識別和鑒定稻瘟病菌在植物中表達(dá)的誘發(fā)水稻細(xì)胞死亡的分泌效應(yīng)蛋白

1、識別和鑒定稻瘟菌在植物中表達(dá)的誘發(fā)水稻細(xì)胞死亡的分泌效應(yīng)蛋白Songbiao Chen,1,2,3 Pattavipha Songkumarn,2 R. C. Venu,2 Malali Gowda,2 Maria Bellizzi,2 Jinnan Hu,2Wende Liu,1 Daniel Ebbole,4 Blake Meyers,5 Thomas Mitchell,2 and Guo-Liang Wang1,21. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京，100193;2. 美國俄亥俄州立大學(xué)，植物病理學(xué)系，哥倫布，OH 432103. 中國福建省農(nóng)業(yè)科

2、學(xué)院研究院，生物技術(shù)研究所，福州，3500034. 美國德州農(nóng)工大學(xué)，植物病理學(xué)和微生物學(xué)系，學(xué)院站，TX 790165. 美國特拉華大學(xué)，特拉華生物技術(shù)研究所，新澤西州紐瓦克市，DE摘要 水稻和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)之間的互作涉及到識別細(xì)胞的組成成分及兩者之間復(fù)雜的分子信號交流。這些相互作用在水稻細(xì)胞中是怎樣發(fā)生仍然十分難懂。我們采用基因表達(dá)的高通量序列分析技術(shù)，進(jìn)行大規(guī)模平行信號測序，并通過合成測序來檢查受感染的水稻葉片的轉(zhuǎn)錄組概況?？偣灿?413個在植物中表達(dá)的真菌基因，其中包括851個基因編碼的預(yù)測效應(yīng)蛋白，被確定。我們使用了原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)系統(tǒng)來評估42個

3、預(yù)測效應(yīng)蛋白的誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的能力。異位表達(dá)測定確認(rèn)存在五個新型的效應(yīng)子，當(dāng)它們擁有用于分泌到胞外空間的信號肽時可引起宿主細(xì)胞的死亡。其中四個在本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)中能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。盡管五個效應(yīng)都在其序列中表現(xiàn)出高度多樣化，但是誘導(dǎo)每個細(xì)胞死亡的生理基礎(chǔ)是相似的。這項研究表明，我們的綜合基因組方法能夠有效的識別在稻瘟病菌在植物中表達(dá)的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)效應(yīng)，這種效應(yīng)可能起著重要的作用，促進(jìn)感染過程中定植與真菌生長。關(guān)鍵詞 分類號 Identification and Characterization of In plantaExpressed Secreted

4、 Effector Proteinsfrom Magnaporthe oryzae That Induce Cell Death in Rice. Songbiao Chen,1,2,3 Pattavipha Songkumarn,2 R. C. Venu,2 Malali Gowda,2 Maria Bellizzi,2 Jinnan Hu,2Wende Liu,1 Daniel Ebbole,4 Blake Meyers,5 Thomas Mitchell,2 and Guo-Liang Wang1,2（1.State Laboratory for Biology of Plant Dis

5、eases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Department of Plant Pathology, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, U.S.A.; 3.Biotechnology Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou,Fujian35

6、0003, China;4.Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University, College Station,TX 79016, U.S.A.; 5. Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware, Newark, DE, U.S.A. ）Interactions between rice and Magnaporthe oryzae involve the recognition of cellular components a

7、nd the exchange of complex molecular signals from both partners. How these interactions occur in rice cells is still elusive. We employed robust-long serial analysis of gene expression, massively parallel signature sequencing, and sequencing by synthesis to examine transcriptome profiles of infected

8、 rice leaves. A total of 6,413 in plantaexpressed fungal genes, including 851 genes encoding predicted effector proteins, were identified. We used a protoplast transient expression system to assess 42 of the predicted effector proteins for the ability to induce plant cell death. Ectopic expression a

