藥物定量分析樣品與分析方法驗證PT課件

1、第四章第四章藥物定量分析樣品與分析方法驗證藥物定量分析樣品與分析方法驗證第一節(jié)定量分析樣品的前處理第一節(jié)定量分析樣品的前處理u一、概述一、概述u研究對象：含金屬或含鹵素，硫，磷，研究對象：含金屬或含鹵素，硫，磷，硒等特殊元素藥物分析前處理。硒等特殊元素藥物分析前處理。u二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法u三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法 一、概述一、概述原料原料: :不經(jīng)特殊處理直接測定不經(jīng)特殊處理直接測定原料原料: :經(jīng)有機破壞后測定經(jīng)有機破壞后測定 制劑制劑: :排除處方中干擾組分排除處方中干擾組分二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（一）

2、直接測定法（一）直接測定法1.1.配位滴定法配位滴定法2.2.氧化還原法氧化還原法（二）經(jīng)水解后測定法（二）經(jīng)水解后測定法1.1.堿水解后測定法堿水解后測定法2.2.酸水解后測定法酸水解后測定法（三）經(jīng)還原分解后測定（三）經(jīng)還原分解后測定二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（一）直接測定法（一）直接測定法1.1.配位滴定法配位滴定法 葡萄糖酸鈣葡萄糖酸鈣 【含量測定含量測定】 取本品取本品0.5g0.5g，精密稱定，加水，精密稱定，加水100ml100ml，微熱使溶解，加氫氧化鈉試液，微熱使溶解，加氫氧化鈉試液 15ml15ml與與鈣紫紅素指示劑鈣紫紅素指示劑0.1g0.1g，

3、用乙二胺四醋酸二鈉滴，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液定液(0.05mol/l) (0.05mol/l) 滴定至溶液自紫滴定至溶液自紫 色轉(zhuǎn)變?yōu)樯D(zhuǎn)變?yōu)榧兯{(lán)色。每純藍(lán)色。每1ml1ml乙二胺四醋酸二鈉滴定液乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05mol/l 0.05mol/l ）相當(dāng)于）相當(dāng)于22.42mg 22.42mg 的的 c12h22cao14.h2oc12h22cao14.h2o。 二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（一）直接測定法（一）直接測定法2.2.氧化還原法氧化還原法 葡萄糖酸銻鈉葡萄糖酸銻鈉 【含量測定含量測定】 取本品約取本品約0.3g0.3g，精密稱定，置，精密稱定，

4、置具塞錐形瓶中，加水具塞錐形瓶中，加水100ml 100ml 、鹽酸、鹽酸15 ml15 ml與碘與碘化鉀試液化鉀試液10ml10ml，密塞，振搖后，在暗處靜置，密塞，振搖后，在暗處靜置1010分鐘，用分鐘，用硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉滴定液滴定液(0.1mo l/l)(0.1mo l/l)滴定，滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白消失，并將滴定的結(jié)果用空白 試驗校正。每試驗校正。每1ml1ml硫代硫酸鈉滴定液硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/l)(0.1mol/l)相當(dāng)于相當(dāng)于6.088mg 6.088mg 的的sbsb。

5、二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（二）經(jīng)水解后測定法（二）經(jīng)水解后測定法 1.1.堿水解后測定法堿水解后測定法 三氯叔丁醇三氯叔丁醇 【含量測定含量測定】 取本品約取本品約0.1g0.1g，精密稱定，加乙醇，精密稱定，加乙醇5ml 5ml ，溶解后，加溶解后，加2020氫氧化鈉氫氧化鈉 溶液溶液5ml 5ml ，加熱回流，加熱回流1515分鐘，分鐘，放冷至室溫，加水放冷至室溫，加水20ml20ml與硝酸與硝酸5ml 5ml ，精密加硝酸銀滴，精密加硝酸銀滴定液定液 (0.1mol/l)30ml(0.1mol/l)30ml，再加鄰苯二甲酸二丁酯，再加鄰苯二甲酸二丁酯5ml 5

