基因克隆基本實(shí)驗(yàn)方法

1、重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選第一節(jié)概述質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的 DNA片段(v 10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，從原理上說(shuō)是很簡(jiǎn)單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。但在實(shí)際工作中，如何區(qū) 分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無(wú)插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過(guò)調(diào)整連接反應(yīng)中外源 DNA片段和載體 DNA的濃度比例，可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下，也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略，如載體去磷酸化等來(lái)最大限度的降低載體的自身環(huán)化，還可以利用遺傳學(xué)

2、手段如 a互補(bǔ)現(xiàn)象等來(lái)鑒別重組子和非重組子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、 帶有非互補(bǔ)突岀端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的 DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在 PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。2、 帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)

3、中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度，以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制質(zhì)粒 DNA的自身環(huán)化。帶 5'端磷酸的外源 DNA片段可以有效地與去磷酸化的載 體相連，產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開(kāi)環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過(guò)程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。3、 帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA

4、連接酶的濃度和外源 DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配，也可以有控制的使用 E. coli DNA聚合酶 I的klenow大片段部分填平3凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。本實(shí)驗(yàn)所使用的載體質(zhì)粒 DNA為pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E. coli DH5 a菌株。由于pBS上帶有Ampr和lacZ 基因，故重組

5、子的篩選采用 Amp抗性篩選與a -互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。因pBS帶有Ampr基因而外源片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有 pBS DNA的轉(zhuǎn)化子才能在 含有Amp的LB平板上存活下來(lái)；而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。pBS上帶有B -半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和B -半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。 這個(gè) 編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，但并沒(méi)有破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能。E. coli DH5 a菌株帶有3 -半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下 ,pBS和DH5 a編碼的B-半乳糖苷酶的片段 都沒(méi)有

6、酶活性。但在 pBS和DH5 a融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的3 -半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫a -互補(bǔ)。由a -互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌較易識(shí)別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-3 -D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-3 -D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變，表達(dá)蛋白失活，產(chǎn)生的氨基酸片段失去 a -互補(bǔ)能力，因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的 轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，a -互補(bǔ)產(chǎn)生的La

7、c+細(xì)菌由于含3 -半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去a -互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生 3 -半乳糖苷酶，無(wú)法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將 重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體 DNA分開(kāi)。此為a -互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑一、材料外源DNA片段：自行制備的帶限制性末端的DNA溶液，濃度已知；載體DNA: pBS質(zhì)粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化，濃度已知；宿主菌：E. coli DH5 a，或JM系列等具有a -互補(bǔ)能力的菌株。二、設(shè)備恒溫?fù)u床，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，

8、電泳儀無(wú)菌，工作臺(tái)，微量移液槍，eppendorf管。三、試劑1、連接反應(yīng)緩沖液(10 X )： 0.5mol/L Tris Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過(guò) 濾滅菌)，500 g g/ml牛血清清蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品)(可用可不用)，10mol/L ATP (過(guò)濾滅菌)。2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase);購(gòu)買成品。3、X-gal儲(chǔ)液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解 X-gal配制成20mg/ml的儲(chǔ)液，包以鋁箔或黑紙以防止 受光照被破壞，儲(chǔ)存于-20'C。4、 IPTG儲(chǔ)液(200mg/

9、ml):在800卩l(xiāng)蒸餾水中溶解200mg IPTG后，用蒸餾水定容至1ml,用0.22卩m濾 膜過(guò)濾除菌，分裝于 eppendorf管并儲(chǔ)于-20C。5、 麥康凱選擇性培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水 1000ml，微火煮沸至完全浴解， 高壓滅菌，待冷至60C左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。6、 含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含 50 g g/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲(chǔ) 液和4卩l(xiāng)IPTG儲(chǔ)液，用無(wú)菌玻棒將溶液涂勻，置于37C下放置3-4小時(shí),使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。7、感受態(tài)細(xì)胞

