肝癌表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)展

1、肝癌表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)展暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 汪文 黃衛(wèi)【摘要】 肝細(xì)胞癌是高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤，近年基礎(chǔ)研究的熱點集中在以基因表達(dá)、調(diào)控為主要內(nèi)容的表觀遺傳學(xué)研究，在DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA和基因組印記等方面的研究成果為揭示肝癌發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的診治手段提供了理論依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】肝癌 表觀遺傳學(xué) 肝細(xì)胞癌（hepatic cellular cancer，HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的致死腫瘤之一，其發(fā)生是一個從慢性肝炎/肝硬化和異型結(jié)節(jié)增生到肝癌的漸進(jìn)、多階段進(jìn)程，迄今我們還無法確立一個明晰模式，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，逐步認(rèn)識到肝癌形成與等位基因損失、染色體異

2、常、基因突變、表觀遺傳變化都有密切關(guān)系，以往的研究多著眼于基因組、基因序列的改變，與之相對的是近年興起的表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）研究，即在不改變基因序列的基礎(chǔ)上，通過多種方式改變遺傳基因的功能和特性，并可通過細(xì)胞分裂和增殖周期遺傳的基因組修飾方式。表觀遺傳可通過DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、以及非編碼RNA等多種方式來實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控1。近年來，肝癌表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展集中在這幾個方面：一、肝癌相關(guān)基因甲基化狀態(tài)1. 肝癌相關(guān)基因甲基化腫瘤的發(fā)生涉及多種基因的異常表達(dá)，甲基化狀態(tài)的改變是其中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)基因組整體甲基化水平下調(diào)和CpG島局部甲基化程度

3、的異常升高。抑癌基因的高甲基化可以直接抑制其表達(dá)，是近年來研究的熱點；而低甲基化卻能促使致癌基因活化，細(xì)胞惡變，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。近期多個研究報道了肝癌啟動子甲基化的基因，包括ASPP1、ASPP2、BASP1、SRD5A2、SCARA5 、DLC1、CDKN2B、SOCS1、CDH1、GSTP1、ARHI、SLIT2、T-cadherin 2-9，這些基因可能是潛在的抑癌基因。早期甲基化研究發(fā)現(xiàn)常見癌基因如ras、myc甲基化水平降低，但近年來低甲基化基因的報道相對較少，如MYC6，是否是致癌基因尚需進(jìn)一步證實。甲基化的研究方法可幫助我們發(fā)現(xiàn)更多的抑癌基因，也能為基因治療尋找新途徑。有學(xué)者發(fā)

4、現(xiàn)人肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中肝細(xì)胞生長因子活化劑抑制因子2（HGF activator inhibitor 2，HAI-2）啟動子區(qū)過甲基化，其表達(dá)明顯受到抑制；而體外異位表達(dá)HAI-2 可抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲力，體內(nèi)實驗證實高表達(dá)的HAI-2可抑制肝癌的發(fā)生10。此外評估相關(guān)基因甲基化狀態(tài)還可以為臨床預(yù)后提供依據(jù)，Tip30啟動子甲基化程度與預(yù)后負(fù)相關(guān)，高甲基化Tip30 組的患者復(fù)發(fā)率、死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低甲基化組。11。以上研究大都提出用DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來恢復(fù)抑制基因的活性治療肝癌29，但是這可能加重DNA廣泛低甲基化的趨勢，影響染色體的穩(wěn)定性而促進(jìn)腫瘤的形成，因此在防止癌癥發(fā)生的同

5、時，可能造成整個基因組的不穩(wěn)定性增加而導(dǎo)致其他類型癌癥的風(fēng)險，因此如何提高甲基化修飾的選擇性是我們面臨的新課題。2.與甲基化相互作用的其它因素· 病毒感染是肝癌的高風(fēng)險因素之一，Jung研究表明，乙肝病毒癌基因的主要產(chǎn)物HBX通過上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和3a，促進(jìn)維甲酸受體-2（RAR-2）啟動子甲基化，同時影響某些細(xì)胞周期G（1）相關(guān)因子如p16、p21、p27水平的表達(dá)，與對照組相比較，HBX表達(dá)的人肝癌細(xì)胞，維甲酸無法誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制；如果經(jīng)過DNA甲基化抑制劑5氮雜胞苷處理，解除了對RAR-2的抑制，對維甲酸的敏感性可以完全恢復(fù)，因此，在乙肝病毒介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程中，乙型肝

