地鱉纖溶蛋白對荷S180和H22小鼠的抑瘤作用研究.

1、地鱉纖溶蛋白對荷 S180 和 H22 小鼠的抑瘤作用研究 【摘要】 目的研究地鱉蟲纖溶活性先導(dǎo)蛋白（EFP 對荷 S180 和 H22 小鼠 腫瘤的抑制作用。方法通過體外實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建荷瘤小鼠模型，藥物實(shí)驗(yàn)分為陽性 對照組（環(huán)磷酰胺），陰性對照組（生理鹽水），藥物高濃度組、中濃度組和 低濃度組。實(shí)體瘤通過瘤重計(jì)算抑瘤率，腹水瘤通過細(xì)胞濃度計(jì)算抑瘤率。結(jié) 果 EFP 對 S180 腹水瘤有較好的抑制率， 藥劑量為 2.90mg/kg 的抑制率為 69.56%,明顯高于環(huán)磷酰胺（20mg/kg）的 51.75%的抑制率；EFP 對 S180 實(shí)體瘤 有較好抑制作用， 藥劑濃度為 1.45 g/kg

2、時， 抑制率為 37.48%， 高于環(huán)磷酰胺 （20 mg/kg）的 35.59%的抑制率，并呈現(xiàn)一定的藥物劑量依賴性；藥劑濃度為 0.73 mg/kg 時，對 H22 實(shí)體瘤抑瘤率為 41%高于環(huán)磷酰胺（20 mg/kg）的 37% 的抑制率。結(jié)論 EFP 對荷 S180 和 H22 小鼠腫瘤有較好的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】 地鱉蟲纖溶活性先導(dǎo)蛋白； S180 細(xì)胞；H22 細(xì)胞；抑瘤作用 The An titumour Effect of Eupolyphaga Fibri no lyric Prote in on S180 and H22 in vivo l.TU BAN 也 li, DT

3、XG Ifong, I T Zi wei (Faculty of Light and Chemical In dustry,Gua ngdo ng Uni versity of Tech no logy,Gua ngzhou 510006, China; Departme nt of Biologyjeya ng Collegejeya ng 522000, Chi na) Abstract : ObjectiveTo investigate the antitumor effect of Eupolyphaga fibri no lyric prote in on S180 and H22

4、in vivo. MethodsTumor-beari ng mouse model was built in vivo, and the experime nts were divided into positive con trol group (cyclophosphamide), n egative con trol group (sali ne), the high concen trati on drug group, the middle concen trati on drug of group, the low concen trati on of drug group .T

5、he in hibiti on rate aga inst ascites tumor was calculated by the tumer weights and the rate anainst solid tumor was calculated by the concen trati on of cells . ResultsEFP had significant inhibition against S180 ascites tumor, when the dose of drug was 2.90 mg/kg, the inhibition rate was 69.56%, hi

6、gher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (51.75%). EFP had preferably in hibiti on aga inst S180 solid tumors, whe n the dose of drug was 1.45 mg/kg, the in hibiti on rate was 37.48%, higher tha n that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (35.59%), and a certa in dose- depe ndent .Whe n the drug conc

7、en tratio n was 0.73 mg/kg, the H22 solid tumor in hibiti on rate was 41%, higher tha n that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (37%).Co nclusio nEFP has obvious an titumor effect o n S180 and H22 in vivo. Key words : Eupolyphaga fibri no lyric protein ； S180 cell line ； H22 cell line ； Antineoplastic a

8、ctivity 藥用地鱉在祖國醫(yī)學(xué)中是一味重要的活血化瘀藥材，具有破淤血、續(xù)筋 骨、消腫止痛等藥用功效1,臨床主要用于淤血阻滯，癥瘕積聚,跌撲損傷等 癥。中醫(yī)處方亦用其治療腫瘤，目前將其用于治療消化道腫瘤的較為普遍 2。本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行中藥抑瘤活性成分研究中，以地鱉蟲 Eupolyphaga sinen sis Walker 為材料，分離純化到一組纖溶活性蛋白（fibrin olytic protei ns from Eupolyphaga sinen sis, EFP ），并發(fā)現(xiàn)該活性蛋白對部分腫瘤 細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性作用3。本文在建立了 H22 和 S180 荷瘤小鼠的基礎(chǔ) 上，檢測了 E

