微生物限度檢查法驗(yàn)證方案模板

1、10/11驗(yàn) 證 文 件 文件編號(hào)：SVP YF-0-01-00驗(yàn)證文件*微生物限度檢查法驗(yàn)證方案*有限責(zé)任公司目 錄1 適用范圍2 目的3 概述4 驗(yàn)證所需要的儀器設(shè)備及文件5 可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)6 測(cè)試方法7 異常情況處理8 測(cè)試結(jié)果9 結(jié)論10 再驗(yàn)證周期 11附表1適用范圍本驗(yàn)證方案適用于*微生物限度檢查法的驗(yàn)證。2目的建立該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，并對(duì)其有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保試驗(yàn)方法的完整性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3概述3.1*處方中含有鹽酸氨基葡萄糖以及常用輔料等成分，文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸氨基葡萄糖有抑菌活性。根據(jù)以上特點(diǎn)，按中國(guó)藥典2010年版附錄 J微生物限度檢查法方法的“供試品的制

2、備”項(xiàng)下需用特殊方法制備供試液中（6）制備供試液?！凹?xì)菌，霉菌，酵母菌計(jì)數(shù)”項(xiàng)下檢查法2薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌，霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，控制菌檢查項(xiàng)下控制菌的檢查法驗(yàn)證。3.2驗(yàn)證時(shí)間：*批平行三次試驗(yàn)。4驗(yàn)證所需要的儀器設(shè)備及文件4.1驗(yàn)證需用儀器設(shè)備器具名稱規(guī)格型號(hào)檢定日期檢定單位有效期電熱恒溫培養(yǎng)箱HG101-3多用生化培養(yǎng)箱SP-80蒸汽滅菌器ZDX-35B4.2驗(yàn)證所需要的文件及存放地方資料名稱存放地點(diǎn)HG101-3電熱恒溫培養(yǎng)箱操作維護(hù)保養(yǎng)SOPSP-80型生化培養(yǎng)箱操作維護(hù)保養(yǎng)SOPZDX-35B蒸汽滅菌器操作維護(hù)保養(yǎng)SOP微生物限度檢查法SOP5可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)5.1*微生

3、物限度檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定細(xì)菌總數(shù)1000個(gè)/g霉菌、酵母菌100個(gè)/g大腸埃希菌不得檢出5.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。5.3控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果判斷若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌（檢出試驗(yàn)菌判斷如下），按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。5.4

4、大腸埃希菌檢查結(jié)果判斷如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h。瓊脂判供試品檢出大腸埃希菌；若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判定供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，

5、圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)6測(cè)試方法6.1供試品*，批號(hào)(*)。6.2培養(yǎng)基及菌種6.2.1采用符合中國(guó)藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，中國(guó)藥品生物制品檢定所制。6.2.2枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。6.3菌液制備6.3.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌的檢查的菌液制備6.3.1.1取新鮮的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉

6、湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)32.5±2.5培養(yǎng)1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.3.1.2取新鮮的白色念珠菌的培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)2448h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.3.1.3取新鮮的黑曲霉培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)57d，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或

7、紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.3.2控制菌的檢查菌液的制備取新鮮的大腸埃希菌的培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)32.5±2.5培養(yǎng)1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含細(xì)菌數(shù)約為10100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.3.3供試品制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。6.4驗(yàn)證試驗(yàn)方法: 細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證采用上述供試品，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別人工污染

8、上述5種代表試驗(yàn)菌株?？刂凭鷻z驗(yàn)方法驗(yàn)證采用上述批供試品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。6.4.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)6.4.1.1試驗(yàn)分組6.4.1.1.1供試品對(duì)照組：取上述供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底細(xì)菌數(shù)；取上述供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)；6.4.1.1.2菌液組：分別取上述5種試驗(yàn)菌懸液1ml，制備濾膜，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。6.4.1.1.3試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml，過濾，沖洗，分別在最后一次的沖洗液中加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗(yàn)菌懸液各1ml，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。取1：10供試液1ml，過濾，沖