6、ml ，密塞，強力振搖后，加硫酸鐵銨指示液密塞，強力振搖后，加硫酸鐵銨指示液 2ml 2ml ，用，用硫氰硫氰酸銨滴定液酸銨滴定液(0.1mol/l)(0.1mol/l)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每試驗校正。每1ml1ml的的 硝酸銀滴定液硝酸銀滴定液(0.1mol/l)(0.1mol/l)相當(dāng)于相當(dāng)于6.216mg 6.216mg 的的c4h7cl3o.1/2h2oc4h7cl3o.1/2h2o。 二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（二）經(jīng)水解后測定法（二）經(jīng)水解后測定法2.2.酸水解后測定法酸水解后測定法 硬脂酸鎂硬脂酸鎂 【含量測定含

7、量測定】 取本品約取本品約1g1g，精密稱定，精密，精密稱定，精密加加硫酸滴定液硫酸滴定液(0.05mol/l)50ml (0.05mol/l)50ml ，煮，煮 沸至油沸至油層澄清，繼續(xù)加熱層澄清，繼續(xù)加熱1010分鐘，放冷至室溫，加甲分鐘，放冷至室溫，加甲基橙指示液基橙指示液1 1 2 2 滴，用氫氧化鈉滴，用氫氧化鈉 滴定液滴定液(0.1mol/l)(0.1mol/l)滴定。每滴定。每1ml1ml硫酸滴定液硫酸滴定液(0.05mol/l) (0.05mol/l) 相當(dāng)于相當(dāng)于2.016mg 2.016mg 的的mgomgo。 二、不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（三）經(jīng)還

8、原分解后測定法（三）經(jīng)還原分解后測定法1.1.堿性還原后測定堿性還原后測定2.2.酸性還原后測定酸性還原后測定3.3.利用可游離的金屬離子的氧化性測定利用可游離的金屬離子的氧化性測定含量含量三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法一、濕法破壞一、濕法破壞二、干法破壞二、干法破壞1. 1. 高溫?zé)胱品ǜ邷責(zé)胱品?. 2. 氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法一、濕法破壞一、濕法破壞 凱氏定氮法凱氏定氮法（kjeldahlkjeldahl nitrogen determination) nitrogen determination)適用：含氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥

9、物適用：含氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥物原理原理: : 含氮藥物與硫酸共熱含氮藥物與硫酸共熱, ,將有機氮轉(zhuǎn)變成將有機氮轉(zhuǎn)變成無機氨無機氨, ,然后測定氮的含量。然后測定氮的含量。 三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法 一、濕法破壞一、濕法破壞 凱氏定氮法凱氏定氮法 雙氯非那胺雙氯非那胺 【含量測定含量測定】 取本品約取本品約0.3g0.3g，精密稱定，精密稱定，照氮測定法（附錄照氮測定法（附錄 d d 第一法）測定。第一法）測定。 每每1ml1ml硫酸滴定液硫酸滴定液(0.05mol/l) (0.05mol/l) 相當(dāng)于相當(dāng)于15.26mg 15.26mg 的的c6h6cl2n2o4s2

10、c6h6cl2n2o4s2 。 三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法 一、干法破壞一、干法破壞 氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法適用適用含鹵素或硫、磷等元素的有機藥物的鑒別、含鹵素或硫、磷等元素的有機藥物的鑒別、限度檢查或含量測定及藥物中雜質(zhì)硒的檢查。限度檢查或含量測定及藥物中雜質(zhì)硒的檢查。 三、經(jīng)有機破壞的分析方法三、經(jīng)有機破壞的分析方法 一、干法破壞一、干法破壞 氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法碘苯酯碘苯酯 【含量測定含量測定】 取本品約取本品約20mg20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法（附錄，精密稱定，照氧瓶燃燒法（附錄 c c）進(jìn)行有機破）進(jìn)行有機破 壞，用氫氧化鈉試液壞，用氫氧化鈉試液2ml 2m

