流式細胞術應用技巧

1、金從國金從國2009.11 2009.11 深圳深圳 利用流式細胞儀利用流式細胞儀( flow cytometer ) 通過檢測熒光通過檢測熒光信號來檢測細胞或其它顆粒性物質（表面或胞漿或胞信號來檢測細胞或其它顆粒性物質（表面或胞漿或胞核）的物理、化學特性并通過這些特性對細胞或顆粒核）的物理、化學特性并通過這些特性對細胞或顆粒進行進行定量。定量。 & 檢測表面標記物檢測表面標記物 & 檢測胞漿標記物檢測胞漿標記物 & 檢測胞核內(nèi)標記物檢測胞核內(nèi)標記物 & 檢測可溶性蛋白檢測可溶性蛋白流式細胞術流式細胞術（flow cytometry）一、流式細胞儀的原理一、流式

2、細胞儀的原理應用技巧的基應用技巧的基礎礎光源：光源：激光激光(488nm 氬離子空冷激光氬離子空冷激光) 細胞：細胞： 單細胞懸單細胞懸液液 液流：液流：鞘液鞘液(sheath fluid) 流動室：流動室：flow cell檢測器：檢測器：光電倍增管光電倍增管(pmt)檢測信號：檢測信號：散射光散射光(fs，ss)，熒光信號，熒光信號(fl1fl4)統(tǒng)計分析：統(tǒng)計分析：計算機計算機 用熒光標記抗體用熒光標記抗體抗體特異性地結合細抗體特異性地結合細胞上對應的抗原胞上對應的抗原表達該抗原的細胞被表達該抗原的細胞被標記上熒光；標記上熒光；抗原表達多的細胞熒抗原表達多的細胞熒光強度強光強度強陽性細胞

3、百分比或濃度陽性細胞百分比或濃度靶蛋白濃度靶蛋白濃度（1）、直標和間標）、直標和間標（2）、細胞膜標和細胞內(nèi)標）、細胞膜標和細胞內(nèi)標（3）、兩種染色：抗體和染料）、兩種染色：抗體和染料（4）、組合標記）、組合標記間接免疫熒光標記法間接免疫熒光標記法直接免疫熒光標記直接免疫熒光標記法法cd3, cd4, cd8, tetramercytokinesdnacd3,4,8, tetramer+cytokinescd3,4,8, tetramer+dnacytokines+dnacd3,4,8, tetramer+cytokines+dna（1）、方案：兩種圖形（散點圖、直方圖）、方案：兩種圖形（散點

4、圖、直方圖）（2）、百分率信息、強度信息）、百分率信息、強度信息（3）、分群：細胞大小（）、分群：細胞大?。╢s）細胞內(nèi)顆粒（）細胞內(nèi)顆粒（ss）（4）、設閾值、設門特征（細分）、設閾值、設門特征（細分）（5）、直接信息、間接信息）、直接信息、間接信息二、流式細胞儀的應用技巧一二、流式細胞儀的應用技巧一 整合項目，樹立體系化概念，整合項目，樹立體系化概念，提高流式使用價值提高流式使用價值患者出現(xiàn)癥狀患者出現(xiàn)癥狀各種抗原（參照白血病各種抗原（參照白血病抗原選擇原則）抗原選擇原則）診斷白血病，確診疾診斷白血病，確診疾病，對白血病進行分病，對白血病進行分型以指導治療型以指導治療治療治療初診時所用抗原

5、中能夠代初診時所用抗原中能夠代表白血病細胞的特殊抗原表白血病細胞的特殊抗原評價療效及治療的療評價療效及治療的療程程同上同上緩解期緩解期動態(tài)跟蹤患者緩解期動態(tài)跟蹤患者緩解期的白血病細胞變化，的白血病細胞變化，及時控制在相應水平及時控制在相應水平下下臨床過程臨床過程fcm檢測項目檢測項目意義意義治療前病人免治療前病人免疫狀況評價疫狀況評價t亞群、亞群、nk、cik、細、細胞因子胞因子是否適合做、能否能是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做培養(yǎng)、值得做cik采集采集mncmnc數(shù)目、純度、數(shù)目、純度、 t亞群、亞群、nk、cik數(shù)目及比例數(shù)目及比例是否達到培養(yǎng)要求、是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù)調(diào)節(jié)細胞數(shù)mn

