western常見問題

1、Western Blot常見問題及處理點擊次數(shù)：4890 發(fā)布時間：2011/6/10      1、western blot 的優(yōu)點答： 靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？答： 原因有很多: a） 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞；b） 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白

2、沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB？答：可以選擇0.2ml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反

3、應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a） 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應位置；d） 二抗失活。 9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時間過長。10、DAB好還是ECM好？答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的

4、底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什么？答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉移時間不夠，。13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做

5、免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？答： 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120g，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？答：懷疑是樣

6、品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？ 答：一般5×106就足夠了17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？ 答：能，沒有問題。18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋

7、白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加20甲醇。21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7，積層膠 3.5。22、如果上

8、樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？ 答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：80，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。25、二抗是生物素化

9、的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？ 解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用代替應該好一點26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？答：Western Blot一般上樣30100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合

10、Western Blot的怎樣做也不行。27、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入）。28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。29、有什么方法可以提高上樣量？答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積

11、來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關系， 盡量多上就行了， 但是不要超載.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表

12、位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。34、Western Blot 中抗體的可以重復應用嗎？答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用23次。稀釋后應在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。35、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活

13、化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜好象不是很好，為什么？答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。38、做Western Blot時，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。39、如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？答

14、：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？答：這么廣的分布

15、不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12SDS-PAGE， 濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDSPAGE，200mA 90-120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）.44、我用的是可視ma

16、rker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8，10，12，都是這樣。marker是新買的。答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？答：對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參，實驗嚴謹。46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的，有很多都可以當成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量Western Blot，內(nèi)參-actin，GAPDH哪個好？答：選用beta-actin就可以

17、。48、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。49、轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L.50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好