11、l 與水與水10ml10ml為吸收液，為吸收液，俟吸收完全后，加溴醋酸溶液（取醋酸鉀俟吸收完全后，加溴醋酸溶液（取醋酸鉀 10g 10g ，加冰醋酸適量，加冰醋酸適量使溶解，加溴使溶解，加溴0.4ml 0.4ml ，再加冰醋酸使成，再加冰醋酸使成100ml100ml）10ml10ml，密塞，振，密塞，振搖，搖， 放置數(shù)分鐘，加甲酸約放置數(shù)分鐘，加甲酸約1ml 1ml ，用水洗滌瓶口，并通入空氣，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約流約3 3 5 5 分鐘以除去剩余的分鐘以除去剩余的 溴蒸氣，加碘化鉀溴蒸氣，加碘化鉀2g2g，密塞，搖，密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液勻，用硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol

12、/l) (0.02mol/l) 滴定，至近終點滴定，至近終點 時，加時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失, ,并將滴定的結(jié)果用空白試驗并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每校正。每1ml1ml硫代硫代 硫酸鈉滴定液硫酸鈉滴定液(0.02mol/l) (0.02mol/l) 相當(dāng)于相當(dāng)于1.388mg 1.388mg 的的c19h29io2c19h29io2。 第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點一、容量分析法一、容量分析法 （1 1） 適用于化學(xué)原料藥的含量測定適用于化學(xué)原料藥的含量測定 （2 2）容量分析法的有關(guān)計算）容量分析法的有關(guān)計算 （3 3）含量

13、測定）含量測定二、光譜分析法二、光譜分析法三、色譜分析法三、色譜分析法 第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點一、容量分析法的特點一、容量分析法的特點 裝置簡單，操作簡便、快速，方法耐用裝置簡單，操作簡便、快速，方法耐用性高，測定結(jié)果準(zhǔn)確（性高，測定結(jié)果準(zhǔn)確（rsdrsd0.2%0.2%）；專）；專屬性差，適用于含量較高的樣品分析，屬性差，適用于含量較高的樣品分析，常用于常用于化學(xué)原料藥化學(xué)原料藥的含量測定。的含量測定。 掌握含量測定的掌握含量測定的計算公式和方法。計算公式和方法。第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點二、光譜分析法二、光譜分析法（1 1）紫外分光光度法

14、）紫外分光光度法特點：特點： 1. 1.靈敏度高，靈敏度高，1010-4 -4 -10-10-7-7g/mlg/ml。 2. 2.準(zhǔn)確度高，準(zhǔn)確度高，rsd%rsd%：2%-5%2%-5%。 3. 3.儀器價廉物美，操作簡便，易于普及。儀器價廉物美，操作簡便，易于普及。 4. 4.應(yīng)用廣泛。應(yīng)用廣泛。第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點二、光譜分析法二、光譜分析法（1 1）紫外分光光度法）紫外分光光度法 含量測定方法含量測定方法 1. 1.對照品比較法對照品比較法 2. 2.吸收系數(shù)法吸收系數(shù)法 3. 3.計算分光分度法。計算分光分度法。 4. 4.比色法比色法第二節(jié)第二節(jié) 定量

15、分析方法的特點定量分析方法的特點二、光譜分析法二、光譜分析法（2 2）熒光分析法）熒光分析法 特點特點1.1.靈敏度高，靈敏度高，1010-10 -10 10 10-12-12g/mlg/ml。2.2.在低濃度溶液中進(jìn)行。在低濃度溶液中進(jìn)行。3.3.在測定供試品溶液時在測定供試品溶液時, ,用基準(zhǔn)溶液代替對照品溶液校正用基準(zhǔn)溶液代替對照品溶液校正儀器的靈敏度。儀器的靈敏度。4.4.用熒光衍生試劑用熒光衍生試劑, ,提高分析方法的靈敏度和選擇性。提高分析方法的靈敏度和選擇性。 第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點三、色譜分析法三、色譜分析法 （一）高效液相色譜法（一）高效液相色譜法

