磷脂酶抑制劑新進(jìn)展

1、具有抗炎、抗過敏活性磷脂酶抑制劑的研究進(jìn)展*王寅朱再明(遼寧師范大學(xué)化學(xué)系大連 116029)劉彥(大連醫(yī)科大學(xué)生化教研室大連 116027)摘要磷脂酶參與細(xì)胞跨膜信息傳遞，磷脂酶A2還是機(jī)體炎癥、過敏介質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。因此，磷脂酶抑制劑的合成研究對研究細(xì)胞表達(dá)某種功能的信息傳遞機(jī)制及與磷脂酶A2激活相關(guān)的疾病治療機(jī)制和藥物研究具有重要意義。本文主要綜述了近期有關(guān)磷脂酶A2抑制劑的合成、結(jié)構(gòu)、抑效性能、構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用前景等,對磷脂酶C和磷脂酶D的抑制劑作了簡要介紹。關(guān)鍵詞磷脂酶A2磷脂酶C磷脂酶D磷脂酶抑制劑Recent Advances in Phospholipase Inhibitors

2、Wang Yin Zhu Zaiming(Department of Chemistry, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China)Liu Yan（Department of Biochemistry， Dalian Medical University, Dalian 116027, China)Abstract Phospholipase A2,C,D are involved in the pathways of cell transmembrane signal transduction,and phospholipase A2

3、（PLA2） is also a critical enzyme which catalyzes the specific hydrolysis of membrane phospholipids and causes the release of inflammatory and allergic mediators.The studies on phospholipase inhibitors are of significance in investigating the mechanism of the signal transduction of cell functional ex

4、pression and the mechanism of some diseases related with PLA2 activation,and also in the development of some antiinflammatory and antiallergic drugs.A brief review on phospholipase inhibitors including their structures,properties, structure-effect relationship and application prospects is given.Key

5、words phospholipase A2; phospholipase C; phospholipase D; phospholipase inhibitors磷脂酶(phospholipase)是指水解甘油磷脂的酶，依水解甘油磷脂的位點(diǎn)不同，將磷脂酶分為磷脂酶A1（PLA1）、磷脂酶A2（PLA2）、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)，如下圖所示。甘油磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也稱膜磷脂。近年來發(fā)現(xiàn)其一項(xiàng)重要功能是作為細(xì)胞應(yīng)答外界刺激(第一信使)，表達(dá)相應(yīng)功能或效應(yīng)的跨膜信息傳遞的第二信使庫，此第二信使是磷脂酶水解膜磷脂的產(chǎn)物。如PLA2水解磷脂生成第二信使花生四烯酸(AA)；磷脂

6、酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)特異的PLC(PIP2-PLC)水解PIP2生成第二信使二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，以及PLD水解磷脂生成第二信使磷脂酸(PA)。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞信息傳遞的磷脂酶有PLA2、PLC、PLD。何種磷脂酶參與細(xì)胞表達(dá)某種功能或效應(yīng)的信息傳遞依細(xì)胞和第一信使而異。磷脂酶抑制劑特異抑制該磷脂酶的活性，阻斷第二信使的產(chǎn)生，則能抑制細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的功能或效應(yīng)。例如：炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在感染等外源或內(nèi)源抗原刺激下，其PLA2被激活，PLA2水解膜磷脂生成AA，后者在脂加氧酶作用下，生成類二十碳多烯化合物，這類化合物中某些在炎癥反應(yīng)中作為炎癥介質(zhì)，某些在

7、過敏反應(yīng)中作為過敏介質(zhì)。炎癥介質(zhì)對炎癥細(xì)胞有強(qiáng)的趨化性，促進(jìn)更多炎癥細(xì)胞向炎癥部位浸潤，從而擴(kuò)大炎癥程度。PLA2抑制劑能抑制PLA2活性，抑制炎癥介質(zhì)或過敏介質(zhì)的生成，表現(xiàn)出抗炎、抗過敏功效。 因此，近年來磷脂酶抑制劑的研究引起人們的廣泛興趣。該領(lǐng)域的研究不僅為研究細(xì)胞跨膜信息傳遞提供似探針性的研究工具，而且對相關(guān)疾病機(jī)制研究及抗炎、抗過敏藥物研制具有重要意義。圖一、磷脂酶A2的抑制劑PLA2是一類水解膜磷脂sn-2位上的脂?；芍舅岷腿苎字拿?，分為分泌型(sPLA2)和胞內(nèi)型(cPLA2)，分別參與食物磷脂的消化及細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，并都參與炎癥、過敏反應(yīng)。酶抑制劑的合成多從合成酶的底