9、FP 提取物對該荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用，旨在探討 EFP 的抑瘤作 用,為地鱉抗腫瘤活性有效成分的進(jìn)一步純化和作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 1 材料 1.1 藥物地鱉蛋白以韓雅莉等4方法制備，將凍存地鱉（-80C）置 4C解凍，稱重，按 1 : 1（V/V）與預(yù)冷 0.01 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.2）混和勻 漿，再按 1 ： 5加入該緩沖液， 靜置抽提 （4C，12 h ） ， 離心 （4C，8 000 r/min， 15 min ） ，棄沉淀，上清中加入適量硫酸銨，以鹽析法提取蛋白質(zhì)，收 集飽和度 35%-70%勺鹽析組分（蛋白），蒸餾水透析除鹽，過 DEAE 纖維素陰 離子柱，分段收

10、集洗脫蛋白組分，以纖溶平板檢測各管液體的纖溶活性，合并 具纖溶活性各管液體，真空冷凍干燥成粉末，置 -20C保存?zhèn)溆?。環(huán)磷酰胺 （CTX，山西普德藥業(yè)有限公司。 1.2 動物與細(xì)胞清潔級 KM 小鼠，體質(zhì)量（202） g,雌雄各半，由廣州 中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。小鼠肉瘤細(xì)胞株（S180），由廣東省第二中醫(yī) 院研究所提供；小鼠肝癌 H22,由廣州生物醫(yī)藥與健康研究所提供。 1.3 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基,北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；小 牛血清，Hyclone，新西蘭 PERBIO SCIENC 公司；胰蛋白酶，北京鼎國生物 技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，美國 AMR

11、ESCOO 司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺 （CTX，山西普德藥業(yè)有限公司。 2 方法 2.1 纖溶活性的測定參照文獻(xiàn)5的方法,制備纖維蛋白平板,在平板上 打孔（直徑 7.0 mm）,加入待測樣品，對照孔加 0.01 mol/L 20 卩 l 緩沖液，置 37C保溫至溶圈清晰可辨，約 24 h,考馬斯亮藍(lán) R250 染色后，脫色液脫色后 觀察，測量溶圈兩垂直直徑，以 UK 為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測地鱉纖溶活性蛋白的纖溶活 性。以考馬斯亮藍(lán)法和蒽酮法測定凍干蛋白中糖含量和蛋白含量。 2.2 S180 腹水瘤與實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)將凍存 S180 腫瘤細(xì)胞于 37E 1 min 內(nèi)復(fù) 蘇，1 000 r/min 離心 5 min，

12、去上清，以 RPMI1640 含 15%、牛血清培養(yǎng)液培 養(yǎng)細(xì)胞生長至對數(shù)期，1 000 r/min 離心 5min，適量生理鹽水稀釋瘤細(xì)胞懸液， 細(xì)胞數(shù)為 107 /ml,取 3 只正常小鼠，每鼠腹腔注入 0.2 ml 腹水瘤細(xì)胞懸液， 制備惡性腹水瘤小鼠模型。10d 后，選取生長良好的 S180 荷瘤小鼠（腹水型）, 無菌條件下抽取腹水，以生理鹽水 1 ： 1稀釋制成瘤細(xì)胞懸液，每鼠腹腔注入 0.2ml 使之形成腹水型荷瘤狀態(tài)；將另 40只小鼠,每鼠左側(cè)腋窩皮下接種 0.2 ml 瘤細(xì)胞懸液（約含瘤細(xì)胞 106）,使之形成惡性實(shí)體瘤荷瘤狀態(tài)，每日觀察記 錄。 接種翌日小鼠腹腔注射藥物，將

13、40 只 S180 腹水瘤小鼠隨機(jī)分 5 組（8 只/ 組），陽性對照組注射 20 mg/kg 環(huán)磷酰胺，陰性對照注射 0.2 ml 生理鹽水、 藥物高劑量組注射 1.45 mg/kg，中劑量組注射 0.725 mg/kg，低劑量組注射 0.363 mg/kg （EFP 藥物劑量均參照本室 EFP 治療 S180 荷瘤小鼠的最佳劑 量），均為 1 次/d，連續(xù) 8 d。同樣，接種實(shí)體瘤 24 h 后對小鼠進(jìn)行腹腔注射 藥物處理，將 40 只 S180 荷瘤小鼠隨機(jī)分 5 組（8 只/組），分組情況與注射藥 物均與腹水瘤小鼠相同，均為 1 次/d，連續(xù)處理 9 d。 2.3 H22 荷瘤小鼠模型