16、特點特點 高靈敏度（高靈敏度（ 1010-12 -12 -10-10-15-15g/mlg/ml ）、高選擇性、高效）、高選擇性、高效能、高速度及應(yīng)用廣泛。能、高速度及應(yīng)用廣泛。 第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點三、色譜分析法三、色譜分析法 （一）高效液相色譜法（一）高效液相色譜法系統(tǒng)適用性系統(tǒng)適用性（1 1）理論板數(shù)）理論板數(shù) （2 2）分離度）分離度 （3 3）重復(fù)性）重復(fù)性 （4 4）拖尾因）拖尾因子子含量測定方法含量測定方法（1 1）內(nèi)標(biāo)法）內(nèi)標(biāo)法 （2 2）外標(biāo)法）外標(biāo)法 第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證 目目 的的 證明建立和采用的方法適合相應(yīng)檢

17、測的要求。證明建立和采用的方法適合相應(yīng)檢測的要求。 內(nèi)內(nèi) 容容 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 精密度，專屬性，檢測限，定量限，線性，線性范圍精密度，專屬性，檢測限，定量限，線性，線性范圍和耐用性和耐用性 第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證一、準(zhǔn)確度（一、準(zhǔn)確度（accuracy)accuracy) 指方法測定的結(jié)果與真實值或參指方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，用回收率表示?？贾到咏某潭?，用回收率表示。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證二、精密度（二、精密度（precision)precision) 指平行測定的各測量值（實驗指平行測定的各測量值（實驗值）之間互相接近

18、的程度。值）之間互相接近的程度。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證三、專屬性三、專屬性 指其它組分可能存在下，采用指其它組分可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。性。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證四、檢測限（四、檢測限（limit of detection, limit of detection, lod)lod) 指試樣中被測物能被檢測出的最指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量。低濃度或量。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證五、定量限（五、定量限（limit of limit of quantitat

19、ionquantitation, loq), loq) 指試樣中被測物能被定量測定指試樣中被測物能被定量測定的最低量。的最低量。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證六、線六、線 性性 指在一定范圍內(nèi)，試樣濃度與指在一定范圍內(nèi)，試樣濃度與響應(yīng)值呈正比。響應(yīng)值呈正比。 第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證七、范七、范 圍圍 指一種分析方法的精密度，準(zhǔn)指一種分析方法的精密度，準(zhǔn)確度都符合要求的試驗結(jié)果成線確度都符合要求的試驗結(jié)果成線性時供試物濃度的變化范圍。性時供試物濃度的變化范圍。第三節(jié)第三節(jié) 藥品分析方法的驗證藥品分析方法的驗證 八、耐八、耐 用用 性性 指在測定條件

20、有小的變動時，指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。為于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。藥品分析方法驗證內(nèi)容藥品分析方法驗證內(nèi)容準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度耐用性耐用性精密度精密度專屬性專屬性線性與線性范圍線性與線性范圍檢測限與定量限檢測限與定量限text第四節(jié)第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析簡介體內(nèi)藥物分析簡介 重要性：重要性： 為了達(dá)到藥物在臨床上的使用安全、合為了達(dá)到藥物在臨床上的使用安全、合理和有效，人們越來越要求了解和提供理和有效，人們越來越要求了解和提供藥物在體內(nèi)的更多信息，即需要對藥物藥物在體內(nèi)的更多信息，即需要對藥物及其制劑的體內(nèi)及其制劑的體內(nèi)吸收、分布

21、、代謝和排吸收、分布、代謝和排泄過程、作用機制及藥物效應(yīng)泄過程、作用機制及藥物效應(yīng)進(jìn)行研究，進(jìn)行研究，因而促使藥物動力學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨因而促使藥物動力學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨床藥理學(xué)等一些新興邊緣學(xué)科的發(fā)展與床藥理學(xué)等一些新興邊緣學(xué)科的發(fā)展與建立。建立。 第四節(jié)第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析簡介體內(nèi)藥物分析簡介 定義：定義： 體內(nèi)藥物分析是通過分析手段體內(nèi)藥物分析是通過分析手段了解藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變了解藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得各種化，獲得各種藥物動力學(xué)藥物動力學(xué)參數(shù)，參數(shù)，代謝的方式和途徑代謝的方式和途徑等信息。等信息。 第四節(jié)第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析簡介體內(nèi)藥物分析簡介任務(wù)：任務(wù)： 1 1）進(jìn)行