8、物類似物,即合成酶競爭性抑制劑著手來抑制酶的活性。甘油磷脂類似物PLA2抑制劑就屬于這類抑制劑。1.甘油磷脂類似物的PLA2抑制劑甘油磷脂類似物的PLA2抑制劑，如結(jié)構(gòu)1，最早是由de Haas和Van Deenen合成的。他們研究發(fā)現(xiàn)短鍵的磷脂酰膽堿系列化合物，在PLA2水解位點(diǎn)sn-2位上將脂?；韵鄳?yīng)的脂酰胺基取代，能夠抑制PLA2的水解活性1。其抑制機(jī)制主要是非水解的磷脂類似物與底物爭奪酶的活性中心并能與酶活性中心緊密鍵合，以可逆競爭性機(jī)制抑制PLA2催化活性?；谶@一發(fā)現(xiàn)，人們合成了多種有抑制效果的脂酰胺磷脂酰膽堿或乙醇胺系列化合物，如結(jié)構(gòu)2，3，424。從構(gòu)效關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)：(1)

9、增加sn-1位上官能團(tuán)的疏水性可提高磷脂類似物與酶的親合性，增強(qiáng)抑制效果，如sn-1位為硫醚基和醚基的脂酰胺磷脂酰膽堿抑制效應(yīng)達(dá)50%時的濃度(IC50)分別為2和38，比相應(yīng)sn-1位為脂酰基的IC50分別降低約78和4倍；(2)sn-2上脂酰胺基比天然磷脂的脂酰胺基與酶活性中心鍵合能力加強(qiáng)；(3)sn-2脂酰鏈的-次甲基在底物與酶活性中心鍵合上起著重要的作用，如無此-次甲基的脂酰胺磷脂類似物，其抑制活性基本上消失；(4)sn-2脂酰胺鍵的長短及飽和程度也影響抑制效果，飽和的脂酰胺鏈抑效最佳的是十烷基，不飽和脂酰胺鏈比相應(yīng)飽和脂酰胺鏈抑效高，不飽和脂酰胺鏈抑效最佳的為亞油酸和亞麻酸酰胺鏈4；

10、(5)sn-2脂酰胺鏈末端碳上有羥基取代，抑制效果大大降低，有氨基、羧基取代，抑制效果喪失4；(6)脂酰胺磷脂酰乙醇胺類似物（2）比相應(yīng)的脂酰胺磷脂酰膽堿類似物（3）要有較強(qiáng)的抑制效果；(7)甘油磷脂中磷酸部分在底物與酶活性中心鍵合上起著重要作用，因磷酸上帶負(fù)電荷的氧能與激活sPLA2活性的Ca2結(jié)合，雙鍵氧能與酶活性中心48-酪氨酸殘基形成氫鍵5。從sPLA2活性中心的結(jié)構(gòu)特征可解釋以上所述的sPLA2抑制劑的構(gòu)效關(guān)系5。sPLA2活性中心的結(jié)構(gòu)尚未完全確定，根據(jù)酶與底物嵌合形成酶-底物復(fù)合物的X射線衍射結(jié)構(gòu)特征，可知底物甘油磷脂上的兩個脂酰鏈嵌入酶活性中心的親脂區(qū)域，脂酰鏈的長短和飽和程度

11、影響脂酰鏈與酶親脂域的結(jié)合力。底物類似物即抑制劑與酶活性中心的結(jié)合力越大，抑制效果越佳，因此在脂酰鏈尾端增加親水性基團(tuán)如羥基、羧基和氨基都降低抑制劑與酶活性中心親脂區(qū)域的結(jié)合力，使抑制效果大大降低或喪失。底物結(jié)構(gòu)上的酯酰基、羥基等與酶活性中心的必須基團(tuán)如酪氨酸上的羥基形成氫鍵及帶負(fù)電的磷酸根與Ca2螯合力，這些都是必須具備的。凡能增加抑制劑與酶活性中心上的某些必須基團(tuán)形成氫鍵或螯合Ca2的能力，都將增大抑制劑的抑制效果。因此酶活性中心、結(jié)構(gòu)的確定，為酶抑制劑的設(shè)計提供最佳信息。5唾液酸甘油磷脂受脂酰胺甘油磷脂類似物的PLA2抑制劑的啟發(fā)，改變甘油磷脂親水性的頭部基團(tuán)可能對PLA2具有抑制作用。