10、制備試劑：見(jiàn)第三章。8煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑：見(jiàn)第一章。9、質(zhì)粒酶及電泳試劑：見(jiàn)第二章。第三節(jié)操作步驟一、連接反應(yīng)1、 取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendof管，編號(hào)。2、 將0.1卩g載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。3、 加蒸餾水至體積為 8卩l(xiāng),于45C保溫5分鐘，以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0C。4、加入10X T4 DNA ligase buffer 1卩l(xiāng), T4 DNA ligase 0.5卩l(xiāng),混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底 于16 °C保溫8-24小時(shí)。同時(shí)做二組對(duì)照反應(yīng)，其中對(duì)照組一只有質(zhì)粒載體無(wú)外源DNA

11、 ;對(duì)照組二只有外源 DNA片段沒(méi)有質(zhì)粒載體。二、E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化每組連接反應(yīng)混和物各取 2卩l(xiāng)轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見(jiàn)第三章。三、重組質(zhì)粒的篩選1、 每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100卩l(xiāng)用無(wú)菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37 C下培養(yǎng)半小時(shí)以上，直至液體被完全吸收。2、倒置平板于37C繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)，待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。3、 放于4C數(shù)小時(shí)，使顯色完全(此步麥康凱培養(yǎng)基不做)。不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞，由于無(wú)Amp抗性，不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體 的轉(zhuǎn)化子由于具有B -半乳糖苷

12、酶活性，在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了B -半乳糖苷酶活性，在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和 x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。四、酶切鑒定重組質(zhì)粒用無(wú)菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50卩g/ml的5ml LB液體培養(yǎng)基中,37 C下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒 DNA直接電泳，同時(shí)以煮沸法抽提的pBS質(zhì)粒做對(duì)照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時(shí)遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗(yàn)。還可用雜交法篩選 重組質(zhì)粒。注意1、 DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必

13、須加大酶量，一般使用連接粘性末端 酶量的10-100倍。2、 在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入 DNA 濃度至 100-200mg/ml。3、 連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在 0C儲(chǔ)存數(shù)天，-80 C儲(chǔ)存2個(gè)月，但是在-20C冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。4、 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為 37 C，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以10-16 C為好，平齊末端則以15-20C為好。5、 在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5'磷酸基處理，便用過(guò)量的外源 DNA片段(2-5倍)，這將有助于減少載體

14、的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。6、 麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而 攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選，且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色，影響挑選。7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropylthiogalactoside)

15、，為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。8在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37C培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。DNA分子的限制性內(nèi)切酶消化lihTrLi LhlfWH箭TV限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上并在此切割雙鏈DNA絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為4、5或6個(gè)核苷酸且呈二重對(duì)稱的特異序列，切割位點(diǎn)相對(duì)于二重對(duì)稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對(duì)稱軸處同時(shí)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對(duì)稱軸兩側(cè)相對(duì)的位置上分別

16、切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突岀端（即粘 端）的DNA片段。1個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50卩l(xiāng)體積1小時(shí)內(nèi)完全切開(kāi) 1卩g入噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件， 甚至對(duì)同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對(duì)其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過(guò)反應(yīng)條件， 購(gòu)買的內(nèi)切酶說(shuō)明書上均有其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，同時(shí)提供有酶切緩沖液（buffer ，X）和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡(jiǎn)單。一、限制性內(nèi)切酶對(duì) DNA消化的一般方案 1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的 2.20卩l(xiāng)體積反應(yīng)體系如下：DNA0.2-110 x酶切 buffer限制性內(nèi)切酶 加 ddfO

17、限制性內(nèi)切酶最后加入， 一般為37 C水浴消化1hr3. 用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200卩l(xiāng)，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。4. 多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或 高鹽的酶消化。5. 酶切結(jié)束時(shí)，加入 0.5M EDTA （pH 8.0 ）使終濃度達(dá)10mM以終止反應(yīng)。或?qū)⒎磻?yīng)管在 水浴放置10min以滅活限制性內(nèi)切酶活性。6. 如消化反應(yīng)體積過(guò)大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5M乙酸銨（或1/10體積3MNaAc）和2倍體積無(wú)水乙醇， 在冰上放置 5min，然后于4C離心12000g x 5min。傾去

