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文檔簡介
1、本文敘述了一種用于甲基化分析的探針法定量PCR的引物和探針設(shè)計方法,目前用于甲基化檢測的引物探針設(shè)計工具非常多,都有使用成功的案例,經(jīng)過初步多方嘗試,本文中敘述的為本人認(rèn)為較為靠譜的方法。Oligo7的優(yōu)勢在于專業(yè),參數(shù)詳盡且可自由設(shè)置,模塊化設(shè)計,學(xué)會后使用便利。專業(yè)的活就是要專業(yè)的用專業(yè)的工具干。首先是進行序列轉(zhuǎn)換,有較多的在線工具和聯(lián)機軟件都可實現(xiàn),這里使用/methprimer/ ,較為簡單直觀。直接將目標(biāo)序列放入如上圖的編輯框中,此網(wǎng)站也可直接用于相關(guān)引物的設(shè)計,不過本人沒使用過,因為不能設(shè)計探針。submit后就有轉(zhuǎn)化后的序列信息,如下圖:
2、以上詳細標(biāo)記了CpG位置和非CpG位置的C,可直接復(fù)制到Word內(nèi)標(biāo)注使用,下面就可以使用Oligo7利用上邊的序列設(shè)計引物和探針了,如果是設(shè)計非甲基化引物探針,則使用原始序列。關(guān)于引物和探針的一些主要參數(shù),主要參考invtrogen的建議:Primer設(shè)計的基本原則:a) 引物長度一般在18-35mer。 b) G-C含量控制在40-60%左右。 c) 避免近3端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 d) 如果可能避免在3端最后5個堿基有2個以上的G或C。 e) 如果可能避免在3端最后1個堿基為A。 f) 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn),特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。 g) 退火溫度Tm控制在 58-60C左
3、右。 h) 如果是設(shè)計點突變引物,突變點應(yīng)盡可能在引物的中間。TaqMan 探針設(shè)計的基本原則:a) TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物(擴增產(chǎn)物50-150bp),但不能與引物重疊。 b) 長度一般為18-40mer 。 c) G-C含量控制在40-80%左右。 d) 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn),特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。 e) 在引物的5端避免使用G。 f) 選用比較多的堿基C。 g) 退火溫度Tm控制在 68-70左右。 另:目標(biāo)變異堿基最好在3末端或3末端-1位置,保證擴增特異性,對于甲基化,則最好是C。打開軟件,有以上幾種方式可以建立新的序列文件,建立好的文件可保存,下次繼
4、續(xù)處理,此處直接復(fù)制轉(zhuǎn)化后的序列。建立好的用來設(shè)計引物和探針的序列。如果選擇自動搜索,選擇如下菜單,選擇后彈出相應(yīng)的設(shè)置項。Search for Primer& Probes的主要設(shè)置項目在Parameters和Ranges兩個子項中。以上根據(jù)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系調(diào)整,這里主要是反應(yīng)體系中各離子濃度。對于甲基化PCR影響較大的應(yīng)該是鎂離子濃度,如果需要可以重點優(yōu)化一下。Constraints是各約束條件設(shè)置,每個設(shè)置項在幫助文件中有詳細解釋,我在這里只設(shè)置Primer Length和Tm值相關(guān)的選項,前邊的鎖形標(biāo)記表示強制要求和建議要求。對于甲基化PCR,有一種理論認(rèn)為增加引物長度(
5、30mer左右)減小產(chǎn)物長度(小于150mer)能增加PCR反應(yīng)的敏感性,即更容易得到擴增,經(jīng)過嘗試,有一定效果。Search Ranges選項,做一些序列位置和產(chǎn)物長度的限定。除以上提到的設(shè)置條件,其他條件可根據(jù)項目含義調(diào)整,如果不了解則使用默認(rèn)設(shè)置即可。以上條件都設(shè)置后,可能會出現(xiàn)Search Filed的情況,是因為設(shè)置的條件無法滿足,此時需要修改為更寬松的條件,另外如果序列太長Search時間可能會較長。Seacrh完成后,如下圖,這里同時調(diào)出Current Oligo和Selected Oligos的Key Info,如下圖:這里最重要的信息是Score,基本上大于700points
6、的,據(jù)我測試都能成功,可見此處的算法比較合理。本人還做個一個實驗,用不同軟件對同一段序列設(shè)計引物探針,相互評估,就算完全一樣的序列各自計算出的不管是Tm值還是其他分?jǐn)?shù)都差距不小,所以只能選擇一個軟件設(shè)計的合成后測試了,Oligo7是目前設(shè)計使用成功率較高的一個,差別的原因是各家算法不同,部分軟件會給出詳細的計算公式,如果感興趣可以查看了解。雖然指定了大致設(shè)計位置,但以上設(shè)計的引物探針位置不一定是我們需要的位置,特別是我們需要指定某幾個CpG被包含的情況,這就需要用到軟件的評估功能了。打開Edit菜單下的對話框,其中用Upper Oligo或Lower Oligo表示Probe,分別為正鏈和反鏈
7、互補序列。打開編輯框后,根據(jù)自身需求調(diào)整引物和探針的長度及位置,輸入下圖中的編輯框后確認(rèn),這里主要需要關(guān)注如下圖紅色框中的信息,原則有幾點:a) Edit Foward Primer輸入正向序列,Edit Foward Primer輸入反向互補序列,Edit Upper/Lower Primer輸入正向/反向互補序列,每項編輯后點擊確認(rèn)小勾,相應(yīng)的參數(shù)會列出,這里重點調(diào)出Analyze下的Key Info和Composition& Tm兩個選項,對應(yīng)每個引物或探針的信息。b) 修改后得到的Score是根據(jù)前述Search中設(shè)置的參數(shù)得來,所以這里需要設(shè)置的相關(guān)參數(shù)也是在前述相同的Sea
8、rch選項下修改,其中的諸如Primer Length,Primer Tm Range等參數(shù)的設(shè)置同樣會影響最后的Score,詳見Search Parameters下的Scores選項卡,所以如果有相關(guān)不適宜的設(shè)定,可能會降低Score值。c) 關(guān)于Tm值,此軟件列出了3中不同算法的Tm值,對于引物,3種算法的Tm值會相近,如果不能滿足,以nearest neighbor method算法的Tm值為準(zhǔn),此處的探針法的引物以接近60為優(yōu)。對于探針,以nearest neighbor method算法的Tm值為準(zhǔn),另外兩種算法會偏高,以接近70為優(yōu)。d) 關(guān)于Score,如果Length和Tm以及其他輔助項,如G+C含量等,基本符合要求后,Score只要大于700即為優(yōu)秀,越高越好,這里
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