9、洗，分別在最后一次的沖洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉懸液各1ml，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定霉菌數(shù)。6.4.1.1.4稀釋劑對(duì)照組：取實(shí)驗(yàn)用的稀釋液1ml代替供試品，加入實(shí)驗(yàn)菌，制備濾膜，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。6.4.1.2驗(yàn)證試驗(yàn)操作6.4.1.2.1取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。取上述供試液1ml，加至適量稀釋劑中，混勻，過濾，用pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜,沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。6.4.1.2.2陰性對(duì)照試驗(yàn)取實(shí)驗(yàn)用的稀釋液1ml

10、，制備濾膜，濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，均不得有菌生長(zhǎng)。6.4.1.2.3培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至57天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)別兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特

11、殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌，細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。6.4.1.3菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于1g供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以<1報(bào)告菌數(shù)，或<1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌落數(shù)。6.4.1.4計(jì)算公式試 驗(yàn)組的菌回 收率 % 6.4.2控制菌的檢查驗(yàn)證試驗(yàn)6.4.2.1試驗(yàn)分組6.2.2.1.1試驗(yàn)組取1：10供試液10ml，過濾，沖洗，在最后一次

12、的沖洗液中加入大腸埃希菌試驗(yàn)菌懸液1ml，過濾，濾膜接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。6.2.2.1.2供試品組取1：10供試液10ml，制備濾膜，濾膜接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。6.4.2.2陽性對(duì)照試驗(yàn)取大腸埃希菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出大腸埃希菌。6.4.2.3陰性對(duì)照試驗(yàn)取稀釋液10ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。6.4.2.4大腸埃希菌的試驗(yàn)取供試液10 ml（相當(dāng)于供試品1g），制備濾膜，濾膜接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳酸培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。取上述培養(yǎng)物0.2

13、ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作為本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。7異常情況處理嚴(yán)格按照微生物限度檢查法SOP操作，如在檢測(cè)中出現(xiàn)不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問題原因后，決定是否需對(duì)本方案中設(shè)定的*的微生物限度檢查方法進(jìn)行修改，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。8測(cè)試結(jié)果8.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果見附表1。8.2控制菌的檢查方法驗(yàn)證結(jié)果見附表2。

14、8.3按確定的驗(yàn)證方法檢驗(yàn)三批產(chǎn)品微生物限度檢查結(jié)果見附表3。9結(jié)論9.1按照*檢驗(yàn)操作規(guī)程，我們?cè)O(shè)定了該產(chǎn)品的微生物限度檢驗(yàn)方法，對(duì)*批*進(jìn)行了微生物方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，證明該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 檢驗(yàn)需要， GMP要求， 使用。9.2通過*的檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)的回收率均大于70%，說明*用薄膜過濾法檢驗(yàn)無抑菌性，故適用于*的微生物的檢驗(yàn)。確定*微生物限度檢查法如下： 質(zhì)量負(fù)責(zé)人： 審核人： 檢驗(yàn)人10再驗(yàn)證周期10.1*的處方發(fā)生變動(dòng)或其它因素變更導(dǎo)致*的物料性質(zhì)改變時(shí)，需要對(duì)本方案進(jìn)行調(diào)整后作方法學(xué)再驗(yàn)證。10.2國(guó)家相關(guān)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)修改后需要對(duì)本方法重新進(jìn)行再驗(yàn)證。11附表附表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果 試驗(yàn)分類實(shí)驗(yàn)次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌試驗(yàn)組123菌液組123稀釋劑對(duì)照組123供試品對(duì)照組1供試品對(duì)照組2供試品對(duì)照組3陰性對(duì)照組1陰性對(duì)照組2陰性對(duì)照組3稀釋劑對(duì)照組菌回收率223試驗(yàn)組的菌回收率123結(jié)果判定備注：*驗(yàn)證一批平行三次，批號(hào)：*結(jié)論：按照*微生物限度檢查法驗(yàn)證方案檢驗(yàn)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)日期： 報(bào)告日期： 檢 驗(yàn) 人： 復(fù) 核 人： 質(zhì)量部QA: 統(tǒng)計(jì)日期： 附表2