18、含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量 TE中（pH 7.6 ）。7. 如要純化消化后的 DNA可用等體積酚/氯仿（1 ： 1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、電泳檢測(cè)取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loadi ng buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒或/和酶切的空載體（如有）作對(duì)照，采用1-5V/cm的電壓，使 DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取岀置紫外燈下檢測(cè)，攝片。三、注意事項(xiàng)1. 濃縮的限制性內(nèi)切酶可在使用前以2. 購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶多保存于 的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再?gòu)?換一個(gè)無(wú)菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回3. 盡量減少反應(yīng)

19、體積，但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的4. 通常延長(zhǎng)時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用行微量凝膠電泳以檢測(cè)消化進(jìn)程。5. 注意星號(hào)酶切活力。0.5ml離心管中進(jìn)行。因此10X、 52.01-2輕輕混勻,。卩g卩l(xiāng)（單位）至20 卩l(xiāng)稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育,65 C1X限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。50%甘油中，于-20 C是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外-20 C冰箱中取岀酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更-20 C冰箱。10%否則酶活性將受到甘油的抑制。在消化過(guò)程中可取少量反應(yīng)液進(jìn)目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)

20、行重新克隆，一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。亞克隆的基本過(guò)程包括：（1）目的DNA片段和載體的制備；（3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；（4）重組子篩選。一、試劑準(zhǔn)備1. LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨（細(xì)菌培養(yǎng)用） 加ddfO至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，2. 1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基：稱取1.5g瓊脂粉放入 300ml錐形瓶，加100ml LB，15 lbf/in 2高 壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)（2）目的DNA片段和載體的連接;10g，酵母提取物（細(xì)菌培養(yǎng)用）5g，NaCl 10g，15lbf/in高壓滅菌 20min。3. IPTG、X-Gal4. 0.1M

21、MgCl 2 : 15 Ibf/in2 高壓滅菌 20min , 0 C冰浴備用。25. 0.1M CaCI 2 （以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in高壓滅菌20min , 0C冰浴備用。6限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶。二、目的DNA片段和載體的制備選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性 DNA用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?，分別產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端（用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突岀端）、不對(duì)稱粘性末端（用兩種不同的限 制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在亞克隆時(shí)，首選不對(duì)稱相容末端

22、連 接，次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的 片段的末端與載體不匹配，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。（實(shí)驗(yàn)操作同前述）三、利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的 DNA片段和載體的體外連接（一）連接要求和結(jié)果外源DNA片段末端性質(zhì)連接要求連接結(jié)果不對(duì)稱粘性末端兩種限制酶消 化后，需純化載 體以提咼連接 效率載體與外源 DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)常可保 留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。對(duì)稱性粘性末端線形載體DNA 常需磷酸酶脫 磷處理載體與外源 DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)常可保 留；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源

23、DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。平端要求高濃度的DNA和連接酶載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失； 重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源 DNA的串聯(lián)拷貝；非重組 克隆的背景較高 。帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中，但是在連接反應(yīng)時(shí)，外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化，也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì) 調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè) DNA的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平，此外還常常 使用堿性磷酸酶去除 5'磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的 DNA片段和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈 DNA5'磷酸和

24、相鄰的3 '羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5 '磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。（二）T4 DNA連接酶對(duì)目的 DNA片段和載體連接的一般方案 1 .連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。2. 10卩l(xiāng)體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般線性載體DNA分子與外源 DNA分子摩爾數(shù)為1 : 1-1 : 5），補(bǔ)足ddO至8卩l(xiāng)。3 輕輕混勻，稍加離心，56 C水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4加入含A

25、TP的10X Buffer 1卩l(xiāng)，T4 DNA連接酶合適單位，用ddfO補(bǔ)至10卩l(xiāng)，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般 14-16 C水浴）連接8-14hr。四、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1. 感受態(tài)細(xì)胞的制備 保存于-70 C的DH5a （或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上，37 C恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落岀現(xiàn)（約 14-16 hr ）。 挑取單菌落，接種于 2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37C恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約 12hr ）。 取0.5ml過(guò)夜培養(yǎng)液，接種于 100ml LB液體培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至ODb。為 0.4-0.5 時(shí)，放置于 4C冰箱冷卻1-2hr。（注

