亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法

1、甲基化檢測(cè)方法（亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法）甲基化是目前的研究熱點(diǎn)， 就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得， 與大家分享。 希望能夠?qū)?大家有所幫助。第一部分 基因組 DNA 的提取。 這一步?jīng)]有懸念，完全可以購(gòu)買供細(xì)胞或組織使用的 DNA 提取試劑盒，如果實(shí)驗(yàn)室條件成 熟，自己配試劑提取完全可以。 DNA 比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因 組 DNA 應(yīng)該是完整的。此步重點(diǎn)在于 DNA 的純度， 即減少或避免 RNA 、蛋白的污染很重要。 因此在提取過程中需 使用蛋白酶 K 及 RNA 酶以去除兩者。使用兩者的細(xì)節(jié)：1：蛋白酶 K 可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml ；2：RNA

2、酶必須要配制成不含 DNA 酶的 RNA 酶，即在購(gòu)買市售 RNA 酶后進(jìn)行再處理，配 制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。驗(yàn)證提取 DNA 的純度的方法有二：1 ：紫外分光光度計(jì)計(jì)算 OD 比值； 2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。我傾向于第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA 的純度，并根據(jù) Marker 的上樣量估計(jì)其濃度，以用于下一步的修飾第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組 DNA 如不特別指出，所用雙蒸水（ DDW ）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。1:將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用 DDW 稀釋至50ul;2：加 5.5

3、ul 新鮮配制的 3M NaOH；3:42 C 水浴 30min；水浴期間配制：4：10mM 對(duì)苯二酚（氫醌） ， 加 30ul 至上述水浴后混合液中； （溶液變成淡黃色）5: 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma, S9000）,配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用 DDW 稀釋，并 以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加 入 NaOH 后會(huì)慢慢溶解，需要有耐心。 PH 一定要準(zhǔn)確為 5.0。加 520ul 至上述水浴后 溶液 中。6: EP 管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。7:加 200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。&

4、 50C避光水浴 16h。一般此步在 4pm 開始做，熟練的話不到 5pm 即可完成，水浴 16h 正好至次日 8am 以后收， 時(shí)間上很合適。這一步細(xì)節(jié):1 :基因組 DNA 的量不需十分精確，寧多勿少，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失，且 此方法修飾最多可至 4ug。2:所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要精確。3:亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性，一定用堿將PH 調(diào)制 5.0，否則 PH 不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸 收。4：水浴最好達(dá) 16 小時(shí)，雖可以短至 8 小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不完全。第三部分 修飾后 DNA 純化回收EP 管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。1. 將移液器槍頭

5、伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液 至一潔凈 1.5mlEP 管中。2：以下使用 Promega Wizard Cleanup DNA 純化回收系統(tǒng)（ Promega， A7280 ）1）70C水浴預(yù)熱 DDW ;配制80%異丙醇；2）加 1ml Promega 's Wizard DNAClean-up resin ，輕柔顛倒混勻，使 DNA 充分與樹脂結(jié)合；3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針?biāo)?，如果有真空?fù)壓吸引器，使用起來很方便；如果 沒有，需要自備 3ml-5ml 注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回 收小柱緊密連接后，將 上述混合物用移液器移至針

6、筒內(nèi)，用 2ml 以上的 EP 管放置小柱下接收廢液。加針?biāo)?，輕輕 加壓，將液體擠出，此時(shí)可見小柱內(nèi)有白色的樹 脂沉積。4） 將注射器與小柱分離后拔出針?biāo)?，再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2ml 80的異丙 醇，插入針?biāo)?，輕輕加壓，將異丙醇擠出。此為洗滌步驟。5） 將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5ml潔凈EP管上，離心12000rpm , 2min,以 甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時(shí)，修飾后 DNA 處于與樹脂結(jié)合狀態(tài)。6） 將小柱取下置于另一潔凈 1.5mlEP 管上, 移液器加 50ul 預(yù)熱好的 DDW ,室溫放置 5min。7） 離心12000rpm，20s，此為洗脫步驟

7、，此時(shí) EP管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后DNA溶液， 終體積為 50ul。3：加 5.5ul 新鮮配制的 3M NaOH ，室溫放置 15min。4:力口 33ul 10M乙酸銨，以中和 NaOH，使溶液 PH于7.0左右。5：加 4ul 10mg/ml 糖原，此作為沉淀指示劑，因?yàn)槠渑c乙醇混合后可產(chǎn)生沉淀，便于以后 離心后辨別回收物的位置，以防在吸取殘余乙醇時(shí)將回收物吸走。其實(shí)，加入這些糖原究竟能起多大作用，不好說。不過有國(guó)產(chǎn)糖原賣，包裝不大，也很便宜，買來一用，算嚴(yán)格遵 守文獻(xiàn)的步驟吧。6:加 270ul 冰無水乙醇，置于 -20 度，過夜沉淀。有人為沉淀最短可至 2 小時(shí)，但我認(rèn)為 時(shí)間長(zhǎng)些