22、體內(nèi)各種體液、組織，器官和排泄物中藥物及）進(jìn)行體內(nèi)各種體液、組織，器官和排泄物中藥物及代謝物的分離測定。代謝物的分離測定。 2 2）進(jìn)行新測定方法的研究、開發(fā)，以供臨床常規(guī)測定）進(jìn)行新測定方法的研究、開發(fā)，以供臨床常規(guī)測定之用。之用。 3 3）進(jìn)行分析質(zhì)量管理工作，提高測定技術(shù)和效率，以）進(jìn)行分析質(zhì)量管理工作，提高測定技術(shù)和效率，以便獲得迅速，準(zhǔn)確，可靠的測定結(jié)果。便獲得迅速，準(zhǔn)確，可靠的測定結(jié)果。 4 4）進(jìn)行方法學(xué)研究，及時為相關(guān)學(xué)科的研究提供合理）進(jìn)行方法學(xué)研究，及時為相關(guān)學(xué)科的研究提供合理的最佳分析條件與方法，估計、評定各種方法能達(dá)到的最佳分析條件與方法，估計、評定各種方法能達(dá)到的靈敏

23、、專屬和準(zhǔn)確的程度。的靈敏、專屬和準(zhǔn)確的程度。 5 5）參與相關(guān)學(xué)科研究中對獲得的分析結(jié)果的闡明工作，）參與相關(guān)學(xué)科研究中對獲得的分析結(jié)果的闡明工作，使所得的測定數(shù)據(jù)更有助于說明問題。使所得的測定數(shù)據(jù)更有助于說明問題。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 一、樣品的種類一、樣品的種類 凡是體內(nèi)藥物到達(dá)之處，如各種體液，凡是體內(nèi)藥物到達(dá)之處，如各種體液，器官組織和排泄物等，都是體內(nèi)藥物分器官組織和排泄物等，都是體內(nèi)藥物分析的對象。析的對象。血液血液是最常用的生物樣品。是最常用的生物樣品。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 一、樣品

24、的種類一、樣品的種類 ( (一一) )血液血液 (1)(1)血漿血漿 全血中加入抗凝劑全血中加入抗凝劑( (肝素、枸櫞酸、草酸肝素、枸櫞酸、草酸鹽、鹽、edtaedta等），經(jīng)離心后取上清液。等），經(jīng)離心后取上清液。 （2 2）血清）血清 全血不加抗凝劑，由血液中纖維蛋白原全血不加抗凝劑，由血液中纖維蛋白原等影響下等影響下, ,引起血液凝結(jié)而析出的澄清黃色液體引起血液凝結(jié)而析出的澄清黃色液體, ,離心離心后取上清液。后取上清液。 （3 3）全血）全血 加入抗凝劑混勻，以防凝血。加入抗凝劑混勻，以防凝血。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求 一、樣品的種類一、樣

25、品的種類 ( (二二) )尿樣尿樣 尿藥測定主要用于藥物劑量回收，藥物腎清除率、尿藥測定主要用于藥物劑量回收，藥物腎清除率、藥物體內(nèi)代謝及藥物體內(nèi)代謝及 生物利用度研究，也可用于乙?；锢枚妊芯?，也可用于乙?；x快、慢型測定等。謝快、慢型測定等。 尿樣濃度與血樣濃度相關(guān)性差。尿樣濃度與血樣濃度相關(guān)性差。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求 一、樣品的種類一、樣品的種類 ( (三三) )唾液唾液 唾液中的藥物濃度通常與血液濃度相關(guān)，可用唾液唾液中的藥物濃度通常與血液濃度相關(guān)，可用唾液中的藥物濃度來反應(yīng)血漿濃度。中的藥物濃度來反應(yīng)血漿濃度。 唾液的采集一般