26、：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。）將培養(yǎng)液分入兩個(gè) 50ml離心管中，4C離心，4000g X 10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCb 25ml 懸浮 30min。4 C離心，4000g x 10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCI 2-甘油溶液1ml懸浮。 以100卩I/管分裝入1.5ml離心管中，-70 C凍存?zhèn)溆?。注：此法制備感受態(tài)細(xì)胞， 可使每微克超螺旋質(zhì)粒 DNA產(chǎn)生5 x 106-2 x 107個(gè)菌落，這樣的轉(zhuǎn) 化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要，制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70 C,但保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響，一般三個(gè)月以內(nèi)轉(zhuǎn)化效率無(wú)

27、多大改變。2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取100卩I貯存于-70 C鈣化菌，冰浴化開(kāi)；+加入適量連接產(chǎn)物（一般不超過(guò)10卩I，輕輕混勻，冰浴 20min ；于42 C熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min ;加入LB液體培養(yǎng)基500卩I，于37 C緩搖孵育45min ; 將培養(yǎng)物適量涂于 1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素AMP即氨芐50 11 g/mI ），待膠表面沒(méi)有液體流動(dòng)時(shí)，37 C溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。五、重組子的篩選根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如a-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的 DNA的短區(qū)段，其中有 B -半乳糖苷酶基因（la

28、cZ ）的調(diào)控序列和前 146個(gè)氨基 酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到 3-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼3-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在 時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為a -互補(bǔ)。由a -互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可

29、避免地導(dǎo)致無(wú)a-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37 C溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。六、注意事項(xiàng)1. 目的DNA片段制備、回收、純化時(shí)，應(yīng)避免外來(lái)DNA污染。2. 不同廠家生產(chǎn)的 T4 DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說(shuō)明書上均有最適反應(yīng)條件，包括對(duì)不同末端性質(zhì) DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連 接酶緩沖液（10 X、5 X、2X），其中多已含有要求濃度的ATP,應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。2. 連接產(chǎn)物的

30、轉(zhuǎn)化：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產(chǎn)物通過(guò)熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。3. 制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in 2高壓滅菌20min。5. 白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過(guò)鑒定。原核表達(dá)將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、 定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點(diǎn)：易于生長(zhǎng)和控制； 用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸

31、桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇。但是，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：（1 ）選擇標(biāo)志的編碼序列；（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；（3） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)）；（4）一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭；（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。原核表達(dá)一般程序如下：獲得目的基因準(zhǔn)備表達(dá)載體將目的基因插入表達(dá)載體中（測(cè)序驗(yàn)證）轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)一表達(dá)蛋白的分析一擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)一、試劑準(zhǔn)備1、LB培養(yǎng)

32、基。2、 100mM IPTG（異丙基硫代-3 -D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于100ml ddH 2O中,0.22卩m濾膜 抽濾，-20 C保存。二、操作步驟（一）獲得目的基因1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、 通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電

33、泳后，用膠回收 Kit或凍融法回收載體大片段。2、 PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重 復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。（四）誘導(dǎo)表達(dá)1、 挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB （含Amp50y g/ml ）中37C過(guò)夜培養(yǎng)。2、 按1 : 50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1

34、ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37C震 蕩培養(yǎng)至 0氐蔭0.4-1.0 （最好0.6，大約需3hr ）。3、 取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度 0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼 續(xù)37 C震蕩培養(yǎng)3hr。4、 分別取菌體 1ml,離心12000g X 30s收獲沉淀，用100卩l(xiāng) 1%SDS重懸，混勻，70 °C 10min。5、離心12000g X 1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。三、注意事項(xiàng)1、選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如 為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。

35、2、 融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不 能發(fā)生干擾。表達(dá)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析lihTrLi LhlfWH箭TV一、原理細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的SDS結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE上，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時(shí) 觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計(jì)表達(dá)蛋白的分子量，可篩選陽(yáng)性表達(dá)的重組體。二、試劑準(zhǔn)備1、 30%儲(chǔ)備膠溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亞甲雙丙烯酰胺 (B

