ELISA常見(jiàn)問(wèn)題和處理

1、問(wèn)題可能原因解決方法1、無(wú)顏色試劑孵育的時(shí)間沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時(shí)間是否適當(dāng)。2、不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用。重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑。3、漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加5、HRP酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題(若在標(biāo)本孔中有信號(hào))按說(shuō)明書(shū)檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品 某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠 使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體重新確認(rèn)所選用的試劑 .漏加顯色劑

2、A或B加顯色劑后觀察一下液面高度 試劑配制/使用有誤將實(shí)驗(yàn)重做；嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。 緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液 顯色弱超過(guò)有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)。檢查產(chǎn)品的有效期 加入試劑的體積和時(shí)間有誤確定所使用的每一個(gè)試劑的體積正確的和加入的時(shí)間是適當(dāng)?shù)摹?#160;試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右 縮短孵育時(shí)間能使實(shí)驗(yàn)的信號(hào)變?nèi)?。檢查孵育的時(shí)間。 在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。 使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。 標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)

3、本制備方法不規(guī)范檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng) 顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。 檢測(cè)時(shí)間不當(dāng)是否在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)。 儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。 高背景(本底)洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。最好使用洗板機(jī)，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)完全充滿(mǎn)洗滌緩沖液，傾出時(shí)應(yīng)迅速。若使用洗板機(jī)，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿(mǎn)每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔

4、加樣量的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。 實(shí)驗(yàn)中孵育溫度和時(shí)間不適當(dāng)確定每一實(shí)驗(yàn)步驟的孵育溫度和時(shí)間是否適當(dāng) 酶加量過(guò)多加酶前驗(yàn)看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋度，若必要進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。 封閉不完全檢查封閉液的計(jì)算量；提高封閉時(shí)間。 標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)做適當(dāng)?shù)膶?duì)照 顯色劑受光照時(shí)間較長(zhǎng),或污染顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出 整批樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染 緩沖液污染制備新鮮的緩沖液 吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑吸頭盡可能一次性使用&

5、#160;太多的信號(hào)：全部的板子變成規(guī)則的藍(lán)色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒(méi)結(jié)合的過(guò)氧化物酶仍有殘留。最好使用洗板機(jī)充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。 底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍(lán)色應(yīng)控制底物混合的時(shí)機(jī)并立即使用 太多的酶結(jié)合物檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定 封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍(lán)色。使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器 緩沖液中污染金屬或HRP制備新鮮緩沖液 高CV值(CV：coefficient of variation)，花板操作不慎或洗滌不充分按說(shuō)明書(shū)洗板、加樣、顯色。洗板

6、尤為重要，如上所述 出現(xiàn)干板，沒(méi)有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用確定每?jī)刹襟E間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤(rùn)。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。 由于操作失誤或板子質(zhì)量差(結(jié)合不均勻)造成包板不均勻。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時(shí)間和試劑加入的方法。 檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子(不要使用組織培養(yǎng)板) 移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂?biāo)本的加入步驟，確保每次加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時(shí)注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。 樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或

7、殘留細(xì)胞成分標(biāo)本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血(溶血)的標(biāo)本 緩沖液污染制備新鮮的緩沖液 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得到，但兩點(diǎn)之間區(qū)別很差(低或平的曲線(xiàn))酶結(jié)合物不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定 捕獲抗體沒(méi)有很好結(jié)合到板上檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子(不要使用組織培養(yǎng)板)稀釋用的PBS中不要加其它蛋白 檢測(cè)抗體不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定 板子顯色不足延長(zhǎng)底物孵育實(shí)驗(yàn)使用推薦品牌的底物溶液 操作不慎回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)稀釋度計(jì)算有誤核查計(jì)算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

8、 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)很好，但是沒(méi)有任何期望的陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生在標(biāo)本中無(wú)相應(yīng)的細(xì)胞因子使用內(nèi)參對(duì)照重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重新考慮實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)參數(shù) 標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測(cè)將標(biāo)本至少做12相應(yīng)的稀釋?zhuān)蜻M(jìn)行系列稀釋觀測(cè)它的恢復(fù)性 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)很好，但是標(biāo)本的判讀值很高標(biāo)本中含的細(xì)胞因子水平超過(guò)實(shí)驗(yàn)范圍將標(biāo)本做稀釋并再次實(shí)驗(yàn) 當(dāng)使用HRP酶結(jié)合物時(shí)，TMB底物加終止液后顯綠色孔中的試劑顯色不充分輕輕振蕩板子 邊緣效應(yīng)工作環(huán)境溫度不均衡避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育 漂移實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)間斷整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)連續(xù)操作：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備 試劑沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)平衡