12、結(jié)構(gòu)5是以寡聚唾液酸鏈取代磷脂親水性頭部的膽堿或乙醇胺的產(chǎn)物，結(jié)果該系列化合物對sPLA2有較強(qiáng)抑制效果，對PLC僅有一定抑制作用6。甘油磷脂中的磷酸部分在底物與酶活性中心鍵合中起著重要作用，如增加磷脂中磷酸數(shù)則可能增加抑制劑與底物競爭和酶活性中心鍵合的能力，如心磷脂系列化合物(6)(結(jié)構(gòu)中A、B、C、D之一為羥基，其余為飽和或不飽和脂?；?，6對sPLA2有強(qiáng)的抑制作用，且對大鼠肝線粒體PLA2抑制有效果強(qiáng)、特異性高、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)毒性低等特點(diǎn)，對臨床治療與PLA2激活相關(guān)的線粒體功能損傷性疾病，如Reyes綜合癥，肌麻痹及惡性高熱癥等，有很大應(yīng)用潛力。該類心磷脂類似物與天然一溶血心磷脂(A、B、

13、C、D中之一的脂酰基被水解)相似。從牛心中提取的心磷脂受蛇毒sPLA2水解所得到的一溶血心磷脂，對大鼠線粒體PLA2也顯示強(qiáng)的抑制作用，從而證實(shí)了心磷脂系列對sPLA2的抑制作用7。根據(jù)甘油磷脂類似物對sPLA2抑制的特點(diǎn)，將甘油磷脂類似物sn-2位上脂?；造⑺峄妫色@得膦酸脂基磷脂類似物，其抑效最佳的是由Gelb 等合成的化合物(7)，它對蛇毒sPLA2有強(qiáng)的抑制作用。該類化合物中甘油sn-1位上的長鍵醚脂基對抑制效果起著重要的作用，如無此醚脂基的膦酸脂基磷脂類似物，則抑制效果大大降低，表明sn-1上長鍵醚脂基的引入對抑制劑與酶鍵合起著很重要的作用8。2.合成的非甘油磷脂類似物PLA2

14、抑制劑目前，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的非甘油磷脂類似物具有抑制PLA2的性能。P-溴苯甲酰甲基溴通過修飾酶活性中心的必要基團(tuán)組氨酸，不可逆抑制sPLA29。N-羥甲基-N-3,5-雙(烷氧基)苯基甘氨酸(Ro 239358)(8)是一類具有強(qiáng)抗炎、抗過敏活性的sPLA2抑制劑。在Ro239358結(jié)構(gòu)中，每個羧基上帶負(fù)電荷的氧作為Ca2+的配位體，螯合Ca2+，抑制Ca2+對sPLA2的激活，同時苯環(huán)和烷基鏈可占據(jù)底物親脂部分與酶鍵合的空穴，從而使Ro 23-9358顯出對sPLA2很強(qiáng)的抑制作用。這類化合物對cPLA2是抑制還是激活依賴環(huán)境中Ca2+濃度，高濃度Ca2+(2M)時，它對U937細(xì)胞的c

15、PLA2有激活作用；低濃度Ca2+(011M)時,它對cPLA2有抑制作用；IC50為48，估計它對cPLA2抑制是通過螯合Ca2+來進(jìn)行的10。目前，對cPLA2抑制劑研究較少，Hasegawa 等人合成的取代苯磺酰胺產(chǎn)物(9)是cPLA2的抑制劑。在其結(jié)構(gòu)中，各取代基的變化對該抑制劑的IC50影響較大，例如，N-CH3的引入可使其IC50減少13325，而且苯環(huán)中吸電子基OH或SO2CH3的引入也可使化合物的抑制效果有較大的增加。具有代表性的該類化合物ER-3826，其對兔心肌細(xì)胞cPLA2的IC50是0.028，具有非常好的抑制效果11。由Failli 等人合成的2-苯胺基苯乙酸系列sP

16、LA2抑制劑(10)對sPLA2、環(huán)加氧酶和脂氧合酶皆有良好的抑制作用，具有抗炎、抗過敏及保護(hù)細(xì)胞免受sPLA2激活造成組織細(xì)胞損傷等作用12。Beaton 等人根據(jù)甘油磷脂的磷酸部分與酶活性中心相互作用的觀點(diǎn)，認(rèn)為羧基官能團(tuán)也可能與酶的活性中心相互作用，而且認(rèn)為像含有羧基官能團(tuán)這樣簡單的化合物會比甘油磷脂類似物更容易代謝。依此假設(shè)，成功地合成了一系列羧酸sPLA2抑制劑，其中最有效的抑制劑FPL67047XX（11）對人血小板sPLA2的IC50為0021，這為依據(jù)構(gòu)效理論設(shè)計目標(biāo)化合物提供了良好的例子13。N-烷基脯胺酰胺(12)合成方法簡單，對佛波酯激活巨噬細(xì)胞的cPLA2、環(huán)加氧酶及脂