26、是在漱口后唾液的采集一般是在漱口后1515分鐘，收集，離心后，分鐘，收集，離心后，取上清液。取上清液。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求 二、樣品的儲存二、樣品的儲存 血漿和血清都必須在采血后即時分離。否則，血凝血漿和血清都必須在采血后即時分離。否則，血凝后冰凍保存，則因冰凍時引起細(xì)胞溶解，而阻礙血漿后冰凍保存，則因冰凍時引起細(xì)胞溶解，而阻礙血漿或血清的分出，同時因溶血而影響藥物濃度變化?；蜓宓姆殖?，同時因溶血而影響藥物濃度變化。 尿樣宜立即測定，否則應(yīng)加入防腐劑或低溫冷藏。尿樣宜立即測定，否則應(yīng)加入防腐劑或低溫冷藏。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品

27、分析方法的 基本要求基本要求 三、生物樣品分析前處理技術(shù)、生物樣品分析前處理技術(shù) 微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中，若直接進(jìn)微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中，若直接進(jìn)行測定，內(nèi)源性物質(zhì)可能干擾，藥物濃度太低行測定，內(nèi)源性物質(zhì)可能干擾，藥物濃度太低將會達(dá)不到儀器靈敏度要求。因此，生物樣品將會達(dá)不到儀器靈敏度要求。因此，生物樣品中的藥物必須經(jīng)過中的藥物必須經(jīng)過分離、純化與濃集分離、純化與濃集，必要時，必要時還需對待測組分進(jìn)行化學(xué)改性處理，從而為最還需對待測組分進(jìn)行化學(xué)改性處理，從而為最后測定創(chuàng)造良好的條件。后測定創(chuàng)造良好的條件。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求 三、生

28、物樣品分析前處理技術(shù)三、生物樣品分析前處理技術(shù) ( (一一) ) 蛋白質(zhì)的去除蛋白質(zhì)的去除 （二）綴合物的水解（二）綴合物的水解 （三）有機破壞（三）有機破壞 （四）分離、純化和濃集（四）分離、純化和濃集 （五）化學(xué)衍生化法（五）化學(xué)衍生化法 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求( (一一) ) 蛋白質(zhì)的去除蛋白質(zhì)的去除目的：目的：1 1）使于蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來，以便準(zhǔn)確地測定藥）使于蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來，以便準(zhǔn)確地測定藥物及其代謝產(chǎn)物的濃度。物及其代謝產(chǎn)物的濃度。2 2）減免后續(xù)溶劑萃取過程中乳化現(xiàn)象）減免后續(xù)溶劑萃取過程中乳化現(xiàn)象3 3）保護(hù)儀器性

29、能）保護(hù)儀器性能 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求( (一一) ) 蛋白質(zhì)的去除方法蛋白質(zhì)的去除方法1 1）加入與水混溶的有機溶劑）加入與水混溶的有機溶劑 可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋使蛋 白質(zhì)凝聚，進(jìn)而使與之結(jié)合的藥物釋放出來。白質(zhì)凝聚，進(jìn)而使與之結(jié)合的藥物釋放出來。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求2 2）加入中性鹽）加入中性鹽 可使溶液的離子強度發(fā)生變化，能使蛋白可使溶液的離子強度發(fā)生變化，能使蛋白質(zhì)脫水后沉淀下來，離心后可獲得含有藥物質(zhì)脫水后沉淀下來，離心后可獲

30、得含有藥物及其代謝物的上層清液。及其代謝物的上層清液。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求3 3）加入強酸）加入強酸 使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而沉使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而沉淀，條件是淀，條件是phph值要值要低低于蛋白質(zhì)的等電點。于蛋白質(zhì)的等電點。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求4 4）加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑）加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 當(dāng)當(dāng)phph值值高高于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的羧基與金屬離子形成不溶性的中帶負(fù)電荷的羧基與金屬離子形成不溶性的鹽而沉淀。鹽而沉淀

