王鏡巖生化 核酸PPT課件

1、P330 表5-1 兩類核酸的基本化學(xué)組成RNA： D-核糖， A、G、C、U堿基DNA： D-2-脫氧核糖， A、G、C、T堿基 第1頁/共75頁一、堿基1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T P331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基： 100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C。第2頁/共75頁二、核苷與脫氧核苷核酸中的核苷與脫氧核苷均為-型嘧啶堿： C1 N1，嘌呤堿： C1 N9。 P332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷第3頁/共75頁三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯

2、化 P332結(jié)構(gòu)式：5-AMP 3-dCMP 第4頁/共75頁第5頁/共75頁1、構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP2、細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物第6頁/共75頁核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。環(huán)核苷酸3,5-cAMP， 3,5-cGMP激素的第二信使，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-

3、半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第7頁/共75頁第二節(jié)第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)一級：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。第8頁/共75頁一、DNA的一級結(jié)構(gòu)dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通過3、5-磷酸二酯鍵連接起來的線形多聚體。 P483 圖 13-2 寫法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3 第9頁/共75頁第10頁/共75頁二、DNA的二級結(jié)構(gòu)1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff 規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射分析提出了D

4、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。Chargaff 規(guī)律 1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P486。b. DNA的堿基組成具有種的特異性。c. DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。d. 年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。 DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。Franklin相 對 濕 度 9 2 % ： B DNA。相 對 濕 度 7 5 % ： A DNA。 ZDNA。第11頁/共75頁1、Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B-DNA)P486圖135 兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53，另一條35 嘌呤

5、與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側(cè)。 磷酸與脫氧核糖彼此通過3、5-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架。 兩條核苷酸鏈，依靠堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。A=T、G=C 每圈螺旋含10個核苷酸，堿基堆積距離0.34nm，螺距：3.4nm，雙螺旋平均直徑2nm， 大溝：寬1.2nm ，深0.85nm，小溝 ：寬0.6nm，深0.75nmP487 圖13-6 13-7第12頁/共75頁第13頁/共75頁2、穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上

6、的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。第14頁/共75頁三、DNA二級結(jié)構(gòu)的多型性P489 表13-6 A-、B-、Z-DNA的比較1、BDNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個堿基對螺旋扭角36螺距：3.32nm堿基傾角：1生物體內(nèi)DNA均為BDNA。第15頁/共75頁2、A-DNA在相對濕度75%以下所獲得的DNA纖維。右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。第16頁/共75頁4、D

7、NA三股螺旋（H-DNA）DNA的三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。第17頁/共75頁四、四、DNA二級結(jié)構(gòu)的不均一性二級結(jié)構(gòu)的不均一性1、反向重復(fù)序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心區(qū)域?yàn)閷ΨQ軸，其兩側(cè)的堿基對順序正讀和反讀都相同。較長的回文結(jié)構(gòu)，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。2、富含AT的序列很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT堿基對。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動的Pribn

8、ow區(qū)，富含AT對。第18頁/共75頁五、環(huán)狀DNA某些病毒DNA某些噬菌體DNA某些細(xì)菌染色體DNA細(xì)菌質(zhì)粒DNA真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA第19頁/共75頁1、環(huán)狀DNA的不同構(gòu)象P491圖13-12 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋第20頁/共75頁（1）、松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA正超螺旋：在一端使繩子向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。負(fù)超螺旋：在繩子一端向松弛方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個右旋的超螺旋，以解

9、除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。第21頁/共75頁2、環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性以 2 6 0 b p 組 成 的 線 形 B - D N A 為 例 ， 螺 旋 周 數(shù)260/10.4=25。連環(huán)數(shù)（L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。松馳環(huán)：L=25解鏈環(huán)：L=23超螺旋：L=23第22頁/共75頁纏繞數(shù)（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示松馳環(huán)T=25解鏈環(huán)T=23超螺旋T=25超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù)W）松馳環(huán)W=0解鏈環(huán)W=0超螺旋W= -2L=T+W第23頁/共75頁比連環(huán)差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L

10、0L0是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般為-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9個負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起（L），很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等第24頁/共75頁Superhelix density=/=每一圈初級螺旋（10bp，360）出現(xiàn)超螺旋數(shù)不同生物的DNA分子的大小不同形成幾乎相同的超螺旋密度SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496) =-0.05E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中=-0.05=5%負(fù)向超螺旋第25頁/

11、共75頁3、拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（擰緊）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時，使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA。第26頁/共75頁六、DNA的生物學(xué)功能首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 P342 14 Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第27頁/共75頁第28頁/共75頁第三節(jié)第三節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)一、RNA的一級結(jié)構(gòu)AMP、GMP、CMP、UMP通過3、5磷酸二酯鍵形成的線形

12、多聚體。 P484 圖13-3 RNA基本結(jié)構(gòu)第29頁/共75頁組成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有堿基。天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。第30頁/共75頁二、RNA的類型核糖體RNA： rRNA 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA： tRNA信使 RNA： mRNA 核內(nèi)小RNA： snRNA （small nuclear RNA ） P344 表5-7 大腸桿菌中的RNA第31頁/共75頁三、tRNA的結(jié)構(gòu) 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系數(shù)4S左右有較多稀有堿基 圖3末端為CpCpA-OH，用來接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端