14、建立及藥物處理將凍存 H22 腫瘤細(xì)胞與上述相同 方法復(fù)蘇、培養(yǎng)、制備 H22 腹水瘤小鼠模型，抽取 H22 荷瘤小鼠（腹水型）腹水 制成瘤細(xì)胞懸液，取其 0.2 ml 注入無瘤小鼠右側(cè)腋窩下使之形成惡性實(shí)體瘤荷 瘤狀態(tài)。24 h 后，對其進(jìn)行腹腔注射藥物處理，將 40 只小鼠隨機(jī)分 5 組（每組 8 只），陽性對照組，每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺 20 mg/kg,陰性對照組小鼠腹 腔注射 0.2 ml 生理鹽水，藥物處理組藥物劑量均參照本室 EFP 治療 S180 荷瘤 小鼠的最佳劑量，藥物高劑量組每日注射 1.81 mg/kg,中劑量組每日注射 1.45 mg/kg,和低劑量組每日注射 0.

15、725 mg/kg，均為 1 次/d，連續(xù)處理 7 d。 對上述實(shí)驗(yàn)各組均于每次給藥后測量小鼠體質(zhì)量。 S180 腹水瘤小鼠于最后 一次給藥 24 h 后，抽取腹水，測定每只小鼠腹水體積和細(xì)胞濃度。 S180 與 H22 實(shí)體瘤小鼠，均于最后一次給藥后 24h 后取瘤塊和脾臟，稱重。比較各組脾系 數(shù)間差異；分析各組動物平均體重變化，依以下公式計(jì)算抑瘤率和器官系數(shù)。 抑瘤率（ ）=（對照組平均細(xì)胞濃度-給藥組平均細(xì)胞濃度）/對照組平均細(xì) 胞濃度X 100% 抑瘤率（% ）=（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重 X 100% 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析,組間

16、差異用 Excel進(jìn)行t 檢驗(yàn)，以a =0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，通過 SPSS 11.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì) 算結(jié)果。 2.5 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 2.5.1 含藥血清制備將 25 只小鼠分為陽性對照組、陰性對照組、藥物高 劑量組（2.90 mg/kg ）、中劑量組（1.45 mg/kg ）和低劑量組（0.73 mg/kg），各組均腹腔給藥 2 次/d，0.2 ml/次，連續(xù) 3 d。末次給藥前禁食 4 h,自由飲水，末次給藥后 2 h眼球取血，室溫靜置 2 h，分離血清，56C 30 min 滅活，分別以 DME 和 1640 不完全培養(yǎng)基稀釋至 20%血清，220nm 濾膜過濾 除菌，-20C冰箱保存

17、備用。 2.5.2 MTT 檢測小鼠肝癌 H22 用含 10%臺牛血清、100 U/ ml 青霉素和 100 U/ ml 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。置 37C,5% CO2 飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 呈對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.5.3 MTT 法檢測含藥血清及 EFP 對細(xì)胞增殖的反應(yīng)取對數(shù)生長的 H22 細(xì)胞， 以 1 X 106 ml -1 X 50 卩 1/孔的接種量接種于 96 孔培養(yǎng)板,分別加入濃度 為 20%勺含 EFP 血清（0.73，1.45，2.9 mg/kg）、環(huán)磷酰胺含藥血清（20 mg/kg），生理鹽水含藥血清各 50 卩 L;另一組加入不同濃度的 EFP （1

18、, 0.5， 0.2， 0.1， 0.05， 0 mg/ml）和陽性對照順鉑（50 mg/ml ）各 50 卩 l，各有 5 個 平行孔，同時設(shè)調(diào)零孔（培養(yǎng)基、 MTT 二甲基亞砜），繼續(xù)培養(yǎng) 44 h，力卩 PBS 配置除菌的 MTT （5 mg/ml） ， 10 卩 l /孔， 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h， 離心棄上清， 加入 DMSO 100卩 l /孔，輕振混勻，10 min 后酶標(biāo)儀測定（波長 490 nm 和 630 nm） A 值。作組間 t 檢驗(yàn)，依 A 值按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率： 抑制率（）=（對照組 A 值-含藥血清組 A 值”空白血清組 A 值X 100 3 結(jié)果 3