31、。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求）酶解法）酶解法 最常用蛋白水解酶：最常用蛋白水解酶：枯草菌溶素枯草菌溶素可使蛋白質(zhì)分解而放出藥物?？墒沟鞍踪|(zhì)分解而放出藥物。 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求( (二二) ) 綴合物的水解綴合物的水解 尿中藥物多呈綴合狀態(tài)。一些含尿中藥物多呈綴合狀態(tài)。一些含-oh-oh，- -coohcooh，-nh-nh3 3，-sh-sh的藥物可與內(nèi)源性物質(zhì)葡的藥物可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸綴合物。萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸綴合物。1 1）酸水解）酸水解2 2）酶水解）酶水解

32、 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求( (三三) ) 有機破壞有機破壞 尿中藥物多呈綴合狀態(tài)。一些含尿中藥物多呈綴合狀態(tài)。一些含-oh-oh，- -coohcooh，-nh-nh3 3，-sh-sh的藥物可與內(nèi)源性物質(zhì)葡的藥物可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸綴合物。萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸綴合物。1 1）酸水解）酸水解2 2）酶水解）酶水解 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求( (四四) )分離、純化與濃集分離、純化與濃集1 1、生物樣本的分離與純化、生物樣本的分離與純化（1 1）液）液- -液萃?。ㄒ狠腿。?/p>

33、liquid-liquid liquid-liquid extraction,lleextraction,lle）（2 2）液）液- -固萃?。ü梯腿。╨iquid-solid,lseliquid-solid,lse） 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求（1 1）液）液- -液萃?。ㄒ狠腿。╨iquid-liquid extraction,lleliquid-liquid extraction,lle）親脂性的藥物親脂性的藥物與強極性的與強極性的內(nèi)源性水溶性內(nèi)源性水溶性物質(zhì)，通物質(zhì)，通過有機溶劑可以除去大部分干擾性物質(zhì)。過有機溶劑可以除去大部分干擾性物質(zhì)。注意：

34、注意：1)1)所用溶劑對被測組分溶解度大所用溶劑對被測組分溶解度大, ,與水不混溶與水不混溶, ,無毒無毒, ,化學(xué)穩(wěn)定化學(xué)穩(wěn)定, ,不易乳化。不易乳化。常用：乙醚，叔丁基甲醚，氯仿，乙酸乙酯等常用：乙醚，叔丁基甲醚，氯仿，乙酸乙酯等2 2）有機相：水相）有機相：水相=1=1：1 1（2 2：1 1）3 3）水相最佳）水相最佳phph值的選擇與藥物的值的選擇與藥物的pkapka有關(guān)有關(guān)第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求(2(2）液）液- -固萃?。ü梯腿。╨selse）優(yōu)點優(yōu)點：1)1)引入雜質(zhì)少引入雜質(zhì)少 2 2）無乳化現(xiàn)象）無乳化現(xiàn)象3 3）萃取效率高，樣品

35、用量少）萃取效率高，樣品用量少4 4）水作溶劑，安全性高）水作溶劑，安全性高5 5）速度快，室溫下操作）速度快，室溫下操作缺點缺點：成本高，重現(xiàn)性稍差：成本高，重現(xiàn)性稍差分類分類：親水性，疏水性：親水性，疏水性第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求( (）生物樣品在待測組分中的濃集）生物樣品在待測組分中的濃集生物樣品在萃取過程中，微量待測組生物樣品在萃取過程中，微量待測組分往往分布于較大體積的萃取溶劑中，分往往分布于較大體積的萃取溶劑中，不能直接供和測定。不能直接供和測定。第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求( (五）化學(xué)衍生化法五）化

36、學(xué)衍生化法1 1）使樣品中的藥物轉(zhuǎn)化成具有可被分離的）使樣品中的藥物轉(zhuǎn)化成具有可被分離的性質(zhì)性質(zhì)2 2）提高檢測靈敏度）提高檢測靈敏度3 3）增強藥物的穩(wěn)定性）增強藥物的穩(wěn)定性4 4）提高對光學(xué)異構(gòu)體的分離能力）提高對光學(xué)異構(gòu)體的分離能力第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (一一) ) 特異性特異性 （二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 （三）精密度與準(zhǔn)確度（三）精密度與準(zhǔn)確度 （四）靈敏度（四）靈敏度 （五）穩(wěn)定性（五）穩(wěn)定性 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的 基本要求基