6、c數(shù)目、數(shù)目、 t亞群、亞群、nk、cik數(shù)目及比例、數(shù)目及比例、cd3、cd8活化狀況活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)是否達標、回輸培養(yǎng)是否達標、回輸時機時機回輸后回輸后t亞群、亞群、nk、cik、細胞、細胞因子因子療效評價、監(jiān)測、下療效評價、監(jiān)測、下次治療的時機次治療的時機cik治療程序治療程序fcm檢測項目檢測項目意義意義云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細細 胞胞 術術 報報 告告 單單 生物免疫治療檢測報告生物免疫治療檢測報告 門診號: 住院號: 42435 姓 名 曹淑英 性別 女 年齡 75 科別 腹一 編號 52 病床號 臨床診斷 胃癌術后

7、 送檢標本 培養(yǎng)物 日期 2006 年 02 月 13 日 流式細胞檢測及分析結果：流式細胞檢測及分析結果： 采 集 前 培 養(yǎng) 后 項 目 % abs（610） % abs（610） cd45+cd3+ 58.5 1068 95.5 679 cd45+cd3+cd4+ 30.8 - 60.8 - cd45+cd3+cd8+ 21.1 - 21.4 - cd45+cd3-cd56+ 17.0 245 4.6 33 cd45+cd3+cd56+ 0.5 7 43.4 310 hla dr-cd3+ 54.8 - 24.1 - hla dr+cd3+ 15.3 - 67.2 - hla dr-cd

8、8+ 31.0 - 14.9 - hla dr+cd8+ 2.0 - 20.7 - 檢測日期 2006 年 01 月 13 日 2006 年 01 月 20 日 送檢醫(yī)生 周永春 實驗者 金從國、李佳 報告日期 2006 年 02 月 20 日 基礎免疫水平基礎免疫水平t亞群、亞群、nk、cik當?shù)夭煌挲g、性別、當?shù)夭煌挲g、性別、民族的免疫水平基礎民族的免疫水平基礎數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)高危人群高危人群hiv檢測陽性檢測陽性t亞群、亞群、nk、cik、 cd4凋亡、細胞因子凋亡、細胞因子hiv檢測陽性前的免檢測陽性前的免疫水平變化狀況及疫水平變化狀況及cd4的凋亡的凋亡t亞群、亞群、nk、cik 、cd

9、3、cd4、cd8活化狀況、活化狀況、細胞細胞因子、因子、cd4凋亡凋亡hiv陽性陽性aids檢出檢出hiv到發(fā)病的情到發(fā)病的情況況aids病人治療病人治療t亞群、亞群、nk、cik、細胞、細胞因子、因子、cd4凋亡、凋亡、 cd3、cd4、cd8活化狀況活化狀況療效評價、監(jiān)測、治療效評價、監(jiān)測、治療效果及病情動態(tài)觀療效果及病情動態(tài)觀察察aids過程過程fcm檢測項目檢測項目意義意義供者動員效果監(jiān)測圖051015202530358月4日8月5日8月5日8月6日8月6日8月7日8月7日8月8日8月8日wbc(x 109/l)mnc(x108/l)cd34+ ( x 106/l)云云 南南 省省

10、腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細細 胞胞 術術 報報 告告 單單 干干/ /祖細胞相對絕對計數(shù)報告祖細胞相對絕對計數(shù)報告 流式號： 門診號: 住院號 外院 姓 名 李艷華 性別 男 年齡 25 科別 外院 標本號 20070919 病床號 8 臨床診斷 nhl 送檢標本 外周血 日期 2007 年 09 月 19 日 流式細胞檢測及分析結果：流式細胞檢測及分析結果： 項目 相對計數(shù) 絕對計數(shù) mnc 41.1% 30 x 108/l cd34+ 1.0% 30 x 106/l cd34+cd38- 0.9% 27 x 106/l cd34+cd38- 0.1

11、% 3 x 106/l 送檢醫(yī)生 何迪 實驗者 金從國、陳曉群 報告日期 2007 年 09 月 19 日 凋亡啟動凋亡啟動細胞內(nèi)細胞內(nèi)ca2+ 動員動員 caspase激活激活脫水致細胞皺縮脫水致細胞皺縮核染色質凝縮核染色質凝縮 線粒體膜電位喪失線粒體膜電位喪失 細胞膜細胞膜ps外翻外翻 核碎片形成核碎片形成dna被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段細胞內(nèi)酸化細胞內(nèi)酸化凋亡小體形成凋亡小體形成三、流式細胞儀的應用技巧二三、流式細胞儀的應用技巧二利用儀器的靈活性，充分整合項目利用儀器的靈活性，充分整合項目1 1、cikcik細胞作用腫瘤細胞的凋亡分細胞作用腫瘤細胞的凋亡分析析2 2、不同細