13、。5末端大多為pG或pC二級結(jié)構(gòu)是三葉草形 P496 圖46-18 tRNA的二級結(jié)構(gòu)（三葉草模型） 第32頁/共75頁第33頁/共75頁四、mRNA的結(jié)構(gòu)1、真核mRNA的結(jié)構(gòu)（1）、3-端有一段約30-300核苷酸的polyA。PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長；而衰老的mRNA，其polyA較短。（2）、5-帽子P346 帽子結(jié)構(gòu)：第34頁/共75頁帽子結(jié)構(gòu)： 3-mG-5ppp5-Nm-3-P5末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個核苷酸相連，形

14、成5-5-磷酸二酯鍵。帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可為核糖體提供識別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。第35頁/共75頁2、原核mRNA的結(jié)構(gòu)（多順反子）由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5帽子和3polyA。SD序列：5端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列和核糖體16S的rRNA的3末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。第36頁/共75頁六、rRNA的結(jié)構(gòu)rRNA與核糖體蛋白結(jié)合一起構(gòu)成核糖體。大腸桿菌中有三

15、類rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA真核細(xì)胞有四類rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA28S rRNA P346 圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu)第37頁/共75頁第38頁/共75頁第四節(jié)第四節(jié)核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)第39頁/共75頁一、解離性質(zhì)磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。DNA等電點(diǎn) 44.5RNA 等電點(diǎn) 22.5第40頁/共75頁二、水解性質(zhì)1、堿水解室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 圖 在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。DNA、RN

16、A水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義：DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。第41頁/共75頁2、酶水解RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外切酶核酸內(nèi)切酶 ：限制性核酸內(nèi)切酶第42頁/共75頁三、光吸收性堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收，max=260nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。第43頁/共75頁2、含量計(jì)算1 ABS值相當(dāng)于：5

17、0ug/mL雙螺旋DNA 或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸3、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)P347 圖5-15 DNA的紫外吸收光譜 增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。第44頁/共75頁第45頁/共75頁四、沉降特性（DNA）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。 P348 圖516 Cs-Cl密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA 相對沉降常數(shù)線型雙螺旋分子 1.00松馳雙鏈閉環(huán) 1.14切刻雙鏈環(huán) 1.14單鏈環(huán) 1.

18、14線型單鏈 1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41坍縮 3.0第46頁/共75頁五、變性、復(fù)性1、變性核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。P350 圖5-18變性過程 因素 ：熱變性 酸堿變性（pH小于4或大于11） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 變性后 ：260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 第47頁/共75頁第48頁/共75頁（1）、熔解溫度（Tm）：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度。濃度50ug/mL時，雙鏈DNA A260=1.00，完全變性（單鏈）A260= 1

19、.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應(yīng)的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在7085之間。第49頁/共75頁（2）、影響DNA的Tm值的因素DNA均一性 。 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44 P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關(guān)系介質(zhì)中離子強(qiáng)度其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。P351 圖5-21第50頁/共75頁第51頁/共75頁2、復(fù)性變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm2025）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性DNA在緩慢冷卻時可以復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性

20、。DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Cot衡量。Co為變性DNA原始濃度molL-1，t為時間，以秒表示。第52頁/共75頁 P352 圖5-22，不同DNA的復(fù)性時間。1個核苷酸對（A.U），若濃度為Co=1.0m mol/L，則50%復(fù)性時， Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部復(fù)性， Cot=10-4， t=0.1秒E.coli 4.2106堿基對，若濃度Co=1.0 umol/L，則復(fù)性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，約115天。復(fù)性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5108秒，5758天。復(fù)

21、性機(jī)制：10-20bp成拉鏈第53頁/共75頁第54頁/共75頁第五節(jié)第五節(jié)核酸研究技術(shù)核酸研究技術(shù)一、核酸的分離純化盡可能保持其天然狀態(tài)。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。第55頁/共75頁1、DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。第56頁/共75頁2、RNA的制備（重點(diǎn)介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（R

22、NP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對RNA的破壞。第57頁/共75頁二、核酸的凝膠電泳1、瓊脂糖電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比 凝膠濃度 DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5V/cm2、PAGE電泳第58頁/共75頁三、限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、限制修飾系統(tǒng) 圖 第59頁/共75頁2、II型核酸內(nèi)切酶限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對稱（反向重復(fù)）。II型酶的切割頻率識別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 限制酶的命名：E.coRI第一位： 屬名E（大寫）第

23、二、三位：種名的頭兩個字母小寫co第四位： 菌株R第五位： 從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號第60頁/共75頁第61頁/共75頁同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 BamHI：GGATCC BstI GGATCCMboI GATC Sau3A GATC同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BclI TGATCA BglII AGATCA 星號活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會發(fā)生變化。例如 HindIII AAGCT

24、T 第62頁/共75頁四、DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)。末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖第63頁/共75頁五、分子雜交1、SouthernBlottingP353 圖5-23DNA樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位?？捎肈NA或RNA探針。第64頁/共75頁第65頁/共75頁2、NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA。總RNA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。 抗原與抗體的雜交第66頁/共75頁六、DNA序列分析（一）（一）化學(xué)裂解法（化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert法）法）原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端