第十一章植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

1、 植物次生代謝產(chǎn)物：植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并植物中一大類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝。謝。（一）、概述（一）、概述 植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為： 酚類化合物：酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜類化合物：萜類化合物：三萜皂甙；甾體

2、皂甙；單萜、倍半萜、二萜三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔類、有機(jī)酸多炔類、有機(jī)酸 植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。等領(lǐng)域具有重要意義。 李時(shí)珍在李時(shí)珍在本草綱目本草綱目中所開(kāi)列的中所開(kāi)列的18921892種藥種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約2525的法定的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生

3、代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來(lái)源，名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來(lái)源，可以用于殺蟲(chóng)、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害是理可以用于殺蟲(chóng)、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。想的環(huán)保產(chǎn)品。 自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)方式 生產(chǎn)周期生產(chǎn)周期 紫草寧含量（干重）紫草寧含量（干重）完整植物完整植物 23年年 12植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 3周周 14植物次生代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛能植物次生代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長(zhǎng)春花堿治

4、療白血病長(zhǎng)春花堿治療白血病1820（美國(guó)）（美國(guó)）奎寧治療瘧疾奎寧治療瘧疾510（美國(guó)）（美國(guó)）致熱素殺蟲(chóng)劑致熱素殺蟲(chóng)劑20（全世界）（全世界）毛地黃心臟病藥毛地黃心臟病藥2055（美國(guó)）（美國(guó)） 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)適宜于植物從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 從細(xì)胞生長(zhǎng)與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下從細(xì)胞生長(zhǎng)與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個(gè)條件：個(gè)條件： 1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺

5、傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。恒定的產(chǎn)物。 2、細(xì)胞生長(zhǎng)及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間、細(xì)胞生長(zhǎng)及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。好能將其釋放到培養(yǎng)基中。（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立 1、種子細(xì)胞的選擇、種子細(xì)胞的選擇 （1）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類； （2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組

6、織器官）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官 為外植體；為外植體； (3)(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)后，將高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)后，將 單細(xì)胞擴(kuò)增形成的愈傷組織分單細(xì)胞擴(kuò)增形成的愈傷組織分2份，份，1份成分含份成分含 量分析，另量分析，另1份保留培養(yǎng)。份保留培養(yǎng)。2、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng) 種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反

7、應(yīng)器培養(yǎng)。3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 （1 1）成批培養(yǎng)：）成批培養(yǎng)：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。 （2 2）連續(xù)培養(yǎng)：）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷向反應(yīng)器在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷向反應(yīng)器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時(shí)以一定流量從系中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時(shí)以一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。 (3)(3)半連續(xù)培養(yǎng)：半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，在完成成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)從反應(yīng)器中

8、取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。(三三)生物反應(yīng)器類型及特點(diǎn)生物反應(yīng)器類型及特點(diǎn) 大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)用的設(shè)備及控制技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。要復(fù)雜的多。 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)胞抗剪切能植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)胞抗剪切能力弱、易團(tuán)聚等特點(diǎn)。同時(shí)，植物細(xì)胞規(guī)模力弱、易團(tuán)聚等特點(diǎn)。同時(shí)，植物細(xì)胞規(guī)

9、模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮有利于細(xì)胞胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。生長(zhǎng)，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。 總體上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具總體上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。切力。機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在

10、微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因?yàn)橹参锛?xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分；因?yàn)橹参锛?xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置；由于植物細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置；生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置； 為便于取為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器氣壓式培養(yǎng)系統(tǒng)氣壓式培養(yǎng)系統(tǒng)

11、 考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。 旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。 1、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般程序、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有

12、用物質(zhì)的一般程序 （1）選材）選材應(yīng)注意以下條件：應(yīng)注意以下條件： 藥效肯定；藥效肯定； 對(duì)其有效成分有充分的了解；對(duì)其有效成分有充分的了解； 有測(cè)定有效成分和藥理的可靠方法；有測(cè)定有效成分和藥理的可靠方法； 市場(chǎng)短缺或價(jià)格昂貴；市場(chǎng)短缺或價(jià)格昂貴； 取有藥效成分的部位，且該部位較取有藥效成分的部位，且該部位較 易形成愈傷組織。易形成愈傷組織。（2）細(xì)胞株系建立）細(xì)胞株系建立 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。 在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)細(xì)

13、胞培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求：求： 有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng)有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng) 生長(zhǎng)速度快生長(zhǎng)速度快 （3）大量培養(yǎng)）大量培養(yǎng) 將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后，可將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子種子”，進(jìn)，進(jìn)行大量培養(yǎng)。行大量培養(yǎng)。 （4）產(chǎn)品提取與純化）產(chǎn)品提取與純化 從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。有的產(chǎn)品。2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素篩選高產(chǎn)細(xì)胞系篩選高產(chǎn)細(xì)胞系 從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)

14、胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。 篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測(cè)，更新細(xì)胞株系。此，還需要定期檢測(cè)，更新細(xì)胞株系

15、。 第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分裂）；裂）； 第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利指數(shù)生長(zhǎng)停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。于次生物質(zhì)的積累。 、二步培養(yǎng)法、二步培養(yǎng)法、培養(yǎng)基中添加前體、培養(yǎng)基中添加前體 前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。 煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)質(zhì)煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成量。量。 、培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用、培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加加iaa，能合成煙堿，而在含有，能合成煙堿，而在含有2,4-d的培的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。 、培養(yǎng)條件的影響、培養(yǎng)條件的影響 光照、溫度等影響次生代謝。在胡光