12、胞的轉染、表達情況、不同細胞的轉染、表達情況3 3、不同分型增殖的細胞分布、不同分型增殖的細胞分布4 4、spsp細胞、非細胞、非spsp細胞細胞 5、腫瘤細胞診斷時、腫瘤細胞診斷時 （1）、胸腹水：把白細胞和癌細胞分開）、胸腹水：把白細胞和癌細胞分開 （2）、穿刺，手術細胞：）、穿刺，手術細胞： 6、組織中的浸潤細胞：、組織中的浸潤細胞：7、th1/th2細胞的分析細胞的分析四、流式細胞儀的應用技巧三四、流式細胞儀的應用技巧三 利用儀器提供的參數(shù)，對所做利用儀器提供的參數(shù)，對所做實驗全面分析評價實驗全面分析評價1、質粒轉染中：、質粒轉染中： 轉染率轉染率 疫苗疫苗 轉染的強度轉染的強度2、同

13、時分析轉染率和轉染強度、同時分析轉染率和轉染強度3、稀有細胞的額外發(fā)現(xiàn)：、稀有細胞的額外發(fā)現(xiàn)： t亞期中：亞期中：cd45+、cd3+、cd4-、cd8- nk細胞：細胞：cd3-cd16+56+ cd3+cd16+56+4、tunecl方法中方法中 不同周期的凋亡狀況不同周期的凋亡狀況 細胞阻滯狀況細胞阻滯狀況 dna斷片發(fā)生時斷片發(fā)生時sos狀況狀況五、流式細胞儀的應用技巧四五、流式細胞儀的應用技巧四 了解相關知識及現(xiàn)有的評價方法，了解相關知識及現(xiàn)有的評價方法，充分應用流式細胞充分應用流式細胞熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙/溴化乙啶染色溴化乙啶染色sgc-7901細胞24hsgc

14、-7901蒿甲醚組24 hsgc-7901 ddp組24hecv-304細胞 24hecv-304蒿甲醚組24hecv-304 ddp組24 h六、流式細胞儀的應用技巧五六、流式細胞儀的應用技巧五 專項應用中的問題及解決方案專項應用中的問題及解決方案免疫細胞相對絕對計數(shù)免疫細胞相對絕對計數(shù)造血干細胞和其他稀有細胞的檢測造血干細胞和其他稀有細胞的檢測血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測dna倍體分析，周期、異倍體分析倍體分析，周期、異倍體分析細胞內(nèi)因子（細胞內(nèi)因子（th1/th2）細胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）細胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）各種凋亡檢測（各種凋亡檢測（apo.

15、2.7 tunecl、dna亞二倍體）亞二倍體）組織中免疫細胞和其他細胞（如組織中免疫細胞和其他細胞（如cxcr、ccr）基因蛋白檢測（如基因蛋白檢測（如p53、bcl-2等）等）白血病免疫分型白血病免疫分型b27檢測檢測動物檢測過程中的問題動物檢測過程中的問題免疫細胞的檢測免疫細胞的檢測t細胞細胞 分群標志分群標志 活化標志活化標志 亞群標志亞群標志b細胞細胞nk細胞細胞cik細胞細胞以以t細胞亞群檢測為例，其余的免疫細胞出現(xiàn)的問題類似細胞亞群檢測為例，其余的免疫細胞出現(xiàn)的問題類似1、標準方案、標準方案 抗抗 凝凝 血血 組組 織織 胸腹水、灌洗液（單細胞懸液）胸腹水、灌洗液（單細胞懸液）加

16、入加入1ml 溶血素（溶血素（nh4cl或或c液或液或a、b、c液）液） 上機檢測上機檢測 結果：結果：cd3+ t cell ：%、abs cd4+ t cell ：%、abs cd8+ t cell ：%、abscd4/ cd8比值比值 2hr內(nèi)加入內(nèi)加入 100ul flow count （100ul/份）份） + 10ul 抗體標本標記抗體標本標記 15-30 min2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（1）、標本環(huán)節(jié)）、標本環(huán)節(jié) 抗凝血：抗凝血： a、抗凝效果不好：如果沒有大的凝血塊，該血可以使、抗凝效果不好：如果沒有大的凝血塊，該血可以使 用，但結果可能受影響。設閾值時最