19、.1 EFP 分離純化與成分測定地鱉經(jīng)勻漿、鹽析和透析得到 EFP 粗提 物，將其過 DEAE-52 離子交換纖維素離子交換柱層析分離，經(jīng) 1 mol/L NaCI 梯 度洗脫，洗脫液經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，出現(xiàn)了 2 個蛋白峰，其中峰 1 蛋白含 量極低，峰 2 蛋白含量較高。因而，收集峰 2 樣品。峰 2 蛋白經(jīng) SDS-PAG 檢 測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白計(jì)算 EFP 的 3 個蛋白亞基 EFP1 EFP2 EFP3 相對分子質(zhì)量 分別為 74.9KD, 71.5KD，65.2KD。 參照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線測得凍干蛋白的纖溶活力為 20 U/mg。經(jīng)蒽酮法和考 馬斯亮藍(lán)法測定地鱉纖溶蛋白凍干粉中糖含量

20、為 82.8%,蛋白質(zhì)含量為 17.2%。 3.2 EFP 對小鼠 S180 腹水瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高、中兩個 EFP 劑 量組和環(huán)磷酰胺均能顯著抑制 S180 腹水的生成，減少瘤細(xì)胞數(shù)量，高劑量 EFP 抑瘤率達(dá) 69.56%;中劑量 EFP 抑瘤率為 30.76%,小鼠的生長狀態(tài)良好，而低劑 量 EFP 抑瘤效果很差，抑瘤率僅為 3.98%。結(jié)果見表 1。與生理鹽水組相比 3 個 EFP 處理組瘤細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，其中，高劑量組最為顯著，中劑量組次 之，低劑量組與環(huán)磷酰胺組相似。表明 EFP 對 S180 腹水瘤抑制效果明顯。表 1 EFP 對 S180 腹水瘤的抑制作用（略） 3

21、.3 EFP 對小鼠 S180 H22 實(shí)體瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、中、 低 3 個 EFP 劑量組和環(huán)磷酰胺均能抑制 S180 實(shí)體瘤的生長，高劑量 EFP 抑瘤率 為37.48%,中劑量 EFP 抑瘤率為 34.37%,低劑量 EFP 抑瘤率為 25.77%,環(huán)磷 酰胺抑瘤率35.59%。結(jié)果見表 2,但該組小鼠體質(zhì)量和脾重均最小，生理鹽水 組其次，而 EFP 3個藥物組體質(zhì)量和脾增重最高，表明 EFP 毒性較低。結(jié)果見 表 2。表 2 EFP 對 S180實(shí)體瘤的抑制作用（略） EFP 對 H22 實(shí)體瘤作用結(jié)果見表 3。高，中，低 3 個劑量結(jié)果來看，低劑量 組的抑制率最高，達(dá)

22、41%中劑量組抑瘤率為 36%與環(huán)磷酰胺抑瘤率 37%相 似，高劑量抑瘤效果反而較差，抑瘤率僅為 24%環(huán)磷酰胺組小鼠體重和脾重 最小，生理鹽水組其次，藥物組最高。表 3 EFP 對 H22 實(shí)體瘤的抑制作用 （略） 3.4 EFP 含藥血清及 EFP 對細(xì)胞增殖的反應(yīng)不同濃度的 EFP 含藥血清和 EFP分別作用于 H22 細(xì)胞株，于 48 h 采用 MTT 法檢測各組血清對 H22 細(xì)胞株增 殖的抑制率（見表 45）。結(jié)果表明，兩組 EFP 含藥血清組對 H22 細(xì)胞的增殖 均有抑制作用，抑制作用呈一定的量效和時效關(guān)系，即隨著含藥血清濃度的增 加，抑制率逐漸增加；而各組 EFP 對 H22

23、 細(xì)胞的增殖則沒有抑制作用，反而對 其具有明顯促進(jìn)作用，說明 EFP 沒有細(xì)胞毒性。表 4 EFP 小鼠含藥血清對 H22 細(xì)胞抑制作用 （10%，表 5 EFP 對 H22 細(xì)胞抑制作用（略）。 4 討論 目前臨床抗癌藥物主要為化療劑，其對腫瘤細(xì)胞有直接抑制和殺傷作用， 但是，傳統(tǒng)的化療主要著眼于對癌細(xì)胞的殺傷，藥物存在難以避免的毒副作 用，如化療藥物對正常分裂細(xì)胞毒性很強(qiáng)，極易造成患者白細(xì)胞與血小板減少 以及貧血等骨髓抑制癥狀，成為制約其進(jìn)一步發(fā)展的障礙，再者，腫瘤細(xì)胞對 化療劑易產(chǎn)生抗藥性，也是導(dǎo)致抗癌治療失敗的主要原因之一。近年來 ，研究發(fā) 現(xiàn)中草藥無論在抑制腫瘤細(xì)胞，還是在腫瘤的病后