8、可能會(huì)更好。并且做到此步驟時(shí)，一般會(huì)到中午，如果樣本多的話要到下午，不妨放置過夜，日程可以輕松些，順便做些其他試驗(yàn)。如果想當(dāng)天做完，沒有問題，但我認(rèn)為 最好多沉淀些時(shí)候，至少 6小時(shí)吧（這是經(jīng)驗(yàn)，我做過最少 6 小 時(shí)，也是可以的，再短就 不敢發(fā)表意見了）7: 4 度， 12000rpm 離心， 30min ，倒去上清液，收集沉淀。不必吸凈。8:加 500ul 70% 乙醇，不要將沉淀吹打起來，只要把乙醇加上即可。輕柔傾斜EP 管，旋轉(zhuǎn)一圈，再次離心，4度12000rpm，5min。離心后倒掉上清，再加同量乙醇，同樣再做一遍。 此為洗滌步驟，共 2 次。9:倒掉上清，并常溫簡(jiǎn)短離心后，將附壁乙

9、醇離至EP 管底，移液器小心將殘余液體吸凈，室溫干燥5min，或沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí)，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修飾后 DNA 的純化回收，所得為修飾后 DNA 溶液，可用于此后的進(jìn)一步 實(shí)驗(yàn)。10: -20 C保存DNA溶液。此步細(xì)節(jié): 1：在使用注射器時(shí)，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會(huì)將小柱內(nèi)的薄膜擠破，失去作 用。2：乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20 度保存，乙酸銨室溫即可，因?yàn)檫@樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在 4 度，取出用時(shí)也會(huì)有很多溶質(zhì)析出。3：異丙醇、 70% 乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現(xiàn)場(chǎng)配也很方便。 此步關(guān)鍵

10、是在樹脂與 DNA 的結(jié)合上，這就再次強(qiáng)調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉 PH 值得重要性。 因?yàn)闃渲cDNA結(jié)合需要有一個(gè)適當(dāng)?shù)?PH,如前一步?jīng)]做好，此步樹脂不能與 DNA很好 結(jié)合，將會(huì)帶來災(zāi)難性后果，即 DNA 隨著液體被擠出了，洗脫時(shí)實(shí)際已沒有任何 DNA 了。第四部分 修飾后 DNA 用于 PCR 這一步也沒有懸念。我主要談一下這里面的幾個(gè)比較棘手的問題： 1：引物問題：我感覺自己設(shè)計(jì)引物有相當(dāng)?shù)碾y度，我曾設(shè)計(jì)過幾對(duì)引物，并且試驗(yàn)了一下， 但以失敗告終。 如果時(shí)間充裕、 作的又是比較新的基因文獻(xiàn)不多， 自己 設(shè)計(jì)引物沒有問題。 如果不是這樣， 還是參考文獻(xiàn)更好些。 首先查閱 SCI 分值高的文

11、獻(xiàn)， 然后是著名實(shí)驗(yàn)室的文 獻(xiàn)，如果國(guó)內(nèi)有做的，更好了，可以直接聯(lián)系咨 詢。查到序列后，一定要和 Genbank 中的 序列進(jìn)行比對(duì)，防止有印刷錯(cuò)誤造成的個(gè)別堿基的差別。然后再到google 上搜一下，看用的人多否，體系條件 是否一樣。用的人多、體系條件一樣，表明可重復(fù)性比較強(qiáng)。我也是 按此行事，算比較順利。2: Taq酶問題：有文獻(xiàn)用高保真的金牌Taq( Platinum)，但我感覺只要體系正確、變性退火等條件合適，一般的熱啟動(dòng)酶是可以的。我開始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg+的LA緩沖液。有時(shí)候用沒了，暫時(shí)以Takara的普通Taq酶也可以。如何選 擇，可以根