9、ssays identified five novel effectors that induced host cell death only when they contained the signal peptide for secretion to the extracellular space. Four of them induced cell death in Nicotiana benthamiana. Although the five effectors are highly diverse in their sequences, the physiological basi

10、s of cell death induced by each was similar. This study demonstrates that our integrative genomic approach is effective for the identification of in plantaexpressed cell deathinducing effectors from M. oryzae that may play an important role facilitating colonization and fungal growth during infectio

11、n.在自然界中，植物與其病原的協(xié)同進(jìn)化導(dǎo)致雙方都演變出一組策略用來攻擊和防御。植物病原體可首先使用細(xì)胞壁降解酶以消化細(xì)胞壁的表面層，以便于侵入。成功的致病菌能夠分泌多種細(xì)胞外分子以破壞宿主的防御機(jī)制。這些細(xì)胞外分子包括質(zhì)外體效應(yīng)物，如毒力因子，毒素和充當(dāng)關(guān)鍵毒力因子抑制宿主防御的降解酶（Hogenhout等，2009年）。另一方面，植物進(jìn)化出獨特的機(jī)制來保衛(wèi)自己，例如使用物理屏障，抗微生物化合物，和先天免疫系統(tǒng)。植物免疫系統(tǒng)包含兩重(Chisholm 等. 2006; Jones 和 Dangl 2006)。植物的第一重免疫的發(fā)起是通過宿主與膜相關(guān)的構(gòu)型識別受體（PRR）來感知病原體或微生物相

12、關(guān)的分子模式(PAMPs 或 MAMPs)，這會引起植物的基礎(chǔ)防御反應(yīng)，稱為PAMP觸發(fā)免疫（Zhang 和 Zhou 2010）。第二重免疫的發(fā)起是通過同源抗性蛋白識別出所述無毒效應(yīng)物，并快速激活超敏反應(yīng)（HR），這會導(dǎo)致強烈的小種?；共⌒苑Q為效應(yīng)子觸發(fā)的免疫。在過去十年中，大量的研究都指向許多PAMP及其無毒效應(yīng)物在植物病原菌和PRR和R蛋白在植物中的識別(Dodds等.2009)。其中大部分良好表征的效應(yīng)分子是來自于采用的III型分泌系統(tǒng)，直接遞送效應(yīng)物引入宿主細(xì)胞的原核細(xì)菌中。與細(xì)菌不同，真菌和卵菌綱致病菌往往通過真核生物分泌途徑（Panstruga 和 Dodds 2009）向細(xì)胞

13、外環(huán)境分泌效應(yīng)蛋白。在基因組測序技術(shù)的最新發(fā)展使得卵菌綱致病菌中眾多的效應(yīng)物迅速被發(fā)現(xiàn)，并在他們的結(jié)構(gòu)和功能方面提供了豐富的信息。例如，大豆疫霉根腐病和P. ramorum基因組的分析導(dǎo)致保守結(jié)構(gòu)域RXLR和dEER的發(fā)現(xiàn)(Tyler 等. 2006)，這對于將卵菌綱效應(yīng)物的易位到植物細(xì)胞中是必要的（Dou 等. 2008a; Whisson 等. 2007）。RXLR蛋白大家族的預(yù)測，這為卵菌綱效應(yīng)的活動功能研究提供了豐富備選。然而，由真菌導(dǎo)出的分泌蛋白似乎缺乏這種保守結(jié)構(gòu)域，并我們對于其功能知之甚少。這種半活體寄生真菌稻瘟病菌是水稻稻瘟病的病原，是最具破壞性的疾病，影響全世界水稻的生產(chǎn)（D