24、調(diào)理、改善體征、減輕放、化 療不良反應(yīng)等方面均發(fā)揮了重要作用6。臨床實(shí)踐證明一些復(fù)方的覆蓋面較 廣，但是作用較弱；而一些單味中藥定向作用于某些腫瘤，且抑瘤效果顯著 70 地鱉為我國傳統(tǒng)中藥，具有顯著活血化瘀與抑瘤功效，但其纖溶作用與抑癌 作用有何內(nèi)在相互聯(lián)系，目前尚未見有關(guān)報道，本實(shí)驗(yàn)從地鱉中分離純化得到的 纖溶活性蛋白（EFP），前期實(shí)驗(yàn)已證明其具顯著抑制血管生成的作用8。通 過本文實(shí)驗(yàn)證明,EFP 無明顯細(xì)胞毒作用，而對荷瘤小鼠卻存在顯著的抑瘤效果， 在 EFP 濃度 2.90 mg kg-1 對 S180 腹水瘤、2.18 mg kg-1 對 H22 肝癌和 0.731.45 mg kg

25、-1 對S180 實(shí)體瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯抑制作用 ， 在 S180 實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，高濃度 EFP 對小鼠的抑瘤率與環(huán)磷酰胺相似，在 H22 實(shí) 體瘤實(shí)驗(yàn)中，在低濃度（0.73 mg kg-1 ）下，抑瘤率最高，通過脾重測定，可 知在高濃度下小鼠脾重最大，說明，地鱉蛋白對 S180 和 H22 腫瘤細(xì)胞均具一定 的抑制作用，且抑制效果和環(huán)磷酰胺相差無幾。實(shí)驗(yàn)表明 EFP 對 S180 等細(xì)胞無 殺傷效果，說明 EFP 抗腫瘤作用不是通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞，我們認(rèn)為 EFP 對 小鼠移植瘤的生長抑制作用很可能與其纖溶酶活性有關(guān)，與纖溶酶抑制腫瘤血 管生成關(guān)系密切。 許多疾病的病理過程都涉及

26、到新生血管生成，包括腫瘤生長等疾病。早在 1971年 Folkman 就提出了 “腫瘤生長依賴血管生成”的觀點(diǎn)，并提出了 “抑瘤 與抗血管生成的概念”。近年來大量研究已證明腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā) 展中起到至關(guān)重要的作用，腫瘤組織既可通過腫瘤血管從宿主獲取營養(yǎng)和氧 氣，又可通過腫瘤血管向機(jī)體的其他部位輸送轉(zhuǎn)移細(xì)胞，繼續(xù)生長和誘導(dǎo)血管 形成，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移9。中醫(yī)也認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于正氣不足，臟腑功能 失調(diào)，氣滯、血淤、痰凝、毒聚而形成?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，癌癥患者血液(漿) 多呈高粘高凝狀態(tài)，這不僅阻礙藥物對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，而且有助于 癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、定居和增殖。活血化淤中藥抑癌理論提出，活

27、血化淤中藥通過 改善患者血液黏滯狀態(tài)，改善血液循環(huán)，增加局部血流量，改善局部缺氧，而抑制 瘤栓的形成，使腫瘤細(xì)胞不能在血循環(huán)中存活10，這樣對血瘤細(xì)胞起到了 直接或間接的抑殺作用，從而達(dá)到防治惡性腫瘤血行轉(zhuǎn)移的目的，同時也使抗 癌藥物及其它成分易于深入瘤體而充分發(fā)揮作用。 有關(guān)研究表明，活血化淤藥物影響腫瘤生長及轉(zhuǎn)移機(jī)制與抑制新生血管生 成關(guān)系密切，有關(guān)研究證明纖溶活性蛋白酶及其活性產(chǎn)物，可以大量降解腫瘤細(xì) 胞外基質(zhì),使腫瘤細(xì)胞喪失生存的環(huán)境基礎(chǔ)，而且導(dǎo)致腫瘤組織自身的降解，反而 不利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移11，纖溶活性物質(zhì)具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而阻 礙腫瘤血管的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移灶建立的作用?；谏鲜隼碚?，我們認(rèn)為 EFP 的 抑瘤效應(yīng)可能與其對腫瘤新生血管的抑制作用有關(guān)。為此，我們認(rèn)為 EFP 很可 能是地鱉中的一種有效、低毒的抗腫瘤成分，其主要有望在抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn) 移方面發(fā)揮效應(yīng)，是一個具有應(yīng)用前景的抗