36、is ) 1.0g，混勻后加ddfO, 37°C 溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室溫。2、 1.5M Tris-HCl(pH 8.0): Tris 18.17g力廿 ddfO溶解，濃鹽酸調(diào) pH 至 8.0,定容至 100ml。3、 1M Tris-HCl(pH 6.8): Tris 12.11 g力廿 ddfO 溶解，濃鹽酸調(diào) pH 至 6.8,定容至 100ml。4、 10% SDS電泳級(jí) SDS 10.0 g力廿ddH2O 68 C助溶，濃鹽酸調(diào)至 pH 7.2,定容至100ml。5、 10 電泳緩沖液(pH 8.3) : Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g 容至

37、100ml。10%過(guò)硫酸銨(AP): 1gAP力廿ddHO至10ml。2 SDS電泳上樣緩沖液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，2.0ml ，0.1%溴酚蘭 1.0ml ，ddHO 3.5ml考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭,10% SDS 10ml 力廿 ddfO溶解,定6、7、油8、巰基乙醇1.0ml , SDS 0.6 g，甘脫色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O以3 :、操作步驟采用垂直式電泳槽裝置(一)聚丙烯酰胺凝膠的配制1、 分離膠(10%)的配制：9、o0.25 g ，甲醇 225ml ,1 : 6配制而成。冰醋酸 46ml , ddH2O 225ml。ddH2O30%

38、儲(chǔ)備膠1.5M Tris-HCl4.0ml3.3ml2.5ml10% SDS0.1ml0.1ml10% AP取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N'后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。積層膠,N '-四甲基乙二胺 (凝膠完全聚合需)10卩l(xiāng)封底，余加TEMEDt卩l(xiāng) ,混勻30-60min )2、4%的配制:ddH 2O1.4 ml30%儲(chǔ)備膠0.33 r1M Tris-HCl0.25 ml10%SDS0.02 ml10%AP0.02 mlTEMED2卩l(xiāng)將分離膠上的水倒去，加入上述混合液(二) 樣品處理：將樣品加入等量的 2 x SDS上樣緩沖液，100 C加熱3-

39、5min，離心12000g x 1min， 取上清作SDS-PAGE分析，同時(shí)將 SDS低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。(三) 上樣：取10卩l(xiāng)誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加入樣品池中，并加入20卩l(xiāng)低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。(三) 電泳：在電泳槽中加入1電泳緩沖液，連接電源，負(fù)極在上，正極在下，電泳時(shí)，積層 膠電壓60V,分離膠電壓100V,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止(約需 3hr )。(四) 染色：將膠從玻璃板中取岀，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。,立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。（五）脫色：將膠從染色液中取岀，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。（六）凝膠攝像

40、和保存：在圖像處理系統(tǒng)下將脫色好的凝膠攝像，結(jié)果存于軟盤中，凝膠可保 存于雙蒸水中或 7%乙酸溶液中。三、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組所加總蛋白含量要相等。2、 為達(dá)到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準(zhǔn)確，10%AP在一周內(nèi)使用。室溫較低時(shí)，TEMED 的量可加倍。3、 未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過(guò)皮膚和呼吸道吸收，應(yīng)注意防護(hù)。表達(dá)蛋白的分離與純化大腸桿菌表達(dá)蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略?，F(xiàn)在，許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來(lái)后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究來(lái)獲得。分析蛋白質(zhì)的方法學(xué)現(xiàn)已極大的簡(jiǎn)化和改進(jìn)。必須承認(rèn)，蛋白

41、質(zhì)純化比起 DNA克隆和操作來(lái)是更具有藝術(shù)性的，盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是唯一適合遺傳物質(zhì)的） ，但它卻有標(biāo)準(zhǔn)的物理化學(xué)性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學(xué)性質(zhì)（因而它具有執(zhí)行眾多生物學(xué)功能的用途）。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進(jìn)行純化但這也意味著需要對(duì)每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實(shí)際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當(dāng)普遍的事。可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特別是Studier等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)的岀現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過(guò)