14、ean 等. 2005; Ebbole 2007;Talbot 2003）。在稻瘟病菌中，有更多的基因（多達(dá)1,306），這種鑒定的分泌蛋白的編碼序列已經(jīng)從一個實驗室菌株的基因組中被預(yù)測，70-15(Dean 等. 2005; Yoshida等. 2009)。七個分泌性蛋白即PWL1, PWL2 (Kang 等. 1995; Sweigard 等. 1995), AvrPita(Orbach等2000), Avr-Pia, Avr-Pii, Avr-Pik/km/kp(Yoshida等. 2009), and AvrPiz-t (Li等. 2009)已被確認(rèn)為無毒（AVR）的蛋白質(zhì)，由相應(yīng)的抗

15、性基因產(chǎn)物推測認(rèn)可。此外，一些分泌性蛋白對于致病性來說是必需的，即MPG1 (Talbot等1993), EMP1 (Ahn等. 2004), MHP1(Kim等. 2005), MSP1 (Jeong等. 2007), MC69 (Saitoh等. 2012), and Slp1 (Mentlak等. 2012), 和四個活體營養(yǎng)相關(guān)的分泌性蛋白BAS1 到BAS4 (Mosquera等.2009)也被鑒定。然而，大多數(shù)稻瘟病菌的分泌性蛋白在致病性的功能沒有相關(guān)的實驗進(jìn)行測試。 為了識別稻瘟病菌的基因編碼預(yù)測重度感病的葉片組織中分泌蛋白的表達(dá)，我們開發(fā)了一個綜合的基因組表達(dá)圖譜方法，包括高通

16、量基因分析技術(shù) (RL-SAGE) (Gowda 等. 2004)，大規(guī)模平行信號測序(MPSS) (Brenner等. 2000;以及合成法測序(SBS)(German等l. 2008; Venu等. 2011a)。受感染的組織是從6個時間點收集，以便在后期感染階段真菌轉(zhuǎn)錄在植物中的表達(dá)可以包含在庫中。我們使用了原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析，以確定稻瘟菌在植物中表達(dá)的分泌的蛋白誘導(dǎo)水稻的細(xì)胞死亡。在42個蛋白質(zhì)測試之中，5個誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的蛋白是功能特性蛋白。這里所描述的綜合方法提供了用于真菌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白功能鑒定的一種有效的策略，這涉及植物和真菌的相互作用。1結(jié)果 1.1 重度感病的水稻葉片基因表

17、達(dá)譜分析。為獲得稻瘟菌與水稻親和與不親和的相互作用的過程中更為全面的基因表達(dá)譜，我們構(gòu)建1個RL-SAGE，11個 MPSS，和7個SBS庫進(jìn)行深度測序。RL-SAGE庫是在水稻葉片接種親和的隔離種群Che86061，在接種后96個小時（hpi）產(chǎn)生的 (圖.1A)。一共從庫中獲得了18154個顯著特征。其中，有3105（17.1）個顯著特征和12263（67.5）個顯著特征分別匹配于稻瘟病菌和稻的基因組。不匹配的特征可能是由于測序錯誤或分布在兩個基因組測序的間隙。只有14個特征與稻瘟病菌和稻的基因組都匹配，這表示大部分特征都是基因組專用的。我們確定了3091個特征明確地匹配稻瘟病菌的基因組，

18、它們與3000個之前注明的稻瘟病菌的基因相對應(yīng)。11個 MPSS庫從野生型日本晴水稻或轉(zhuǎn)基因日本晴水稻攜帶的抗稻瘟病基因Pi9 (Qu 等. 2006)的葉片中產(chǎn)生的，其接種稻瘟菌在親和(3, 6, 12, 24, 48,和 96 hpi)或不親和(3, 6, 12, 24,和 48 hpi)的相互作用中找出KJ201（圖1A）。正如預(yù)期的那樣，在不親和的相互作用相比，更多個特征碼匹配到稻瘟病基因組中的親和相互作用。從五個不親和的相互作用MPSS庫中共獲得了57671個顯著特征。其中，有724（1.2）個顯著特征和38024（65.9）個顯著特征分別唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因組。從六個親和