17、氧合酶有良好的抑制作用14。Acevedo 等人合成了吡咯烷磷酯低聚體化合物(13)。該系列化合物對PLA2具有良好的抑制作用，其IC50是1.515。2-苯氧基苯磺胺系列(14)是由2-苯氧基苯胺與取代的苯磺酰氯在吡啶中縮合而得，它對PLA2也具有特異的抑制作用，是一種很好的抗炎藥物16。雙芳氧基烷烴系列化合物(15)也是PLA2的抑制劑，它們對各種炎癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑囊炎、銀屑病等有良好的醫(yī)治作用，它的抑制效果IC50為051017。5-羥基-4-苯基-2-呋喃酮及其系列物(16)對PLA2有較強(qiáng)的抑制效果，它們是由對烷氧基苯乙醛與羥基乙酸環(huán)合而得，也是一種效果良好的抗炎、抗過敏藥物18

18、。N-烷胺基酯酰胺系列(17)，十八烷胺正己醇系列(18)及2-環(huán)氧乙烷基烷基酯系列(19)，它們對人血小板sPLA2皆有抑制作用，且具有良好抗炎、抗過敏等藥效1921。3.從天然產(chǎn)物中提取的PLA2抑制劑從天然產(chǎn)物中提取的PLA2抑制劑，研究較多并有代表性的是從具有抗炎、抗過敏藥效的天然海綿中提取的manoalide（20）,能不可逆抑制(即滅活)蛇毒sPLA222，蜂毒sPLP223，最大抑制率達(dá)85%，有較強(qiáng)的抗炎、抗過敏、抗表皮增生及免疫抑制效果，現(xiàn)已制備成藥物應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)24。人工合成的manoalide的類似物manoaloques(21)能部分滅活sPLA2活性，滅活率達(dá)47%

19、。在構(gòu)效關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，manoalide中烯醛基及保證內(nèi)酯環(huán)能開合是滅活sPLA2所必需的。如對內(nèi)酯環(huán)上羥基甲基化，使其不能可逆地開合，則失去對sPLA2的滅活；烯醛基還原為醇也喪失滅活sPLA2的性能。通過分析manoalide處理的眼鏡蛇毒sPLA2的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)sPLA2中有4個賴氨酸(Lys)殘基被修飾，而manoaloque只能修飾3個Lys殘基。可認(rèn)為這4個Lys殘基是酶活性的必需基團(tuán)25。從青霉素屬SP BM-99的培養(yǎng)液分離出的真菌代謝產(chǎn)物ergophilones A和B，對于兔血小板sPLA2具有較強(qiáng)的抑制活性。它們的IC50分別是044和056，但對豬胰的PLA2的

20、抑制活性較小，IC50分別是517和39026。PLA2抑制劑thielocins系列是從菌屬Thielavia terrleola RF-143發(fā)酵液中分離出的一類新型PLA2抑制劑，其對兔PLA2和重組人的PLA2具有強(qiáng)的抑制作用，其中對兔PLA2最強(qiáng)的抑制活性IC50是00033，對人PLA2 IC50是007627。Ergophilones A和B及RF-143的藥理作用及對酶抑制的特異性有待于研究。二、PLC與PLD抑制劑PLC、PLD位于細(xì)胞內(nèi)，其激活可能受蛋白激酶磷酸化的調(diào)節(jié)。兩者激活后水解膜磷脂分別生成第二信使DAG和PA，PA可在磷酸酶作用下生成DAG?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)PLC、PLD是

21、胞內(nèi)信息傳遞的重要組分，由于PLC、PLD酶蛋白的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的研究尚未完善，因而限制了PLC、PLD抑制劑的研究，同時也影響細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)功能的信息傳遞的研究。1.合成的PLC、PLD抑制劑U73122(22)是人工合成的氨基類固醇類化合物，是一種PLC(很可能是PIP2-PLC）的抑制劑。此結(jié)論來自以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)膠原和凝血酶能激活血小板受體介導(dǎo)的PIP2-PLC，產(chǎn)生第二信使DAG和IP3，兩者分別激活PKC和動員胞內(nèi)Ca2，從而激活血小板凝集的信息傳遞；U73122能抑制膠原和凝血酶對血小板PIP2-PLC的激活，抑制第二信使DAG和IP3產(chǎn)生，從而抑制血小板凝集28。U73122能抑