9、至室溫在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說(shuō)明書(shū)中有另外的要求。 是否可更改試劑盒 所提供的實(shí)驗(yàn)操作步驟？一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性，對(duì)試劑盒都進(jìn)行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性應(yīng)按說(shuō)明書(shū)操作。 是否可混用不同試劑盒中的試劑？不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問(wèn)題可與廠家或代理商聯(lián)系。 是否可增加或減少標(biāo)本的體積。商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。 是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的點(diǎn)？可以。說(shuō)明書(shū)上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線(xiàn)的點(diǎn)，但是必須

10、在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，高于試劑盒中最高標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)和低于靈敏度以下的點(diǎn)是無(wú)效的。ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素。下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。 1樣品稀釋 酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋?zhuān)豢杀苊鈺?huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)

11、。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是，有些用戶(hù)未能?chē)?yán)格按使用說(shuō)明書(shū)操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10l樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)瑐€(gè)別用戶(hù)取5l甚至1l樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)捎谖焐喜豢杀苊獾卣从袠悠芬约拔⒘恳埔浩鞯木炔粔颍虼嗽斐蓸悠废♂尡稊?shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題。 2試劑盒平衡 試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25)，一般需在室溫放置2030分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37溫箱20分鐘。 3樣品和試劑的混勻 稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均

12、一性。 4加樣 在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。 5溫育 溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反

13、應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37和室溫，其次是43和28。一些操作者，擅自改變說(shuō)明書(shū)操作，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因?yàn)?，不同試劑盒有不同的溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。 6洗板 固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，也是極其關(guān)鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力

14、拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。 7邊緣效應(yīng) 使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25左右）置于37溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。 8顯色 顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結(jié)果偏低

15、；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加。 9比色 比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。 其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異

16、顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。 綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出

17、現(xiàn)問(wèn)題的可能原因，特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)于下表。 1 問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)對(duì)同樣培養(yǎng)的相同濃度的細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)其上清液相同細(xì)胞因子的濃度，不同的報(bào)道差別為什么很大？參考解析：不同廠家的試劑盒當(dāng)然有很大影響。ELISA非常敏感，即使是同一個(gè)試劑盒，用同一個(gè)廠家同一濃度的刺激因子，incubate 時(shí)間不同也會(huì)影響結(jié)果，這就是為什么每次都要設(shè)內(nèi)部和外部對(duì)照的原因。這主要和其抗體標(biāo)準(zhǔn)品原料來(lái)源有關(guān)，建議購(gòu)買(mǎi)ELISA試劑盒時(shí)選擇大公司提供的產(chǎn)品，這樣結(jié)果比較可靠一點(diǎn)。 2 問(wèn)：ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？參考解析：溫育常采

18、用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度3 問(wèn)：檢測(cè)疫苗免疫小鼠后的抗體情況。用了商品化的試劑盒。       1 商品化的板子已經(jīng)用病毒裂解液包被了。       2 洗3次后，將陽(yáng)性和陰性血清（豬），樣品血清（小鼠）1：40稀釋加入，留2個(gè)空做空白對(duì)照，30分鐘37度       3 洗3次，在一個(gè)空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000），一個(gè)

19、加入商品化已稀釋抗豬二抗（不知稀釋倍數(shù)）。在陽(yáng)和陰中加入抗豬二抗，樣品中加入抗鼠二抗。       4 洗4次。經(jīng)加入底物AB侯顯色15分鐘。終止。測(cè)630nm 結(jié)果加入豬二抗的空白空為0.277；陽(yáng)性為0.964，陰性為0.503%        假如鼠二抗的空白空為0.951：個(gè)樣品都在1.000作用       請(qǐng)問(wèn)為什么兩個(gè)空白空的值差那么多？是不是鼠二抗與包被的病毒抗原結(jié)合，還是二抗的稀

20、釋倍數(shù)不夠？或者其他原因？參考解析：       1首先抗豬二抗和抗鼠二抗本來(lái)就是不同的東西（且稀釋度不同），在沒(méi)有非特異性結(jié)合出現(xiàn)的情況下，應(yīng)該是OD值相差無(wú)幾，但是從現(xiàn)在的結(jié)果看，肯定是二抗有非特異性的結(jié)合（這一點(diǎn)從加入的樣品鼠血清孔 與 鼠二抗空白孔差別不大也可以看出來(lái)），故造成兩孔OD值差異。       2 當(dāng)然這么高的本底也有可能是你的抗體濃度使用稀釋度不當(dāng)或者洗板不徹底（殘余大量未結(jié)合的酶標(biāo)抗體）造成的，請(qǐng)首先查明。    

