第十一章植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

1、 植物次生代謝產(chǎn)物：植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。謝。（一）、概述（一）、概述 植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為： 酚類化合物：酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜類化合物：萜類化合物：三萜皂甙；甾體

2、皂甙；單萜、倍半萜、二萜三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔類、有機酸多炔類、有機酸 植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。等領(lǐng)域具有重要意義。 李時珍在李時珍在本草綱目本草綱目中所開列的中所開列的18921892種藥種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約2525的法定的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生

3、代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害是理可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。想的環(huán)保產(chǎn)品。 自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)方式 生產(chǎn)周期生產(chǎn)周期 紫草寧含量（干重）紫草寧含量（干重）完整植物完整植物 23年年 12植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 3周周 14植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治

4、療白血病長春花堿治療白血病1820（美國）（美國）奎寧治療瘧疾奎寧治療瘧疾510（美國）（美國）致熱素殺蟲劑致熱素殺蟲劑20（全世界）（全世界）毛地黃心臟病藥毛地黃心臟病藥2055（美國）（美國） 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個條件：個條件： 1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺

5、傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。恒定的產(chǎn)物。 2、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。好能將其釋放到培養(yǎng)基中。（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立（二）、植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立 1、種子細(xì)胞的選擇、種子細(xì)胞的選擇 （1）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類； （2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組

6、織器官）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官 為外植體；為外植體； (3)(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：單細(xì)胞培養(yǎng)后，將高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：單細(xì)胞培養(yǎng)后，將 單細(xì)胞擴增形成的愈傷組織分單細(xì)胞擴增形成的愈傷組織分2份，份，1份成分含份成分含 量分析，另量分析，另1份保留培養(yǎng)。份保留培養(yǎng)。2、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng) 種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定幾百毫升到幾升逐級放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反

7、應(yīng)器培養(yǎng)。3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 （1 1）成批培養(yǎng)：）成批培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或在一個培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。 （2 2）連續(xù)培養(yǎng)：）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng)器在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng)器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時以一定流量從系中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時以一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。 (3)(3)半連續(xù)培養(yǎng)：半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個周期后，在完成成批培養(yǎng)的一個周期后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)從反應(yīng)器中

8、取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。(三三)生物反應(yīng)器類型及特點生物反應(yīng)器類型及特點 大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實驗室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采實驗室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)用的設(shè)備及控制技術(shù)比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。要復(fù)雜的多。 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切能植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切能力弱、易團聚等特點。同時，植物細(xì)胞規(guī)模力弱、易團聚等特點。同時，植物細(xì)胞規(guī)

9、模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計不僅要考慮有利于細(xì)胞胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計不僅要考慮有利于細(xì)胞生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。 總體上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具總體上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。切力。機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵機械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在

10、微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細(xì)胞生長周期長，需要隨時補充水分；因為植物細(xì)胞生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計加液裝置；由于植物細(xì)胞和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)的生理活動需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計通氣裝置；生有害氣體，所以必須設(shè)計通氣裝置； 為便于取為便于取樣觀察，一般還設(shè)計有取樣口。樣觀察，一般還設(shè)計有取樣口。 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器氣壓式培養(yǎng)系統(tǒng)氣壓式培養(yǎng)系統(tǒng)

11、 考慮到機械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以考慮到機械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使避免，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。 旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制精確，處理靈活，缺點是培養(yǎng)體積較小。精確，處理靈活，缺點是培養(yǎng)體積較小。 1、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般程序、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有

12、用物質(zhì)的一般程序 （1）選材）選材應(yīng)注意以下條件：應(yīng)注意以下條件： 藥效肯定；藥效肯定； 對其有效成分有充分的了解；對其有效成分有充分的了解； 有測定有效成分和藥理的可靠方法；有測定有效成分和藥理的可靠方法； 市場短缺或價格昂貴；市場短缺或價格昂貴； 取有藥效成分的部位，且該部位較取有藥效成分的部位，且該部位較 易形成愈傷組織。易形成愈傷組織。（2）細(xì)胞株系建立）細(xì)胞株系建立 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。 在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對細(xì)

13、胞培養(yǎng)的選擇有兩個基本要的產(chǎn)量和質(zhì)量，對細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個基本要求：求： 有用物質(zhì)的合成積累能力強有用物質(zhì)的合成積累能力強 生長速度快生長速度快 （3）大量培養(yǎng)）大量培養(yǎng) 將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴大繁殖后，可將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子種子”，進(jìn)，進(jìn)行大量培養(yǎng)。行大量培養(yǎng)。 （4）產(chǎn)品提取與純化）產(chǎn)品提取與純化 從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。有的產(chǎn)品。2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素篩選高產(chǎn)細(xì)胞系篩選高產(chǎn)細(xì)胞系 從實驗材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高從實驗材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)

14、胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。 篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系。此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系

15、。 第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分裂）；裂）； 第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。于次生物質(zhì)的積累。 、二步培養(yǎng)法、二步培養(yǎng)法、培養(yǎng)基中添加前體、培養(yǎng)基中添加前體 前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。 煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)質(zhì)煙堿酸加入，會增加煙堿的生成煙堿酸加入，會增加煙堿的生成量。量。 、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用 植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加加iaa，能合成煙堿，而在含有，能合成煙堿，而在含有2,4-d的培的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。 、培養(yǎng)條件的影響、培養(yǎng)條件的影響 光照、溫度等影響次生代謝。在胡光