37、本要求三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 特異性特異性穩(wěn)定性穩(wěn)定性精密度與準(zhǔn)確度精密度與準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度靈敏度線性范圍線性范圍text第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (一一) ) 特異性特異性1 1）空白生物樣本色譜圖）空白生物樣本色譜圖2 2）空白樣品標(biāo)樣）空白樣品標(biāo)樣3 3）服藥后生物樣本色譜圖）服藥后生物樣本色譜圖 第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (三三) ) 精密度與準(zhǔn)確

38、度精密度與準(zhǔn)確度1 1）精密度）精密度日內(nèi)精密度（日內(nèi)精密度（intra-day):intra-day):同一天內(nèi)，多次同一天內(nèi)，多次測量的精密度測量的精密度日間精密度日間精密度 (inter-day)(inter-day)不同時間內(nèi)測不同時間內(nèi)測定結(jié)果的變異性定結(jié)果的變異性第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (三三) ) 精密度與準(zhǔn)確度精密度與準(zhǔn)確度1 1）準(zhǔn)確度）準(zhǔn)確度絕對回收率：絕對回收率：%.%.相對回收率相對回收率: : 又稱方法回收率又稱方法回收率第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方

39、法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (四四) ) 靈敏度靈敏度1 1）檢測限）檢測限(lod): s/n=3(lod): s/n=3時的被測物的濃度時的被測物的濃度. .2) 2) 定量限定量限(loq):(loq):能滿足測定個半能滿足測定個半衰期時樣品中藥物濃度或衰期時樣品中藥物濃度或maxmax的的1/10-1/10-1/201/20時的藥物濃度時的藥物濃度第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (五五) ) 穩(wěn)定性穩(wěn)定性1 1）短期室溫條件下的穩(wěn)定性考察）短

40、期室溫條件下的穩(wěn)定性考察2)2) 長期低溫條件下的穩(wěn)定性考察長期低溫條件下的穩(wěn)定性考察3)3) 冷凍解凍（凍融）穩(wěn)定性考察冷凍解凍（凍融）穩(wěn)定性考察第四節(jié)第四節(jié) 生物樣品分析方法的生物樣品分析方法的基本要求基本要求 三、生物樣品分析方法的驗證三、生物樣品分析方法的驗證 ( (六六) ) 質(zhì)量控制質(zhì)量控制樣品樣品（七）測定結(jié)果（七）測定結(jié)果詳細(xì)記錄實驗過程和結(jié)果詳細(xì)記錄實驗過程和結(jié)果思考題思考題一、簡述含金屬或含鹵素，硫、磷、硒等特殊元素的藥一、簡述含金屬或含鹵素，硫、磷、硒等特殊元素的藥物分析前處理方法有哪些？物分析前處理方法有哪些？二、簡述凱氏定氮法的實驗原理二、簡述凱氏定氮法的實驗原理, ,操作過程及適用范圍操作過程及適用范圍? ?方法中為何要選用硼酸作吸收液方法中為何要選用硼酸作吸收液? ?硼酸吸收液的濃度是硼酸吸收液的濃度是否需要標(biāo)定否需要標(biāo)定? ?所取體積是否必須準(zhǔn)確量取所取體積是否必須準(zhǔn)確量取? ?改用硫酸或改用硫酸或鹽酸用吸收液鹽酸用吸收液, ,行嗎行嗎? ? 三、簡述氧瓶燃燒法的實驗原理、裝置構(gòu)成及適用范圍？三、簡述氧瓶燃燒法的實驗原理、裝置構(gòu)成及適用范圍？四、簡述容量分析法的特點及計算公式？四、簡述容量分析法的特點及計算公式？五、紫外吸收光譜有什么特征？哪些特征和常數(shù)可作為五、紫外吸收光譜有什么特征？