21、;   3 不知道你使用的是什么底物進(jìn)行顯色，好像常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)的底物是沒(méi)有檢測(cè)波長(zhǎng)在630nm的。       4 排除了2.3兩點(diǎn)的問(wèn)題再考慮是否是二抗不純并與包被的病毒裂解物結(jié)合的問(wèn)題。    你加入的商品化稀釋的抗豬二抗，卻不知道稀釋度，這在ELISA實(shí)驗(yàn)中是不可取的，酶標(biāo)抗體的濃度過(guò)高必然引起顯色本底很高。 你可以取包被的板條不加樣品直接加入梯度稀釋的酶標(biāo)記二抗，取OD值在0.1以下時(shí)的稀釋度再進(jìn)行檢測(cè)。若檢測(cè)值很低則是抗體的敏感性問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)更換其它抗體。4問(wèn)：請(qǐng)教一下，

22、用雙夾心ELISA法檢測(cè)，用菌體免疫的小鼠和家兔，免疫后采集血清，可以直接包被血清嗎，還是需要純化后在包被？ 菌體與佐劑乳化時(shí)需要無(wú)菌操作嗎？裝血清用無(wú)菌操作嗎？參考解析：血清不可以直接包被，主要是因?yàn)檠宓膒H和離子強(qiáng)度與通用的包被液不同，而且會(huì)造成一些非特異蛋白質(zhì)的吸附，不利于特異性抗原或抗體的檢測(cè)。純化血清的方法很多，一般有鹽析法和柱層析法，也可二者聯(lián)合使用，視對(duì)純度要求不同而異。一般鹽析法（比如硫酸銨沉淀）純化后就可獲得主要的免疫球蛋白，而去除其他雜蛋白（如白蛋白等），如果需要進(jìn)一步純化的話(huà)，還可用凝膠層析法或離子交換層析法來(lái)進(jìn)一步純化獲得IgG，如果抗原足夠純的話(huà)，也可以用

23、親和層析法來(lái)做，但這些實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致抗體效價(jià)的下降和免疫球蛋白的損失，所以要充分衡量利弊再做決定5問(wèn)：要在balb/c小鼠上，免疫蛋白，做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，elispot檢測(cè)CTL，elisa檢測(cè)抗體，我想不加強(qiáng)免疫，在第一次免疫一周后，就做能出結(jié)果嗎？參考解析：加強(qiáng)免疫只是增加血液中抗體滴度，只是量的增加，理論上不影響定性檢測(cè)。elisa的敏感性很高，第一次免疫后，CTL和抗體都應(yīng)該能夠檢測(cè)到，但實(shí)際操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，具體檢測(cè)效果如何，你應(yīng)該試著做做。本底及假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因分析1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別      基因工程抗原是抗原基因在

24、質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類(lèi)抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有： 1標(biāo)本因素； 2試劑因素； 3操作因素。本文就標(biāo)本因素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下討論。      血清是最常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源 性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：

25、 1內(nèi)源性物質(zhì)     有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。    常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異 性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 （1）類(lèi)風(fēng)濕因子     人血清中IgM、IgG型類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。 解決該情況的辦法是：用F(ab)2替代完整的IgG；標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63，10 min）IgG的固相吸附劑處

26、理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本 稀釋液中，使RF降解。 （2）補(bǔ)體      ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使C1q 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標(biāo)本；用53，10 min或56，30 min加熱血清使C1q滅活。 （3）嗜異性抗體      人類(lèi)血清中含有能與嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如鼠等）Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可

27、將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng) 物Ig (s) ，但加入量不足或亞類(lèi)不同時(shí)無(wú)效。 （4）嗜靶抗原的自身抗體      抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。 為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體      臨床開(kāi)展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠

28、源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體 內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。 （6）交叉反應(yīng)物質(zhì)       類(lèi)地高辛、類(lèi)AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí) ，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 （7）標(biāo)本中其它成分的影響        血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。 2外源性物質(zhì)        外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久、標(biāo)本凝集 不全和采血管中添加物等影響。 （1）標(biāo)本溶血     由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)