遺傳病分析4基因NA提取與PCR擴(kuò)增技術(shù)

1、遺傳病的分析遺傳病的分析4基因組dna提取與pcr擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)一、基因組dna提取實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?基因組dna的制備是基因分析的前提。 本實驗要求掌握基因組dna提取的基本方法。原 理 dna在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開。 dna、rna所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在260nm處，所以，可用紫外分光光度法測定dna的濃度。 原理 基因組dna提取試劑盒：在高鹽的狀態(tài)下，dna純化樹脂專一性地吸附dna；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，dna被洗脫下來。器

2、材與試劑 臺式高速離心機(jī)、天平、水浴恒溫箱、移液槍、塑料離心管等 試劑盒（純化樹脂、gn結(jié)合液、漂洗液、無水乙醇、離心純化柱 ）、te緩沖液 操作1、將全血輕輕混勻，轉(zhuǎn)移0.5ml全血到1ml純化樹脂中，顛倒混勻5-6次，室溫，3min。其間要顛倒混勻1次，5000r/min離心3sec；2、取沉淀，加1mlgn結(jié)合液懸浮沉淀，顛倒混勻， 5000r/min離心3sec；3、取沉淀，加0.5ml漂洗液純化樹脂2次，顛倒混勻， 5000r/min離心3ecs；4、取沉淀， 加0.8ml無水乙醇懸浮沉淀，顛倒混勻；裝入離心純化柱，12000r/min離心1min，棄乙醇液；5、空柱再12000r/

3、min離心1min，進(jìn)一步棄乙醇液；6、取離心好的純化柱套入一干凈的1.5ml離心管中，加入100ul te緩沖液于純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3min，12000r/min離心2min。 注意事項一般情況下，純凈的dna od260/od280比值約為1.8，rna為2.0。若樣品中含蛋白質(zhì)，則比值下降，必要時需重新抽提。若dna的比值1.75，則加入sds至0.5%；從核酸中去除蛋白質(zhì)時，常用到酚：氯仿等體積混合液。氯仿的作用是使蛋白質(zhì)變性并有助于水相和有機(jī)相的分離；dna用te溶解，可增加dna的穩(wěn)定性，便于長期保存。二、二、pcr擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)實驗原理實驗原理 多聚酶鏈反

4、應(yīng)（pcr）技術(shù)的原理類似于dna的天然復(fù)制過程?？珊喪鰹椋?在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板dna，四種脫氧核苷酸（dntp），和耐熱t(yī)aq聚合酶及兩個合成的dna引物，并有mg2+存在。實驗原理實驗原理加熱使模板加熱使模板dna在高溫下（在高溫下（94）變性，雙鏈解鏈，這）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（降低溶液溫度，使合成引物在低溫（56）與模板）與模板dna互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段?；パa(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72），在），在taq酶作用下，以酶作用下，以四

5、種四種dntp為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板dna的一條的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和性和dna合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物dna重復(fù)合成，并且重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物dna可作為后一循環(huán)的可作為后一循環(huán)的模板模板dna而參與而參與dna的合成，使產(chǎn)物的合成，使產(chǎn)物dna的量按的量按2n方方式擴(kuò)增。經(jīng)過式擴(kuò)增。經(jīng)過2535個循環(huán)，個循環(huán)，

6、dna擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106109。實實驗驗原原理理 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?本實驗以所提出的全血基因組dna為模板，以線粒體基因上一段核苷酸為引物，擴(kuò)增出924bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。學(xué)習(xí)并掌握pcr 反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。器材和試劑器材和試劑器材器材 pcr擴(kuò)增儀，旋渦振蕩器，臺式離心機(jī)，加樣槍及槍頭等器材與試劑試劑：試劑： 1、pcr試劑盒： （taq dna 聚合酶、 dntp 、mg等） 2、引物 1（68kb上游） 引物 2（69kb下游） 3、無菌ddh2o 4、模板dna：為本次實驗所提出的全血基因組 dna 操作 無菌ddh2o 21.5ul taq酶等 25ul 引物1（68） 0.6ul 引物2 （69） 0.9ul 模板dna 2ul 混勻后，離心5000r/min1min，置pcr儀總體積50ul操作pcr擴(kuò)增擴(kuò)增的設(shè)定的設(shè)定：設(shè)置pcr擴(kuò)增儀的熱蓋溫度為100預(yù)變性：945min循環(huán)： 94變性30s 56退火30s 30個循環(huán) 72延伸30s末次延伸：72 5min4 保存注意事項由于pcr技術(shù)非常敏感，可使一個dna分子得以擴(kuò)增，裝有pcr試劑的微量離心管打開之前，應(yīng)先在微