22、制甲酰蛋氨酰亮氨酰苯丙氨酸(FMLP)對中性粒細(xì)胞的激活，也表現(xiàn)在U73122抑制FMLP對中性粒細(xì)胞的PIP2-PLC的激活29。（2)人SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤表面優(yōu)勢表達(dá)M3亞型蕈毒堿乙酰膽堿受體(mAChR)，配體與受體結(jié)合能激活G蛋白偶聯(lián)的PIP2-PLC，導(dǎo)致mAChR脫離細(xì)胞入胞液，U73122能抑制mAChR脫離細(xì)胞，表現(xiàn)在它對配體與受體結(jié)合誘導(dǎo)PIP2-PLC活性的抑制30。（3)光敏細(xì)胞L5178Y淋巴細(xì)胞受可見光照射能誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，凋亡的機(jī)制表現(xiàn)在光能誘導(dǎo)細(xì)胞PLC的激活，U73122抑制光對細(xì)胞PLC的誘導(dǎo)，從而抑制該細(xì)胞凋亡31。以上實(shí)驗(yàn)說明U73122很可能是P

23、IP2-PLC的抑制劑，但也有文獻(xiàn)表明U73122對PLC抑制并非完全特異，因葡萄糖能激活胰島細(xì)胞PIP2-PLC，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放胰島素，U73122對細(xì)胞的PLC的抑制較其無抑效的對照物U73143(23)無明顯差別32，可見U73122對PIP2-PLC抑制的特異性有待深入研究。U73122結(jié)構(gòu)與U73143極為相似，僅在合成上用丁二酸酐代替順丁烯二酐，但U73143對PLC、PLA2皆無抑制作用。在對U73122結(jié)構(gòu)與抑制關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)除去3位上OCH3基會大大降低抑制活性，C17側(cè)鏈長短對抑制效果也有一定的影響；用巰基乙醇預(yù)處理U73122則破壞U73122對PLC的抑制作用25。U

24、26384與U73122屬于同類化合物，但前者對PLC無抑制作用，對PLA2有抑制作用。2.天然的PLC、PLD抑制劑從真菌Caloporus dichrous分離得到一種含唾液酸的化合物，稱為caloporoside(24)，它以可逆競爭性機(jī)制抑制豬腦PLC，IC50為1831，但對豬胰腺，眼鏡蛇毒的PLA2及甘藍(lán)(cabbage)中PLD無抑制效果，且抗細(xì)菌和真菌的活性也較低33。從細(xì)菌Penicillium vinaceum分離的PLC抑制劑vinaxanthone (Ro 09-1450)(25)對大鼠PLC有強(qiáng)抑制作用，IC50為5.434，從Chaetosphaeroneama h

25、ispidulum培養(yǎng)肉湯中分離得到一種PLC抑制劑，稱為hispidospermidin(26)，其對大鼠PLC也有強(qiáng)的抑制作用，IC50為1635。PLD抑制劑文獻(xiàn)報道的較少，從真菌Nattrassia mangiferase提取分離得到三種結(jié)構(gòu)相似的化合物稱為Sch49210(27)，Sch 53514(28)和Sch 53516，它們對PLD有較強(qiáng)抑制作用，其中Sch 53514對PLD抑制效果最佳，IC50為0.2，Sch49210的IC50為1.6，這些化合物對不同腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤浸潤活性36。分離提取的PLC、PLD抑制劑的藥理作用及對酶抑制的特異性有待研究。目前，抗炎、抗過敏

26、藥物及醫(yī)治與PLA2激活相關(guān)疾病的藥物多用類固醇激素類PLA2抑制劑，如地塞米松等。這類藥物具有強(qiáng)的副作用，因此開發(fā)研制非類固醇激素類PLA2抑制劑具有良好的應(yīng)用前景。本文綜述的PLA2抑制劑皆為非類固醇激素類，但它們對PLA2抑制的特異性、藥理、毒理及臨床試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。PLC、PLD抑制劑的研究文獻(xiàn)較少，且其構(gòu)效關(guān)系、特異性及藥理作用尚未完善。若能發(fā)現(xiàn)特異高、抑效強(qiáng)的PLC、PLD抑制劑將會推進(jìn)細(xì)胞跨膜信息傳遞的研究。收稿：1997年5月， 收修改稿：1997年7月*國家自然科學(xué)基金和遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目參考文獻(xiàn)1 Bonsen P P M,de Haas G H,van Dee

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