6、炎病毒X下調(diào)RAR-2可能是一個關(guān)鍵步驟12。乙型肝炎病毒X還通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase3A ，DNMT3A）、組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase，HDAC-1）交互作用，影響多個基因如interleukin-4 receptor、IGFBP3、CDH6、metallothionein-1F的表達(dá)13。此外HBx還可通過MyD88（myeloid differentiation factor 88）基因活化來促進(jìn)IL-6在肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)14。Feng研究發(fā)現(xiàn)，在伴有HBV和HCV感染的肝細(xì)胞癌患者肝組織中，十個基因甲

7、基化狀態(tài)不盡相同，推測不同病毒感染發(fā)展為肝細(xì)胞癌有不同的表觀遺傳學(xué)機(jī)制15。Zhang等在檢測120例HCC甲基化表型時發(fā)現(xiàn)，CIMP（CpG island methylator phenotype）陽性腫瘤組織中端粒酶表達(dá)水平明顯高于CIMP陰性腫瘤組織，提示甲基化在端粒酶活性調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮一定的作用16。二、組蛋白修飾組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)修飾的另一種重要機(jī)制。真核細(xì)胞細(xì)胞核中的核小體主要由四種組蛋白（H2A，H2B，H3和H4）構(gòu)成，組蛋白和纏繞于組蛋白的DNA共同組成了核小體。組蛋白修飾包括組蛋白磷酸化、乙?；?、甲基化、ADP-核糖基化等過程17。尤其是組蛋白乙酰化、甲基化修飾能為相關(guān)

8、調(diào)控蛋白提供其在組蛋白上的附著位點，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和活性。乙酰化修飾大多在組蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位點，它們既能激活基因也能使基因沉默。而甲基化修飾主要在組蛋白H3和H4的賴氨酸和精氨酸兩類殘基上。研究顯示，在進(jìn)化過程中組蛋白甲基化和DNA甲基化兩者在機(jī)能上被聯(lián)系在一起，如Iliopoulos等研究64例肝癌、42例正常肝組織和7株肝癌細(xì)胞株時發(fā)現(xiàn)hTERT 基因表達(dá)受DNA甲基化、組蛋白H3-K9和轉(zhuǎn)錄因子c-myc多個途徑調(diào)控18。活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生Snail，一種可以下調(diào)E鈣

9、粘蛋白（E-cadherin）表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，Snail通過恢復(fù)組蛋白去乙?；?（HDAC-1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）誘發(fā)E-cadherin啟動子甲基化，揭示了ROS致癌作用的表觀遺傳學(xué)機(jī)制19。病毒感染也常伴隨組蛋白修飾，Liao等研究證實丁型肝炎病毒感染可介導(dǎo)叢生蛋白（clusterin）表達(dá)，丁型肝炎病毒伴隨組蛋白H3過乙酰化，可能是其致肝癌發(fā)生的主要機(jī)制20。組蛋白修飾相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)為開發(fā)肝癌診治新方法開辟了新途徑，Chang等發(fā)現(xiàn)肝癌及癌旁組織c-Jun N-terminal kinase（JNK）活性持續(xù)升高，與腫瘤體積大小正相關(guān)，同時組蛋白H3的lys4、lys9位

10、點甲基化，提示在肝癌發(fā)生過程中JNK通過表觀遺傳機(jī)制發(fā)揮重要作用21，可應(yīng)用于肝癌早期診斷和預(yù)后評估。動物實驗表明，二甲氨基偶氮苯（dimethylaminoazobenzene，DAB）可誘導(dǎo)組蛋白去乙?；?（histone deacetylase，HDAC-1）過表達(dá)導(dǎo)致大鼠肝癌發(fā)生，而茶多酚可能通過抑制HDAC-1 表達(dá)而對預(yù)防DAB誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生具有一定作用22，因此茶多酚可以作為肝癌預(yù)防和治療的候選藥物，有待進(jìn)一步篩選或驗證。三、非編碼RNA （Noncoding RNA，ncRNA）非編碼RNA可影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，在多種表觀遺傳現(xiàn)象中發(fā)揮作用。ncRNA按照大小可分為長鏈和短鏈2種