17、好采用用，但結果可能受影響。設閾值時最好采用fl1 （cd45所在所在）;如果有大的凝血塊，不能用于檢測。如果有大的凝血塊，不能用于檢測。 b、標本在、標本在4或以下放置過：一般不做檢測用?；蛞韵路胖眠^：一般不做檢測用。 c、標本放置時間大于、標本放置時間大于48小時：檢測時盡量用小時：檢測時盡量用fl1設閾值。設閾值。 建議：最好使用新鮮標本檢測，尤其是做絕對計數(shù)時。建議：最好使用新鮮標本檢測，尤其是做絕對計數(shù)時。 d、動物血：對于豬、猴、兔、狗等大動物的，如人一樣、動物血：對于豬、猴、兔、狗等大動物的，如人一樣 處理。而如小白鼠等小動物，由于所采血量少，需要處理。而如小白鼠等小動物，由于所

18、采血量少，需要 先溶血，后加樣處理。如需做絕對計數(shù)，則要求計算先溶血，后加樣處理。如需做絕對計數(shù)，則要求計算 稀釋倍數(shù)，比如稀釋倍數(shù)，比如10ul血加入血加入490ul溶血素相當于稀釋了溶血素相當于稀釋了 350倍。倍。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法組織標本：組織標本： 組織標本做免疫細胞時，通常需要組織標本做免疫細胞時，通常需要cd45設行設行，這樣可排，這樣可排 除非血細胞。除非血細胞。a、組織標本通常不需要研磨，只需用針頭反復搗碎便可：、組織標本通常不需要研磨，只需用針頭反復搗碎便可：這樣可以減少組織細胞的量。這樣可以減少組織細胞的量。b、穿刺細胞：手術標本需要反復清洗表

19、面附有的血液，、穿刺細胞：手術標本需要反復清洗表面附有的血液，否則會影響檢測結果。否則會影響檢測結果。c、組織標本一般保存在生理鹽水中。、組織標本一般保存在生理鹽水中。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法胸腹水、灌洗液胸腹水、灌洗液： 通常也需要通常也需要cd45設門設門a、都需要濃縮處理：一般取、都需要濃縮處理：一般取250ml左右，靜置左右，靜置4hr后取沉后取沉淀物離心。淀物離心。b、如果需要計數(shù)，則需做體積換算，比如、如果需要計數(shù)，則需做體積換算，比如250ml500ul，相當于濃縮了，相當于濃縮了500倍。倍。組織、胸腹水標本，希望做組織、胸腹水標本，希望做2次過濾，第一次

20、為標記前，次過濾，第一次為標記前，采用采用200目過濾，第二次為上機檢測前，采用目過濾，第二次為上機檢測前，采用300目過濾。目過濾。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（2）、抗體環(huán)節(jié)）、抗體環(huán)節(jié)試劑選擇試劑選擇a、盡量選擇試劑組合多的作為標記抗體，比如、盡量選擇試劑組合多的作為標記抗體，比如t亞群亞群cd45/cd4/cd3/cd8：最佳選擇最佳選擇cd4/cd8/cd3： 可用，但做起來會有很多麻煩可用，但做起來會有很多麻煩單一抗體：單一抗體： 不可用不可用 2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法b、選擇試劑時，不但需要選擇陽性標記，同時也需要選、選擇試劑時，不但需要選

21、擇陽性標記，同時也需要選擇陰性標記。擇陰性標記。比如：比如：cd4t 細胞細胞cd45+cd3+cd4+cd8- b 細胞細胞cd19+cd3- nk 細胞細胞cd3-cd16+56+ cd34+ 細胞細胞cd34+cd38-尤其在科研項目中，一般應選擇尤其在科研項目中，一般應選擇2-3個陽性標記，同時選個陽性標記，同時選擇擇1-2個陰性標記，否則所做出來的結果將會有很大誤差。個陰性標記，否則所做出來的結果將會有很大誤差。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法c、在醫(yī)學中，一般標記抗原較弱的，需選擇較強的染料，、在醫(yī)學中，一般標記抗原較弱的，需選擇較強的染料，尤其我們在做稀有細胞的時候