42、表達(dá)（overexpressio n ），表達(dá)水平可達(dá)細(xì)胞蛋白的2%以上，有些甚至高達(dá) 50%。一、可溶性產(chǎn)物的純化（融合T7 Tag的表達(dá)蛋白）（一）試劑準(zhǔn)備 采用 T7 Tag Affinity Purification Kit1. T7 Tag抗體瓊脂。2. B/W緩沖液：4.29mM NazHPQ, 1.47 mM KH2PQ, 2.7 mM KCI，3. 0.137mM NaCl ，1%吐溫-20，pH7.3 o4. 洗脫緩沖液：0.1M檸檬酸，pH2.2 o5. 中和緩沖液：2M Tris ，pH10.4 o1. PEG 20000。（二）操作步驟1.100ml含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體

43、誘導(dǎo)后，離心5000g x 5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4C離心14000g x 30min，取上清液，0.45卩m膜抽濾后作為樣品液。3. 將結(jié)合T7 Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。4. B/W緩沖液平衡后樣品液過(guò)柱。5. 10ml B/W 緩沖液過(guò)柱，洗去未結(jié)合蛋白。6. 用5ml洗脫緩沖液過(guò)柱，每次1ml，洗脫液用含150卩I中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接 SDS-PAGE分析。7. 將洗脫下來(lái)的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次。8. 用PEG 20000

44、濃縮蛋白。（三）注意事項(xiàng)蛋白在過(guò)層析柱前，要0.45卩m膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會(huì)有不溶物、包涵體的純化包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的 高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復(fù)雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無(wú)充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集體；此外，包涵體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)

45、型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的主要成分就是表達(dá)產(chǎn)物，其可占據(jù)集體蛋白的 40%95%此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA DNA脂類及糖類物質(zhì)，所以分離包涵體后，還要采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缟V法）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。（一）試劑配制1 緩沖液A:50mM Tris-HCl ( pH8.0 ) ,2mM EDTA,100mM NaCl。2 緩沖液B:50mM Tris-HCl ( pH8.0 ) ,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。3緩沖

46、液I:50mM Tris-HCl( pH8.0 ) ,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。4緩沖液50M Tris-HCl ( pH8.0 ) ,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Trit on X-100。1 緩沖液皿：50mM Tris-HCl ( pH8.0 ) ,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M鹽酸胍。5 緩沖液C:8M脲素，10mMB -巰基乙醇，100 mM Tris-HCl ( pH8.0 )，2mM EDTA及脫氧膽酸鈉。（二）操作步驟1 用緩沖液 A漂洗菌

47、體細(xì)胞（10ml/g ）,離心6000gX 15min,收集菌體細(xì)胞，重復(fù)此步驟，將菌體細(xì)胞再在緩沖液 A中洗滌一次。2 .將漂洗過(guò)的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%,離心1500gx 30min,收集包涵體沉淀。3 將包涵體沉淀用緩沖液I、緩沖液H、緩沖液皿分別超聲洗滌一次，1500g離心收集包涵體沉淀。4 .包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心1500gx 30min，留上清。將溶解后的蛋白質(zhì)適當(dāng)稀釋，磁力攪拌，透析過(guò)夜。5溶解后的包涵體蛋白可通過(guò)親和層析進(jìn)一步純化。表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢測(cè)一、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性（一）原理活細(xì)胞

48、內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無(wú)色的MTT形成藍(lán)色的甲肷，其形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。對(duì)細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測(cè)可以通過(guò)MTT比色法進(jìn)行。（二）試劑準(zhǔn)備1、青鏈霉素溶液（100X）:青霉素100萬(wàn)U,鏈霉素100萬(wàn)U，溶于100mlddH2。中，抽濾除 菌。2、L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1000mlL15培養(yǎng)基，加 2g碳酸氫鈉，10ml 100X青鏈霉素，5mlHEPES3、MTT液: 5mg/ml溶于L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。4、SDS處理液：20gSDS, 50卩l(xiāng)二甲基甲酰胺，加雙蒸水50ml溶解。5、L-多聚賴氨酸：50卩g溶于1ml雙蒸水中。6、L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的不同濃度的蛋白