12、據(jù)自己的情況。初作者還是用好一點(diǎn)的酶。3: PCR的條件：變性一般都選擇95度，3min。其余我感覺還是根據(jù)文獻(xiàn)，退火可以根據(jù)你的引物的退火溫度在小范圍內(nèi)嘗試。 一般和文獻(xiàn)報(bào)道差別不大。 只是擴(kuò)增片斷特異性的問 題。建議根據(jù)文獻(xiàn)。4:做PCR的EP管最好選擇進(jìn)口的，壁薄且厚度均勻，這可以保證溫度的迅速變化可以及 時(shí)傳遞給管內(nèi)的反應(yīng)液，使體系真正在所設(shè)定的溫度下運(yùn)行。5： PCR 儀：如果在某一個(gè)儀器上作出來了，最好一直用此儀器繼續(xù)。不同的儀器“脾氣”也不一樣， 但 EP 管必要和儀器內(nèi)的插孔緊密結(jié)合方好， 留有空隙， 我認(rèn)為會(huì)影響溫度的傳遞。 這一部分有些啰嗦，只是個(gè)人一些不成熟經(jīng)驗(yàn)。有疑問處

13、，請(qǐng)大家指出，交流。今天先到這 里，現(xiàn)寫一些內(nèi)容，比較費(fèi)勁，總是不能一揮而就。望見諒。歇息一會(huì)準(zhǔn)備寫最后藍(lán)白斑篩 選克隆這一部分。第五部分 PCR 產(chǎn)物的凝膠回收 這一步比較簡(jiǎn)單，可以購(gòu)買一個(gè)凝膠 PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，國(guó)產(chǎn)的就很好、價(jià)格也合理， 比如 TIANGEN 的產(chǎn)品(用過) 。把切下來的膠按說明書操作即可。幾個(gè)細(xì)節(jié)：1： PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。2：凝膠 DNA 回收時(shí)在 300nm 紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡 量小，保證特異性。3：紫外照射時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則對(duì) DNA 有損傷。4：回收后的 DNA 如不

14、馬上用就儲(chǔ)存于 -20 度，在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。第六部分 PCR 產(chǎn)物與 T 載體的連接和轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選1：連接 T 載體（本實(shí)驗(yàn)使用的是 Promega 的試劑盒）15ul 體系T-easy 1ulLigase 1ul2xbuffer 7.5ulDNA 5.5ul4 度，過夜。2：連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1）-70 度冰箱內(nèi)取出感受態(tài)細(xì)菌，融化后置于冰上；2）連接產(chǎn)物 15ul 全部加入，至于冰上 30 分鐘；3）42 度， 90 秒鐘；4）冰上 2 分鐘；5）800ul LB 培 養(yǎng)基；6）280rpm ，37度，搖床 45 分鐘（將管放水平了搖，保證菌液搖勻） ；7）8000rpm ， 1 分鐘

15、；在超凈臺(tái)內(nèi)去上清，留 100-150ul ；8）涂板： 37 度孵箱過夜； （板為含有氨芐青霉素的固體 LB 培養(yǎng)基） 先涂： X-gar 35ulIPTG 25ul 后涂：混懸液 過夜后可見板上長(zhǎng)出很多藍(lán)色或白色斑點(diǎn)，取白色斑點(diǎn)，尤其是藍(lán)色斑點(diǎn)周圍的白色斑點(diǎn)， 此處自聯(lián)率較低。3：取白斑，劃種于新板上新板：先涂： X-gar 35ulIPTG 25ul 然后于板底劃出分區(qū)，進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)需要，一般一板作 50 個(gè)克隆沒有問題。 針頭挑白斑劃 2 道于板上相應(yīng)區(qū)域內(nèi)。37 度，孵箱過夜。 4：聯(lián)系測(cè)序公司送測(cè)序。一般一個(gè)克隆在 35-45 元。這一部分的細(xì)節(jié)：1：涂板要均勻，保證 Xgar

16、和 IPTG 均勻分布在板面上； 2：不要讓藍(lán)白斑長(zhǎng)得太滿，否則選取克隆時(shí)容易一下挑 2 個(gè)。自己要做 DNA 甲基化方面得實(shí)驗(yàn) ,所以將實(shí)驗(yàn)得大體步驟及注意地方寫出,并加入了別得帖子得部分內(nèi)容后整理出得希望對(duì)做相同實(shí)驗(yàn)得愚友們有所幫助 .Bisulfite Modification (Conversion) of DNASource:Protocol On li neDate Added:Fri May 07 2004Date Modified:Thu Apr 05 2007Abstract: Modifying DNA using sodium bisulfite to convert u

17、nmethylated cytosines to uracils and subseque ntly detect ing methylated cytos ines using methylati on specific PCR (MSP) tech nique or bisulfite genomic sequencing after PCR amplification with or without cloning. This protocol also describes procedure for han dli ng nano gram qua ntities of DNA.Mat

18、erials and Rege ntsPrepare im mediately before use!10 m M hydroquinone(Sigm a; #H 9003)40.5% or 3.9 M sodiumbisulfite (Sigm a; #S 8890,8.1 g/20 m l ), dissolve8.1 g sodiumbisulfite in 17 ml cold water , adjust pH to 5.0 with 10 N NaOH,add water to bringvolum e 20 m l).Dissolve the above soluti ons b