19、的相互作用庫，總共獲得了63132個顯著特征。其中，有2545（4）個顯著特征和41784（66.1）個顯著特征分別唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因組?？偣灿?216個注明的稻瘟病菌基因被同時從親和和不親和的MPSS庫中鑒定。相同的葉片組織用于產(chǎn)生MPSS庫（親和相互作用在6，12，24，和96 hpi,并在不親和的相互作用6，12，和24 hpi）和七個SBS庫的構(gòu)建（圖1A）。從三個不親和的相互作用的SBS庫中一共獲得了65299個顯著特征碼。其中，3492（5.3）個顯著特征和49706（76.1）個顯著特征分別專門匹配于稻瘟病菌的基因組和水稻基因組。從四個親和相互作用SBS庫中一共獲得了

20、68825個顯著特征。特征相匹配的的稻瘟病菌基因組有5283（7.7）個，且那些匹配水稻基因組共有50756（73.7）個。來自親和和不親和的相互作用的SBS特征一起確定了4,781個已注明的稻瘟病菌的基因。總而言之，在三種表達(dá)譜技術(shù)的作用下，一共有6413個稻瘟病菌在感染過程表達(dá)的已注明的基因被確定（圖1A）。1.2 鑒定基因編碼1.2.1 假定分泌蛋白在感染過程中的表達(dá)眾所周知分泌性蛋白在真菌與植物的相互作用中發(fā)揮著重要的作用(Rep 2005; Zhang and Zhou 2010)。因此，我們重點放在在上述轉(zhuǎn)錄庫中確定的分泌蛋白基因的分析。為了從在植物中表達(dá)的基因集合中獲得最確切的分

21、泌蛋白基因序列，我們用了兩個稻瘟病菌分泌蛋白的數(shù)據(jù)集，一個是Dean和同事（2005）（簡稱數(shù)據(jù)集I），另一個由Choi和同事（2010）（簡稱為數(shù)據(jù)集），參考為人工標(biāo)注。共有851個截然不同的分泌蛋白基因從兩個數(shù)據(jù)集中被確定（圖1A，補充表S1）。在大約有85.7（264/308）個在數(shù)據(jù)集I發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白基因也存在于數(shù)據(jù)集II中（圖1E）。在RL-SAGE, MPSS, 和SBS這三個庫中，用在相同的時間點從稻葉接種親和分離菌為材料（96 hpi）（RL-SAGE-96h，MPSS-96h，SBS-96 h），與兩個數(shù)據(jù)集I和II以及其他兩個庫相比，超過兩倍以上分泌蛋白基因從SBS-96h

22、庫中被確定（圖1C和D）。圖.1 稻瘟病菌與水稻互作過程中的基因表達(dá)分析。A, 通過高通量基因分析技術(shù) (RL-SAGE)，大規(guī)模平行信號測序(MPSS)以及合成法測序(SBS)進(jìn)行基因表達(dá)譜的匯總統(tǒng)計，并確定在植物中表達(dá)的稻瘟病菌的基因編碼的推定分泌蛋白。B, 分別從RL-SAGE-96小時， MPSS-96小時，和SBS-96小時庫中鑒定出的所有稻瘟病菌基因的聚類分析。C, 從數(shù)據(jù)集I(Dean 等. 2005)中回收的假定的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚類分析。分別在RL-SAGE-96小時， MPSS-96小時，和SBS-96小時。D, 從數(shù)據(jù)集II (Dean 等. 2005) 中回收的假定

23、的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚類分析。分別在RL-SAGE-96小時， MPSS-96小時，和SBS-96小時。E, 分別從數(shù)據(jù)集I和數(shù)據(jù)集II中回收的所有時間點庫中的假定稻瘟菌分泌蛋白基因的聚類分析。為了對在植物中表達(dá)的分泌蛋白在水稻和稻瘟菌相互作用中的功能進(jìn)行更深入的了解，我們進(jìn)行了以基因本體（GO）為基礎(chǔ)的分類。以這種分類方法分析顯示，大多數(shù)在植物中表達(dá)的分泌蛋白與代謝過程有關(guān)，接著是發(fā)育過程，細(xì)胞代謝過程，和多細(xì)胞有機(jī)體處理（圖2A）。對于分子功能，大多數(shù)在植物中表達(dá)的分泌蛋白與催化活性和結(jié)合相關(guān)（圖2B）。圖2.基因本體論（GO）標(biāo)注在植物中表達(dá)的稻瘟病菌的假定分泌蛋白。 A，基于生物學(xué)過

