第5章生產(chǎn)菌種的制備與保藏

1、第5章 生產(chǎn)菌種的制備與保藏本節(jié)課的重點(diǎn) 1、 種子制備過(guò)程 2、種子質(zhì)量的控制措施本節(jié)課的難點(diǎn) 影響種子質(zhì)量的因素第一節(jié) 生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的種子必須滿足的條件1) 菌體的純種培養(yǎng)物總量適宜，以保證在發(fā)酵罐中有適當(dāng)?shù)慕臃N量；2）微生物菌種的生命力旺盛，移接到發(fā)酵罐中后能夠迅速生長(zhǎng)，利于縮短延滯期，提高設(shè)備的利用率；3）菌種能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，生理狀態(tài)穩(wěn)定；4）無(wú)雜菌和噬菌體的污染。種子擴(kuò)大培養(yǎng)任務(wù)：要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。對(duì)于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過(guò)程來(lái)說(shuō)，必須根據(jù)菌種生長(zhǎng)繁殖速度快慢決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)?？股仡?lèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)采用放線

2、菌，一般采用三級(jí)或四級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)；谷氨酸等氨基酸產(chǎn)品，以及部分酶制劑類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)，采用細(xì)菌，采用二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)。一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的1.提供大量而新鮮的、具有較高活力的菌種。 目的就是：a、縮短發(fā)酵周期 降低能耗、減少染菌的機(jī)會(huì)（空氣過(guò)濾設(shè)備有效時(shí)間是有限的） b、為了使培養(yǎng)菌在數(shù)量上取得絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，抑制雜菌的生長(zhǎng)。從對(duì)數(shù)殘留定律上看，任何滅菌過(guò)程都不能夠做到絕對(duì)無(wú)菌，抑制雜菌生長(zhǎng)除了嚴(yán)格環(huán)境以外，在數(shù)量上讓培養(yǎng)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)也是一種方法，往往是一種行之有效的方法。例如：啤酒的發(fā)酵 2.讓菌種從固試管、液體試管，逐步適應(yīng)，例如：啤酒發(fā)酵 3.菌種經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，可以提高生產(chǎn)的成功率，減少“倒罐

3、”現(xiàn)象。 許多生產(chǎn)菌種往往都是“溶原性”的？ 通過(guò)連續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)，每一級(jí)都要進(jìn)行嚴(yán)格的檢查，對(duì)于不合格的嚴(yán)禁使用，無(wú)疑增加了生產(chǎn)的可靠性。二、擴(kuò)大培養(yǎng)的方法通常有兩種方法：固體法：用于釀造業(yè)（醬油、白酒等），也是源于釀造業(yè)， 有霉菌的純培養(yǎng)，也有混合培養(yǎng)如：大曲液體法：液體深層培養(yǎng)，適合于眾多發(fā)酵行業(yè)1. 液體擴(kuò)培流程固體試管 三角瓶 大三角瓶 一級(jí)種子 二級(jí)種子 三級(jí)種子 發(fā)酵罐 2. 固體擴(kuò)培流程 固體試管 三角瓶 種曲 麩曲（機(jī)械通風(fēng)制曲）兩者的優(yōu)缺點(diǎn)比較： 固體培養(yǎng)（1）酶活力高。（因?yàn)榫z體密度大）（2）生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)菌程度要求不是很?chē)?yán)格。（3）對(duì)于固體培養(yǎng)，通常用于固體發(fā)酵，由于產(chǎn)物

4、濃度大，易于分離，可以有效的降低產(chǎn)品分離成本。缺點(diǎn)：（1）生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度較大，占地面積大，不宜自動(dòng)化生產(chǎn)。（2）周期長(zhǎng)。（3）培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境條件控制較難。（4）生產(chǎn)過(guò)程中，由于無(wú)菌程度較低，其菌種菌類(lèi)不純。液體培養(yǎng)（1）生產(chǎn)效率高，便于自動(dòng)化管理。（2）生產(chǎn)過(guò)程中溫度、溶氧、pH值等參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)全面控制。（3）通常生產(chǎn)液體種子，整個(gè)生產(chǎn)周期較短。缺點(diǎn)：（1）無(wú)菌程度要求高，相對(duì)生產(chǎn)設(shè)備投資較大。（2）對(duì)于某些種類(lèi)的發(fā)酵，液體培養(yǎng)因投資大、生產(chǎn)密度大而難以實(shí)現(xiàn)。 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展是以基因工程菌為主導(dǎo)的微生物發(fā)酵領(lǐng)域，其菌種的培養(yǎng)要求無(wú)菌程度高，而且培養(yǎng)過(guò)程中的條件要求也非常嚴(yán)格（否則易發(fā)生變異導(dǎo)

5、致質(zhì)粒丟失），從這種意義上講，固體菌種的制備是難以實(shí)現(xiàn)的，因此，應(yīng)以液體培養(yǎng)為主導(dǎo)方式。應(yīng)該指出的是： 隨著生物工程與技術(shù)的發(fā)展，許多傳統(tǒng)的應(yīng)用微生物工業(yè)的菌種已形成了產(chǎn)業(yè)化。例如：酒精的生產(chǎn) 原生產(chǎn)工藝流程為：其中以酵母為線條的生產(chǎn)工藝為： 以霉菌為線條的生產(chǎn)工藝為：現(xiàn)在：（1）酵母使用粉末酵母 鮮壓榨酵母 固定化酵母細(xì)胞 （2）霉菌則由各種液化、糖化酶取代三、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的條件： 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)條件因不同的菌種差異是非常大的，通常是與菌種的性質(zhì)有關(guān)的，也與后續(xù)的發(fā)酵工藝有關(guān)。但是，與發(fā)酵工藝卻有著很大的差別。1.培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基因不同的微生物種類(lèi)差別是很大的，同一種微生物因不同的擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)