19、y gen tly in vert ingwith a m ini mum amou nt ofmixi ng.Keep the solutions cold and in the darkas m uch as possible.Procedure1.Dilute 1-2(no m ore than 2g) DNA in 50(JTE buffer or water.2.Digest DNA over ni ght with a restricti on en zyme that does not digestthe DNAwith in the regi onof in terest. A

20、lter natively, pass the DNAthrough an arrow-gauge n eedle several times to shear the DNA. This step is opti on al. Ifrestricti on digesti onis not used, proceed to step 4.3.Extract the DNAwith phenol:chloroform:isoamylalcohol (PCI; 25:24:1),precipitate with1/10 volum e 5 M ammon ium acetate and 2 vo

21、lumes etha nolat -85° for 15 min. Cen trifuge (14,000 RPM) at room temperature, removethe super nata nt and wash the pellet twice with 70% etha nol. Dry the pelletand resuspendin 50lpTE (10 m M Tris-HCl, pH7.5,1 m M EDTA).4.Denaturethe DNA by adding5 訕 freshly preparedNaOH (3 M, finalconcentrat

22、ion 0.3 M). Incubate at 37-42C fdr15-30 min. L5.To a silic oni zedm icroce ntrifugetube add:6.7.51030M 40.5% sodiumbisulfite (fin al c oncen trati on: 3.3M)M 10 m M hydroquinoneN ote 555 M den atured DNA from step 4add water to 610MGen tly m ix.In cubate at 55Cover the tube with alum° C for 8-1

23、6 h. N ote 6inumfoil to shield fromthe light.8. Purify DNA using the Geneclean II kit (Intermountain Scientific Corporation)or any other m ethods of your choice. Both column based and silica basedpurificati on can be used.9. After purification,resuspend DNA and add TE to a final volum e of 50M.10. D

24、enature the sam ple with freshly prepared NaOH (as above) and incubate atN ote 737 C for 15 m in.11. Neutralize by addingam monium acetate (pH 7.0) to 3 M.12. Precipitate the DNAwith three volum es of ethanol, centrifuge for 10 min(14,000 RPM) at room tem perature, wash twice with 70%ethanol and dry

25、under a vacuum. Resuspend in 50l TE, and store at -20C wrapped in foil.The treated DNA should be used with in one month as degradati on may occurin the clea ned and froze n sample.13. The resultingDNA now can be used for PCR such as bisulfite genomicsequencing PCR (BSP), m ethylation specific PCR (M

26、SP).Bisulfitemodificati onfor nano gramqua ntities of DNAFor modificationsof sm aller quantities of DNA such as DNA frommicrodissected tissues. The basic changes thatare m ade to the above protocolinclude the method of extraction and the additionof m ussel glycogen toprecipitati ons.The steps are th

27、e same as above and only cha nges are no ted.aller1. In Step 5, the bisulfite reacti on is scaled dow n to accommodate the smvolum e of DNA:o 255 m l sodium bisulfateo 15 m l hydroquinoneo 27.5 m l denatured DNA o 2.5 M water2. In Step 9, TE is added to a final volume of 25 M.3. In Step 12, the prec

28、ipitation is performed in the presenee of 40m3 m usselglycogen at -80 C for 30 m in, followed by centrifugation (14,000RPM) atroom tem perature for 30 m in. The DNA is resuspendedin 25lpTE.Notesodium metabisulfiteNote 1 If 3.9 M sodium bisulfite does not dissolve com pletely, adding hydroquinone and

29、 NaOH (for adjusting pH)may help it dissolve. Alternatively, 2Mcan be used instead, which is equivalent to 3.9 M sodiumbisulfite in m olarity.Note 2To ensure complete denaturation, no more tha n 2gi(or less) of start ingwith restriction endonuceleases is tomaterial (DNA) should be used.Note 3 The pu

30、rpose of digesting DNAfacilitate DNA denaturation to create single stranded molecules because sodiumbisulfite can only react with pyrimidines that are not involvedin base-paring orcytosine residues in single stranded DNA. This step is not a must and can be omittedif other m easures have been taken t

31、o ensure complete denaturation before andduring bisulfite m odification.Note 4 It is im portant that the DNA presence of the bisulfite solution or the m prolonged incubation (30 m in) at higheris com pletely denatured prior to and in the odification will not be complete. We found tem perature (42 °C) yields better results.Note 5 Hydroquinone is an alkalizing agent. Its purpose is to prevent DNA from strand breakage because of depurination.Note 6 Optimizing the duration of bisulf