24、程分類。B，基于分子功能分類。1.3 瞬時表達(dá)分析確定了五個稻瘟菌的質(zhì)外體效應(yīng)能水稻細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。宿主細(xì)胞死亡是在植物-病原體相互作用中的一種普遍存在的特征。為了確定稻瘟菌分泌的蛋白質(zhì)參與了宿主細(xì)胞死亡，我們使用我們建立的方法，進(jìn)行了對稻瘟菌分泌的蛋白質(zhì)在水稻原生質(zhì)瞬時表達(dá)（Chen等，2006）。在試驗中，細(xì)胞的死亡被監(jiān)控通過感染-葡萄糖醛酸酶基因在水稻原生質(zhì)中減少的表達(dá)水平來表示(圖.3A) (Dou等. 2008b; Jia等. 2000; Mindrinos等. 1994; Yoshida等. 2009).。為了瞬時表達(dá)檢測，共有42個分泌蛋白基因被克?。ㄑa充表S2）。對于每一個

25、選擇的基因，都構(gòu)建了兩種版本基因轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，一種含全長的開放讀碼框(ORF)（稱為FL），另一個則包含截斷的編碼區(qū)，沒有信號肽的序列，但具有工程改造ATG起始密碼子（稱為NS）。瞬時測定法顯示，在FL版本的42個分泌蛋白基因中有5個能夠在水稻原生質(zhì)表達(dá)時，引起的一個顯著降低GUS活性（圖3B），這表明這些5種蛋白在水稻細(xì)胞中可誘導(dǎo)水稻細(xì)胞的死亡。另一方面，NS版本的42個檢測基因瞬時表達(dá)沒有導(dǎo)致細(xì)胞活力的任何降低。因此，我們所指的5個分泌蛋白，,MGG_03356, MGG_05531, MGG_07986, MGG_ 08409和, MGG_10234,分別像MoCDIP1 到MoCDIP5

26、（稻瘟病菌的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白）。我們進(jìn)一步用含有5 個MoCDIP基因的雙元載體進(jìn)行水稻愈傷組織的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，看它是否能夠獲得穩(wěn)定的的轉(zhuǎn)基因株系并對這些基因的表達(dá)進(jìn)行功能分析。大約有600個愈傷組織用于每個結(jié)構(gòu)的改造。作為預(yù)期，無抗性的轉(zhuǎn)基因愈傷組織在用FL-MoCDIP1, FL-MoCDIP2, FLMoCDIP3, or FL-MoCDIP4改造后逐一被獲得，（數(shù)據(jù)未顯示）。與此相反，約有50至80個轉(zhuǎn)基因愈傷組織在用NS-MoCDIP1，NS-MoCDIP2，NS-MoCDIP3，或NS-MoCDIP4轉(zhuǎn)化后被獲得，在我們的實驗室，具有類似于正常轉(zhuǎn)化效率的效率（約8至15為其它結(jié)構(gòu)

27、）。有趣的是，在第一次用FLMoCDIP5轉(zhuǎn)化時產(chǎn)生了約40個正常效率的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，無細(xì)胞死亡的表現(xiàn)型。然而，當(dāng)它們在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后或更長的時間，所述轉(zhuǎn)基因愈傷組織表現(xiàn)FL-MoCDIP5開始顯示出細(xì)胞死亡的表現(xiàn)型（圖3C）。于其他NSMoCDIP類似，在無細(xì)胞死亡中觀察到轉(zhuǎn)基因愈傷組織表達(dá)NS-MoCDIP5（圖3C）。這些結(jié)果，與在水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)測定一致，證實了5個 MoCDIP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡時，全長蛋白在水稻細(xì)胞中表達(dá)。為了在功能上研究五個已鑒定的MoCDI的分泌功能，我們從先前公開的方法中選擇酵母分泌測定法（Lee等l. 2006）。FL-MoCDIP和NS-MoCD