22、，比如尤其我們在做稀有細胞的時候，比如dc細胞，細胞，cd34細胞，細胞，cik細胞，間充質干細胞等，一般均選擇標記細胞，間充質干細胞等，一般均選擇標記pe細胞。細胞。標記條件：標記條件：一般一般18 25，如果溫度低或高效果都不好，如果溫度低或高效果都不好標記時間：標記時間：根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于15 min。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法標記的先后順序標記的先后順序 a、先標記膜表面的，后標記胞漿內(nèi)、先標記膜表面的，后標記胞漿內(nèi) b、先處理、先處理抗體抗體，后加染料，后加染料 c、透膜處理后的標本不能強烈振蕩。、透膜處理后的標本不能

23、強烈振蕩。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法 溶血環(huán)節(jié)溶血環(huán)節(jié)溶血素的選擇溶血素的選擇 a、a b 液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀 c b、nh4cl（主要成分是（主要成分是nh4cl 、nh4hco3、edta ） c、溶血素、溶血素c（專配試劑）（專配試劑）2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法 自配溶血素要求：自配溶血素要求： a、必須在儀器試驗后方可使用、必須在儀器試驗后方可使用 b、有條件時需做、有條件時需做ph、微粒分析、微粒分析 c、放置時間不宜過長，尤其是、放置時間不宜過長，尤其是a液液2、可能的問題及解

24、決辦法、可能的問題及解決辦法溶血液加入可能出現(xiàn)的問題溶血液加入可能出現(xiàn)的問題 溶血效果不好溶血效果不好v 溫度問題：溫度問題：c液溶血和溫度關聯(lián)較大，一般不能放液溶血和溫度關聯(lián)較大，一般不能放 4冰冰 箱，可以采用水浴箱，可以采用水浴 37 v 溶血劑不夠：可以離心后追加溶血劑溶血劑不夠：可以離心后追加溶血劑 以上處理如果還不可以，則需要選擇：以上處理如果還不可以，則需要選擇：不重要的標本不重要的標本：重新再標記：重新再標記重要而又沒有剩余的標本重要而又沒有剩余的標本：反復離心，選擇：反復離心，選擇1200-2000轉左轉左右的速度，建議每次離心均加入右的速度，建議每次離心均加入2-3mlnh

25、4cl溶血素。溶血素。有些抗體或染料對酸比較敏感：有些抗體或染料對酸比較敏感：比如比如pe標記，溶血后會使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜標記，溶血后會使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜置置10 -30 min2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法加入加入flowcout環(huán)節(jié)環(huán)節(jié) flowcout必須在加入溶血素后才能加入，否則會影響檢測必須在加入溶血素后才能加入，否則會影響檢測結果，同時加入結果，同時加入flowcout后后 2 hr 后必須上機檢測。后必須上機檢測。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（5）、檢測出結果環(huán)節(jié)：）、檢測出結果環(huán)節(jié)：a、上機前需要搖勻標本，儀器開機

26、超過、上機前需要搖勻標本，儀器開機超過30min，flow check 10% 2% 外電壓穩(wěn)定等等。外電壓穩(wěn)定等等。b、方案盡量采用完整方案，比如方案盡量采用完整方案，比如t亞群：亞群：由于由于flowcout微球在所有通道上都有信號，一般選擇沒有使用微球在所有通道上都有信號，一般選擇沒有使用的熒光通道作為收集通道，如果沒有剩余通道，就選擇熒光較的熒光通道作為收集通道，如果沒有剩余通道，就選擇熒光較強的染料所在的通道強的染料所在的通道方案是實現(xiàn)正確操作和得到正確結果的平臺，建議建立方方案是實現(xiàn)正確操作和得到正確結果的平臺，建議建立方 案時盡量建立完整方案案時盡量建立完整方案2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法c、檢測結果、檢測結果1）、檢測結果必須嚴格按醫(yī)學含義得到，比如）、檢測結果必須嚴格按醫(yī)學含義得到，比如 cd4+t細胞細胞cd45+cd3+cd4+cd8-(百姓定義上的結果百姓定義上的結果) (醫(yī)學定義上的結果醫(yī)學定義上的結果) 2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法2）、相對計數(shù)：一般醫(yī)院檢測）、相對計數(shù)：一般醫(yī)院檢測t亞群時可以只做相對數(shù)，這亞群時可以只做相對數(shù)，這樣就可以樣就可以使用使用prism門，門，cd3+%、cd4+%、cd8+ %，如果