽，可介導(dǎo)

15、分泌之胞外的apoptin ha2 tat以巨胞飲 作用進(jìn)入細(xì)胞；ha2 7為流感病血毒凝素2亞單位的nh2 的結(jié)構(gòu)域，為ph依賴(lài)性融合胎，在低ph環(huán)境中可增強(qiáng) apopt in ha2 tat從巨胞飲體中逃逸。如果應(yīng)用含有nt4 apoptin ha2 tat的重組腺相 關(guān)病毒轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞或其他相關(guān)細(xì)胞會(huì)輸體內(nèi)，將大大 提高治療基因的表達(dá)效率和延長(zhǎng)分泌時(shí)間，同時(shí)依賴(lài)于 apoptin的特異性殺傷和對(duì)抗耐藥的特性，則解決了基因治 療的有效性和安全性的關(guān)鍵問(wèn)題。應(yīng)用mtt法檢測(cè)感染重組病毒的人肝癌hepg2細(xì)胞和 小鼠成纖維細(xì)胞nih3t3活性，結(jié)果顯示分泌表達(dá)目的基因 的重組aav對(duì)hepg

16、2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú) 作用，說(shuō)明融合蛋白沒(méi)有改變apopt in的腫瘤特異性殺傷特 性，且融合蛋白能夠被分泌表達(dá)且發(fā)揮了生物活性。其對(duì)表 達(dá)效率和分泌時(shí)間的正影響及轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞的在體效應(yīng), 則有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 zhang yh, leliveld sr, kooistra k, et al. recombina nt apop tin multi mers kill tu mor cells but are nontoxic and epitope shielded in a normal cell specific fachionj exp cell res

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