28、IP的序列都被融合到缺少其自己的信號肽序列的酵母轉(zhuǎn)化酶基因（SUC2）的N-末端的框架中。該融合構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到酵母菌株DBY2445中(Lee等. 2006)，一個缺少蔗糖轉(zhuǎn)化酶的突變體，并將轉(zhuǎn)化的酵母直接用蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，測定了分泌。正如我們所預(yù)料的，用構(gòu)建體，包括NS-MoCDIP-SUC2融合的酵母菌株在蔗糖培養(yǎng)基（補充圖.S1）上不生長，原因是缺乏用來催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖作為碳源的轉(zhuǎn)化酶的分泌。與此相反，所有五個含有FL-MoCDIP-SUC2融合的構(gòu)建體使酵母突變株能夠生長蔗糖培養(yǎng)基上，確認(rèn)了5個 MoCDIP的預(yù)測的信號肽的功能在于引導(dǎo)轉(zhuǎn)化酶融合體的分泌途徑。這些結(jié)果，再加上

29、其產(chǎn)物表明該信號肽需要MoCDIP在水稻細(xì)胞中表達(dá)以誘導(dǎo)稻的細(xì)胞死亡，顯示這些蛋白最有可能作用于植物質(zhì)外體空間。然而，這些蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的確切的目標(biāo)部位還有待進(jìn)一步研究。圖3. 鑒定五個在水稻細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的植物中表達(dá)的假定分泌蛋白。A, 水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析的方法鑒定稻瘟病菌的分泌蛋白能誘導(dǎo)水稻細(xì)胞死亡的示意圖。稻原生質(zhì)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染用b-葡糖醛酸酶（GUS）構(gòu)建體（Promoter-GUS-Tnos）和其他攜帶稻瘟病菌分泌蛋白的基因的構(gòu)建體（Promoter-M.o gene-Tnos）報道。水稻細(xì)胞活力檢測基于監(jiān)視降低的GUS表達(dá)水平。MoCDIP=稻瘟病菌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白。B,

30、 五個全長的MoCDIP在水稻原生質(zhì)異位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。CK=用GUS標(biāo)記轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體樣品和一個空載體對照; 1 to 5 =原生質(zhì)體樣品的轉(zhuǎn)染用GUS標(biāo)記，而另一個構(gòu)建體分別攜帶MoCDIP1到MoCDIP5。數(shù)據(jù)條顯示出的平均值來自在一個實驗中的三個一式三份的樣品。每個實驗至少重復(fù)3次，具有相似的結(jié)果。C, 一個完整的而不是截斷非信號肽的MoCDIP5的異位表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織細(xì)胞的死亡。CK =空載體轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織；NS-MoCDIP5 =用攜帶截斷非信號肽構(gòu)建的MoCDIP5轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織；FL-MoCDIP5 =攜帶切去頂端的全長MoCDIP5轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織

31、。照片拍攝在約20天的時候，此時新獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織保持在選擇培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化實驗重復(fù)兩次，觀察到類似結(jié)果。D, 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）對NS-MoCDIP5 或 FL-MoCDIP5在轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織中表達(dá)的分析。CK=與空載體轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織對照的RT-PCR結(jié)果; 1 to 3 =來自三個獨立的轉(zhuǎn)基因愈傷組織系的RT-PCR結(jié)果。1.4 MoCDIP基因在受感染的葉子和附著胞中表達(dá)。通過實驗證實MoCDIP基因在感染的葉子上表達(dá)，并確定了它在附著胞和菌絲體上的表達(dá)模式，我們從接種分離出來的烈性敏感菌KJ201的日本晴水稻葉片中提取的RNA以及從稻瘟病菌附著胞和菌絲體中提

