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文檔簡介
1、Western Blot常見問題及處理點擊次數(shù):4890 發(fā)布時間:2011/6/10 1、western blot 的優(yōu)點答: 靈敏,可達ng級,用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便,特異性高。2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白?答: 原因有很多: a) 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì),換一種細胞;b) 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗體不能識別目標蛋白,多看看說明,看是否有問題。3、我的細胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?答: a) 有沉淀可能因為你的蛋白
2、沒有變性完全,可以適當提高SDS 濃度,同時將樣品煮沸時間延長, b) 也不排除你的抗原濃度過高,這時再加入適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD),請問怎么做WB?答:可以選擇0.2ml的膜,同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱,怎么加強?答:可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟,有什么解決方法?答:減少抗原上樣量,降低一抗?jié)舛?,改變一抗孵育時間,提高牛奶濃度。7、目標帶是空白,周圍有背景,是為什么?答:你的一抗?jié)舛容^高,二抗上HRP 催化活力太強,同時你的顯色底物處于一個臨界點,反
3、應時間不長,將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?,或更換新底物。8、我的膠片是一片空白,是怎么回事?答:如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強,將底物消耗光;b) ECM底物中H2O2,不穩(wěn)定,失活;c) ECL底物沒覆蓋到相應位置;d) 二抗失活。 9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答:a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.;b) 顯影時間過長。10、DAB好還是ECM好?答:DAB 有毒,但是比較靈敏,是HRP 最敏感的
4、底物;ECM結果容易控制,但被催化時靈敏度差一點,但如果達到閥值,就特別靈敏,可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。11、抗原檢測出的分子量比資料上的大,是怎么回事?答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時間延長,可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等12、蛋白轉移不到膜上,但膠上有,同時Marker 轉上去了,為什么?答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉移時間不夠,。13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般最好加。但是不加也可以,大部分時候是不用加的。14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在,需要做
5、免疫組化和western blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?答: 免疫組化可以用來進行定位,但是不能精確定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子,進行定量,但是不能定位。 兩種實驗的一抗有時候不能通用,公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做Western Blot時,提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現(xiàn)在越來越差,上樣量已加到120g,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?答:懷疑是樣
6、品問題,可能是:1,樣品不能反復凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查Western Blot過程, 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f,一般加PMSF就可以了,最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。16、細胞水平要做western blot,多少細胞提的蛋白夠做western blot? 答:一般5×106就足夠了17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對western blot有無影響? 答:能,沒有問題。18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋
7、白,操作需要注意什么?答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上,就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉移時你可以用減少電流延長時間,加20甲醇。21、想分離的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?答:200kd的蛋白不好做, 分離膠用7,積層膠 3.5。22、如果上
8、樣量超載,要用什么方法來增加上樣量? 答:可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久?答:80,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。24、我所測定的蛋白分子量是105KD,按理說分離膠應當采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11的配方,不知為何?答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),但需注意條帶位置。25、二抗是生物素化
9、的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調(diào)整,能否再用5的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,是嗎? 解答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用代替應該好一點26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?答:Western Blot一般上樣30100微克不等,結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。開始摸條件時,為了拿到陽性結果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當然背景也就出來了。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復地試了,當然有的不適合
10、Western Blot的怎樣做也不行。27、做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品?答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質(zhì)溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入)。28、問大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?答:做200kd蛋白的Western Blot時要注意,分離膠最好選擇>7%的;剝膠時要小心;轉移時間需要相應延長;要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析)。29、有什么方法可以提高上樣量?答:a)可以濃縮樣品;增大上樣體積
11、來增大上樣量;b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求?答:上樣量要根據(jù)實驗的要求來定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關系, 盡量多上就行了, 但是不要超載.31、一抗,二抗的比例是否重要?答:比較重要,調(diào)整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?答:對二抗無要求,要看你實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?答:免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表
12、位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。34、Western Blot 中抗體的可以重復應用嗎?答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用23次。稀釋后應在23天內(nèi)使用,4度保存,避免反復凍融。35、在做Western Blot時,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?答:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活
13、化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎?答:可以。37、轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶,為什么大蛋白分子的一端的轉膜好象不是很好,為什么?答:這是正常的,大分子的蛋白轉移的慢, 你延長轉移時間和電流,大分子一端就會好的多,但是小分子的就有可能會變淡。38、做Western Blot時,同樣的抗體免疫組化能做出,而Western Blot卻不能?答:這多半是抗體的問題,要看抗體的說明,是否能做Western Blot和免疫組化。39、如果是6×8轉印膜,要加多少一抗?答
14、:一抗的稀釋度是有說明的,根據(jù)你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。40、上下槽緩沖液有何要求,怎樣才能達到最佳效果。答:無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液,下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢?是有的成分不對嗎?答:沒什么問題,就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來,在里面加點水保持濕度就可以了;也可能母液(30%聚丙酰胺)有問題,你可以重新配制一份觀察;能夠替換的試劑,盡量換一下,選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,如要分離小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好嗎?答:這么廣的分布
15、不好轉移,一般建議:21kd和66kd可以一起轉,12SDS-PAGE, 濕轉120mA, 45-60min就可以了, 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié);170kd 用7%SDSPAGE,200mA 90-120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上, 轉移效率低怎么樣解決?答:可以考慮:轉移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度),因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率,但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉移時間;轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉移效率;用優(yōu)質(zhì)的轉移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米).44、我用的是可視ma
16、rker,但是電泳總跑不全8條帶,請問什么原因?怎樣改善?膠用過8,10,12,都是這樣。marker是新買的。答:一般來說,是小分子量Marker跑走了,增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參?答:對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參,實驗嚴謹。46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適?答:可以選用組蛋白,組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的,有很多都可以當成內(nèi)參,在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量Western Blot,內(nèi)參-actin,GAPDH哪個好?答:選用beta-actin就可以
17、。48、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎?受不受組織來源的影響?胞膜和胞漿有區(qū)別嗎?答:一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法,一般來說都沒有區(qū)別。49、轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”,其中TBST最后那個T是Tween嗎,濃度多大?答:是Tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl:8g, Tris base:2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L.50、封閉,一抗,二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢,比如在室溫里做,或者要在4度下?答:均可在室溫進行,如果時間不夠,一抗孵育可以先在室溫進行一個小時,然后4度過夜。51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么?答:一般而言,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),這樣的話,反復洗幾次后,蛋白容易掉下來,結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,同時也有疏水作用,但相對較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,結果較好
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