6、程（一級(jí)、二級(jí)）其培養(yǎng)基往往也有較大差異。例如：啤酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下： 固體試管 液體試管 三角瓶 大三角（無(wú)酒花） （有酒花） （有酒花） 漢遜罐 通常，對(duì)于種子用的培養(yǎng)基，搖瓶與種子罐用的培養(yǎng)基也不相同，搖瓶要求培養(yǎng)基用的原材料精細(xì)，碳源濃度較低而且是用微生物較易利用的碳源；對(duì)于種子罐用培養(yǎng)基，要求使用接近大生產(chǎn)用的原材料，氮源濃度較高，有利于菌體的增殖。例如：HASS（高溫淀粉酶） 三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖 3m3種子罐：液化淀粉2.溫度 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度，從試管到三角瓶到種子罐，其溫度也應(yīng)逐步調(diào)整，最后接近大生產(chǎn)的溫度，目的在于使菌種逐漸適應(yīng)。 例如：啤酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)

7、 固體 液體 三角瓶 大三角瓶 漢遜罐 28 25 20 15 10-15需要指出的是： （1）許多微生物其最適生長(zhǎng)溫度與最適發(fā)酵溫度往往有差異的，例如：谷氨酸發(fā)酵，谷氨酸產(chǎn)生菌的最適合生長(zhǎng)溫度為：30，而產(chǎn)物合成溫度為32-34 （2）種子擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度的選擇，應(yīng)該考慮的是菌體的快速增殖上，一方面可以縮短周期，另一方面有利于抑制其他雜菌的生長(zhǎng)。3.氧的供給 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是提供大量的強(qiáng)壯的菌體，因此在擴(kuò)培過(guò)程要求菌體增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，從這個(gè)意義上講，擴(kuò)培過(guò)程中應(yīng)提供足夠的氧氣，無(wú)論是厭氧發(fā)酵還是好氧發(fā)酵。 足夠的溶氧取決于：攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、攪拌軸功率等

8、，后述。4.pH值 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的pH值很重要，直接影響到菌體的正常生長(zhǎng)，需要注意以下兩點(diǎn)：（1）擴(kuò)培選擇的pH值是菌體的最適生長(zhǎng)pH值，往往與發(fā)酵最適pH值不同。 （2）培養(yǎng)基滅菌后，通常其pH值要下降0.51.0個(gè)單位，因此， （三角瓶滅菌后，不能夠調(diào)整pH值，不宜無(wú)菌操作）第二節(jié) 生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證1、種子質(zhì)量的判定（1）pH；（2）培養(yǎng)基滅菌后糖、氨基酸、磷等的含量；（3）顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液的外觀色澤和顆粒等；（4）其他參數(shù)，主要酶活力、產(chǎn)品含量等。2、影響種子質(zhì)量的因素（1）培養(yǎng)基（2）培養(yǎng)溫度和濕度（3）培養(yǎng)時(shí)間(種齡)（4）接種量（5）通氣和攪拌（6）泡沫（7

9、）染菌的控制（8）種子罐級(jí)數(shù)3、種子異常的分析 （1）菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過(guò)快 （2）菌絲結(jié)團(tuán)（3）菌絲粘壁4、種子質(zhì)量的控制措施 （1）菌種穩(wěn)定性的檢查 方法：將保藏菌株溶于無(wú)菌的生埋鹽水中，逐級(jí)稀釋?zhuān)缓笤谂囵B(yǎng)皿瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落，選擇形態(tài)優(yōu)良的菌落接入三角瓶進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)出生產(chǎn)率高的菌種備用。這一分離方法適用于所有的保藏菌種，并且一年左右必須做一次。 （2）無(wú)雜菌檢查在種子制備過(guò)程中，每移種一次都需要進(jìn)行雜菌檢查。方法：顯微鏡觀察，或平板培養(yǎng)試驗(yàn)，即將種子液涂在平板培養(yǎng)皿上劃線培養(yǎng)，觀察有無(wú)異常菌落，定時(shí)檢查，防止漏檢。此外，也可對(duì)種子液的生化特性進(jìn)行分析，如取樣測(cè)

10、其營(yíng)養(yǎng)消耗速度、pH 變化、溶氧利用情況、色澤、氣味是否異常等。5、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) （1）細(xì)胞或菌體（菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀） 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)。霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。（2）生化指標(biāo)：種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化（3）產(chǎn)物生成量：在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。（4）酶活力：種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定關(guān)系。第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的保藏一、菌種保藏的目的和意義目的意義：保持優(yōu)良菌種優(yōu)

11、良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。優(yōu)良菌種丟失（退化）的原因：世代短、易變異、易污染、死亡。菌種保藏機(jī)構(gòu)：世界現(xiàn)有700多家專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)。措施：創(chuàng)造條件，使微生物處于休眠狀態(tài)，減少變異。 低營(yíng)養(yǎng)、低溫、干燥、缺氧低代謝、低生長(zhǎng)二、菌種保藏的原理和方法1. 菌種保藏(Culture conservation)原理A 挑選優(yōu)良的菌種，最好是休眠體B 創(chuàng)造有利于種子休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營(yíng)養(yǎng)）2.菌種保藏方法1）斜面(Slant)低溫保藏法 傳代培養(yǎng)，六個(gè)月2）砂土管保藏 適用范圍廣，兩年3）冷凍干燥(Freez-drying)保藏法 長(zhǎng)達(dá)十年4） 液氮超低溫保藏法（-130） (Liquid nitrogen ultra-low temperature storage)思考題1、名詞解釋多因素低劑量的誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)效應(yīng)、染色體畸變、基因突變、表型延遲、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、雜交育種、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生