32、取RNA，進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。由于在早期感染階段，真菌團(tuán)在被感染的葉子中的比例很低， 72 hpi以前未檢測到Mo28S轉(zhuǎn)錄。于Mo28S轉(zhuǎn)錄相似，MoCDIP2和MoCDIP4轉(zhuǎn)錄物在72 hpi時從被感染的水稻葉片中檢測出來，在96 hpi之前從感染水稻葉子中未檢測到MoCDIP1，MoCDIP3，和MoCDIP5的轉(zhuǎn)錄（圖4）。這一結(jié)果證實了這5個MoCDIP在感染階段表達(dá)。我們對在MoCDIP1和MoCDIP2的轉(zhuǎn)錄物在附著胞和菌絲體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與之前相比擁有相對較高的表達(dá)，MoCDIP3，MoCDIP4，和MoCDIP5的轉(zhuǎn)錄物只在附著胞中

33、被檢測到（圖4）。圖4. 五個稻瘟菌的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白基因（MoCDIP）在植物中的表達(dá)模式?？俁NA樣品是從接種后0，24，48，72，96，或120小時的感染的水稻葉片中提取的，使用特異性引物從外生稻瘟病菌附著胞（A）和菌絲體（M）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1.5 MoCDIP在非寄主植物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。許多病原菌的效應(yīng)分子在非寄主植物細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(Rep 2005)。為了確定的5個MoCDIP在非寄主植物細(xì)胞中是否影響細(xì)胞的死亡，我們在玉米（玉蜀黍），擬南芥和本塞母氏煙草這三個模式植物的原生質(zhì)體中進(jìn)行MoCDIP基因的瞬時表達(dá)檢測。與在水稻原生質(zhì)中觀察到的結(jié)果一致，5

34、個FLMoCDIP但不是NS-MoCDIP在玉米原生質(zhì)中的瞬時表達(dá)體引起的細(xì)胞活力顯著降低（圖5A）。而對于在雙子葉植物擬南芥和本塞母氏煙草的原生質(zhì)體中FL-MoCDIP基因的瞬時表達(dá)測定，結(jié)果顯示除了FLMoCDIP2，都造成顯著的細(xì)胞活性降低。與在水稻細(xì)胞中的結(jié)果相似，所有5個NS-MoCDIP基因在任一種擬南芥或本塞姆氏煙草的原生質(zhì)體中的表達(dá)都沒有降低細(xì)胞活力（圖5B和C）。我們還通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)的方法測試了在本塞姆氏葉片的5個MoCDIP基因。含有空質(zhì)粒pGD的根瘤農(nóng)桿菌和一個記為WtsE的pGD重組體分別作為陰性和陽性對照。WtsE是一種細(xì)菌性的第三類效應(yīng)，在寄主和非寄主植物

35、中都能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(Ham 等. 2008)。與原生質(zhì)體檢測的結(jié)果相一致，農(nóng)桿菌菌株滲入的本塞姆氏煙草的葉片顯示FL-MoCDIP1，F(xiàn)LMoCDIP3，F(xiàn)L-MoCDIP4和 FL-MoCDIP5致使細(xì)胞死亡（圖5D）。與此相反，在FL-MoCDIP2菌株的滲入?yún)^(qū)，以及攜帶NS-MoCDIP構(gòu)建體的菌株的滲入?yún)^(qū)，并沒有導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我們進(jìn)行了RT-PCR分析來檢查的MoCDIP基因瞬時表達(dá)，結(jié)果表明， FL-MoCDIP和NS-MoCDIP這兩種基因在本塞姆氏煙草葉的滲入?yún)^(qū)表達(dá)水平相似（圖5E）。這些結(jié)果證實MoCDIP1，MoCDIP3，MoCDIP4，和MoCDIP5，但不是MoCDIP