11、。長鏈ncRNA在基因蔟以至于整個染色體水平發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，短鏈ncRNA 在基因組水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，可介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，決定著細(xì)胞的命運(yùn)，還對外源的核酸序列有降解作用以保護(hù)本身的基因組23。DDC（Diethyl1，4-dihydro-2，4，6，-trimethyl-3，5 -pyridinedicarboxylate）可通過表觀遺傳修飾DNA和組蛋白致小鼠肝細(xì)胞變性，改變其細(xì)胞表型，DDC作用后可見三種非編碼RNA表達(dá)異常，其中H19、反義胰島素樣生長因子2受體（antisense Igf2r，AIR）ncRNA水平上調(diào)，GTL2/MEG3下調(diào)，停藥1月后

12、恢復(fù)，DDC誘導(dǎo)肝癌發(fā)生后H19、AIR的ncRNA水平持續(xù)上調(diào)。甲基供體S腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）可阻止DDC的作用，其機(jī)制是否通過影響H19、AIR的轉(zhuǎn)錄尚需進(jìn)一步明確 24。MicroRNA（miRNA）是一類能夠調(diào)控基因表達(dá)的短鏈非編碼RNA，短發(fā)夾RNA（shRNA）可被剪切形成miRNA或產(chǎn)生RNA干擾的siRNA。Bo Wang等證實CDAA（Choline Deficient and Amino Acid）飲食小鼠早期miR-181b的表達(dá)與TGF-信號通路相關(guān)，其靶點腫瘤抑制基因TIMP3的表達(dá)明顯受到抑制，miR-181b上調(diào)亦能增強(qiáng)

13、肝癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。另有研究確定miR-221的過表達(dá)也在肝癌形成中起關(guān)鍵作用，提出抑制miR-221表達(dá)有望成為肝癌治療的新途徑25，26。但是Shelly Beer等卻發(fā)現(xiàn)即使是無序列相關(guān)性的小劑量shRNA仍能引起肝細(xì)胞miRNA的表達(dá)紊亂，誘導(dǎo)凋亡，伴隨肝細(xì)胞損傷，刺激相鄰肝細(xì)胞增殖，加速肝臟的腫瘤發(fā)生，因此這一有前途的生物治療技術(shù)亦存在相當(dāng)?shù)娘L(fēng)險27。四、基因組印記（genomic imprinting）的異常基因組印記是一種非孟德爾的遺傳規(guī)律，來自雙親的某些等位基因，在子代的表達(dá)不同，有些只有父源的基因有轉(zhuǎn)錄活性，而母源的同一基因則始終處于沉默狀態(tài)，另一些基因的情況則相反。這

14、是由于源自某一親本的等位基因或它所在染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，導(dǎo)致不同親本來源的兩個等位基因在子代細(xì)胞中表達(dá)不同。在基因組中的這類現(xiàn)象就是基因組印記。印記基因的形成和表達(dá)存在一復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，普遍認(rèn)為與甲基化有關(guān)，并受多種因素的影響。正是由于印記是正常發(fā)育必不可少的調(diào)控機(jī)制，印記行為的異常必然引起多種相關(guān)疾病，特別是印記異?？勺鳛橐环N新的致瘤機(jī)制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Segat等采用等位基因熒光探針檢測230名HCC患者和230名健康人，對比肝細(xì)胞癌患者和對照組34個基因中50個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），除rs2304052外

15、沒有發(fā)現(xiàn)差異，rs2304052位于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）基因，HCC患者表達(dá)rs2304052 C等位基因與對照組比較有有統(tǒng)計學(xué)差別， rs2304052 C等位基因表達(dá)發(fā)生HCC的風(fēng)險升高（OR=2.76）28 。許多研究證實肝癌發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程，除相關(guān)基因序列改變導(dǎo)致癌基因激活和抑癌基因失活的致癌模式外，表觀遺傳改變逐漸為人們所認(rèn)識，而DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀調(diào)控的主要方式在肝癌發(fā)生的早期已經(jīng)發(fā)生，而且大多同時或相互作用，涉及不同功能的基因，所以全

16、面掌握不同時期肝癌表觀遺傳狀態(tài)與規(guī)律，對闡明肝癌的發(fā)生機(jī)制、早期診斷、評價預(yù)后以及臨床治療有指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)1. Egger G，Liang G，Aparicio A，et al. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature，2004，429：446-457.2. Zhao J，Wu G，Bu F，et al. Epigenetic silence of ankyrin-repeat-containing，SH3-domain-containing，and proline-rich-reg

17、ion-containing protein 1 （ASPP1） and ASPP2 genes promotes tumor growth in hepatitis B virus -positive hepatocellular carcinoma. Hepatology，2010，51（1）：142-153.3. Tsunedomi R，Ogawa Y，Iizuka N，et al. The assessment of methylated BASP1 and SRD5A2 levels in the detection of early hepatocellular carcinoma