49、液。（三）操作步驟（以背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)為例）1、 無(wú)菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG。2、 鏡下去除神經(jīng)根和外膜，放入1ml 0.1%膠原酶中37C消化30min，每5min搖勻一次。3、 洗去膠原酶，吹打分散后，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔含 100卩l(xiāng) 無(wú)血清L15培養(yǎng)基，細(xì)胞約 800個(gè)。4、實(shí)驗(yàn)組分別加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積表達(dá)蛋白的溶劑。5、 37 C 5%CO培養(yǎng) 48hr 后，每孔加入 10 卩 l MTT，37 C 5%CO孵育 4hr。6、加入100卩l(xiāng) 20%的SDS處理液，37 C孵育20hr。7

50、、用ELX 800微孔酶標(biāo)儀測(cè)定 OD7。值，數(shù)據(jù)分析。二、DRG無(wú)血清培養(yǎng)檢測(cè)促神經(jīng)生長(zhǎng)作用（一）操作步驟：1、 無(wú)菌條件下取新生一天的SD大鼠DRG2、 鏡下去除神經(jīng)根和外膜，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔 1個(gè)DRG3、 待DRG貼壁后加入100卩l(xiāng)無(wú)血清L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同 的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積的溶解表達(dá)蛋白的溶劑。4、37C 5%CQ培養(yǎng)，每天在 Olympus倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行測(cè)量，其數(shù)據(jù) 作統(tǒng)計(jì)分析。二、注意事項(xiàng)1、MTT有毒，注意防護(hù)。2、單個(gè)DRG貼壁實(shí)驗(yàn)操作難度較大，需仔細(xì)耐心。副溶血弧菌

51、外膜蛋白 K基因的克隆及原核表達(dá)的研究張軍指導(dǎo)老師：胡忠、倫鏡盛（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系廣東汕頭515063）摘要針對(duì)副溶血弧菌外膜蛋白 K（Outer membrane protein K,0mp K）的基因序列設(shè) 計(jì)一對(duì)引物，利用PCR反應(yīng)從副溶血弧菌基因組中擴(kuò)增出一段約820 bp的序列。將其連接到 pET-32a載體,測(cè)序結(jié)果證明該序列是副溶血弧菌外膜蛋白 Omp K基因。用PCR方法去除其N端信號(hào)肽序列,定向克隆到原核表達(dá)載體 pET-32a構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌DH5x中。酶切、測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明：成功獲得了759 bp的Omp K基因序列（去除了信號(hào)肽序列）。后再次轉(zhuǎn)

52、化載體入高效表達(dá)宿主大腸桿菌Rosetta中，IPTG誘導(dǎo)后能夠高效表達(dá)分子量約為42 kD的融合蛋白。提取總蛋白后取特異表達(dá)條帶進(jìn)行Western-immunoblotting蛋白免疫印記分析。分析顯示能夠發(fā)生特異反應(yīng)，推測(cè)所表達(dá)的 特異蛋白為Omp Ko關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；Omp K;原核表達(dá)Cloning and prokaryotic expression of Omp K gene from Vibrio parahaemolyticusAbstractPrimers were desig ned accord ing to Omp K gene seque nee publishe

53、d in GenBank, and a piece of DNA sequenceabout 820 bp was amplified by PCR from genomic DNA of V. parahaemolyticus The DNA seque ncewas cloned in to pET-32a vector and seque nced.The Blast alig nment result in dicated that it was in deed the outer membra ne protein (Omp K) gene of V. parahaemolyticu

54、s Desig ned other primers to Amplified the Omp K gene without the signal peptide sequenee, and then it was inserted into E. coli vector. After verified by the endonuclease and PCR, an expressi on vector was con structed. The vector was tran sformed into the Rosetta which can amplified the expressi o

55、n whe n in duced by IPTG, the n the expressi on was checked by SDS-PAGE. In order to verify the special expression products, Western- immun oblott ing was used. The result in dicated that the special expressi on products may be the Omp K of Vibrio parahaemolyticus.Key words: Vibrio parahaemolyticus ; Omp K; prokaryotic expressiona汕