18、. Int J Oncol，2010，36（1）：205-212.4. Huang J，Zheng DL，Qin FS，et al. Genetic and epigenetic silencing of SCARA5 may contribute to human hepatocellular carcinoma by activating FAK signaling. J Clin Invest，2010，120（1）：223-241. 5. Ko FC，Yeung YS，Wong CM，et al. Deleted in liver cancer 1 isoforms are disti

19、nctly expressed in human tissues，functionally different and under differential transcriptional regulation in hepatocellular carcinoma. Liver Int， 2010，30（1）：139-148. 6. Kiran M， Chawla YK， Kaur J. Methylation profiling of tumor suppressor genes and oncogenes in hepatitis virus-related hepatocellular

20、 carcinoma in northern India. Cancer Genet Cytogenet，2009，195（2）：112-119.7. Huang J，Lin Y，Li L，et al. ARHI，as a novel suppressor of cell growth and downregulated in human hepatocellular carcinoma，could contribute to hepatocarcinogenesis. Mol Carcinog，2009，48（2）：130-140.8. Jin J，You H，Yu B，et al. Epi

21、genetic inactivation of SLIT2 in human hepatocellular carcinomas. Biochem Biophys Res Commun，2009，379（1）：86-91.9. Chan DW，Lee JM，Chan PC，et al. Genetic and epigenetic inactivation of T-cadherin in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer，2008，123（5）：1043-1052.10. Tung EK，Wong CM，Yau TO，et

22、al. HAI-2 is epigenetically downregulated in human hepatocellular carcinoma，and its Kunitz domain type 1 is critical for anti-invasive functions. Int J Cancer，2009，124（8）：1811-1819.11. Lu B，Ma Y，Wu G，et al. Methylation of Tip30 promoter is associated with poor prognosis in human hepatocellular carci

23、noma. Clin Cancer Res，2008，14（22）：7405-7412.12. Jung JK， Park SH， Jang KL. Hepatitis B virus X protein overcomes the growth-inhibitory potential of retinoic acid by downregulating retinoic acid receptor-beta2 expression via DNA methylation. J Gen Virol，2010，91（Pt 2）：493-500.13. Zheng DL，Zhang L，Chen

24、g N，et al. Epigenetic modification induced by hepatitis B virus X protein via interaction with de novo DNA methyltransferase DNMT3A. J Hepatol，2009，50（2）：377-387. 14.Xiang WQ，F(xiàn)eng WF，Ke W，et al. Hepatitis B virus X protein stimulates IL-6 expression in hepatocytes via a MyD88-dependent pathway. J He

25、patol. 2011 Jan;54(1):26-33.15. Feng Q， Stern J， Hawes S，et al. DNA methylation changes in normal liver tissues and hepatocellular carcinoma with different viral infection. Exp Mol Pathol，2010 Jan 13. 16. Zhang C， Guo X， Jiang G，et al. CpG island methylator phenotype association with upregulated tel

26、omerase activity in hepatocellular carcinoma. Int J Cancer，2008，123（5）：998-1004.17 Linggi BE，Brandt SJ，Sun ZW，et al. Translating the histone code into leukemia. J Cell Biochem，2005，96：938-950.18. Iliopoulos D， Satra M， Drakaki A，et al. Epigenetic regulation of hTERT promoter in hepatocellular carcin

27、omas. Int J Oncol. 2009，34（2）：391-399.19. Lim SO，Gu JM，Kim MS，et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma：methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology，2008，135（6）：2128-2140.20. Liao FT，Lee YJ，Ko JL，et al. Hepatitis delta virus epigenetically e

28、nhances clusterin expression via histone acetylation in human hepatocellular carcinoma cells. J Gen Virol，2009，90（Pt 5）：1124-1134.21. Chang Q，Zhang Y，Beezhold KJ，et al. Sustained JNK1 activation is associated with altered histone H3 methylations in human liver cancer. J Hepatol，2009，50（2）：323-333. 2

29、2. Murugan RS，Vinothini G，Hara Y，et al. Black tea polyphenols target matrix metalloproteinases，RECK，proangiogenic molecules and histone deacetylase in a rat hepatocarcinogenesis model. Anticancer Res，2009，29（6）：2301-2305.23. Dykxhoorn DM，Chowdhury D，Lieberman J. RNA interference and cancer： endogenous pathways and therapeutic approaches. Adv E