36、2誘導(dǎo)單子葉和雙子葉植物這兩種物種的細(xì)胞死亡。 FL-MoCDIP菌株和WtsE菌株在誘導(dǎo)煙草本塞姆氏葉細(xì)胞死亡的時間和外觀上強度不同。WtsE菌株引起的細(xì)胞死亡癥狀通常開始于農(nóng)桿菌滲入后的36至48小時，且FLMoCDIP1，F(xiàn)L-MoCDIP3，和FL-MoCDIP4菌株誘導(dǎo)通常出現(xiàn)在農(nóng)桿菌滲入的2至3天，有大量的細(xì)胞圍繞滲入部位死亡。然而， FL-MoCDIP5誘導(dǎo)的癥狀一般是在農(nóng)桿菌滲入后4至6天才可見，并在滲入?yún)^(qū)出現(xiàn)微弱的壞死斑點。該結(jié)果與FLMoCDIP5只有在相對長期培養(yǎng)的水稻愈傷組織上表達(dá)并觀察到細(xì)胞死亡，一起表明，F(xiàn)L-MoCDIP5誘導(dǎo)延遲型的微弱的細(xì)胞死亡。圖5.一個完整

37、的而不是截斷非信號肽的稻瘟病菌的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白MoCDIP的瞬時表達(dá)誘導(dǎo)非寄主植物細(xì)胞的細(xì)胞死亡。A，B，和C，5個MoCDIP分別在玉米、擬南芥和本塞姆氏煙草原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)分析。CK =用â-葡糖醛酸酶（GUS）標(biāo)記轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體樣品和一個空載體對照；1 to 5 =原生質(zhì)體樣品的轉(zhuǎn)染用GUS標(biāo)記，而另一個構(gòu)建體分別攜帶MoCDIP1到MoCDIP5。D, 通過使用農(nóng)桿菌的方法檢測5個MoCDIP在本塞姆氏煙草葉中的瞬時表達(dá)。農(nóng)桿菌滲入法在相同葉子上一起進(jìn)行，分別是用攜帶空載體為對照（pGD），陽性對照(WtsE)，非信號肽序列構(gòu)建的MoCDIP (NS-MoCDIP)和全

38、長構(gòu)建MoCDIP(FL-MoCDIP)根癌農(nóng)桿菌。E，逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分析農(nóng)桿菌滲入本塞姆氏煙草葉中MoCDIP的表達(dá)。所有的RNA都是從接種36h后的本塞姆氏煙草葉中提取。 CK = 滲入對照的空載體組織的RT-PCR的結(jié)果l；1 =滲入FL-MoCDIP組織的RT-PCR結(jié)果；2 = 滲入NS-MoCDIP組織的RT-PCR結(jié)果 。1.6 MoCDIP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的生理基礎(chǔ)。以往的研究表明某些微生物毒素或效應(yīng)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡分享一些保守機(jī)制(Asai等. 2000; Qutob等. 2006)。為了進(jìn)一步確定MoCDIP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的生理特性，我們在水稻原生質(zhì)體

39、和本塞姆氏葉進(jìn)行抑制實驗。兩種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白，即WtsE和Bax，也作為對照包含在測定中。 鈣信號已在細(xì)胞死亡過程中顯示出重要作用(Boudsocq等. 2010; Lecourieux等. 2002)。為了確定鈣信號是否是MoCDIP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的，我們在抑制實驗中應(yīng)用了三氯化鑭這種鈣通道抑制劑。三氯化鑭的應(yīng)用阻止了所有MoCDIP的瞬時表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這表明由這些蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程是依賴于鈣信號傳導(dǎo)通路的。 光強度已被證明是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一個重要因素，通過引發(fā)一些毒素或效應(yīng)（(Asai等. 2000; Qutob等. 2006）。為了測試MoCDIP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是否與光相

40、關(guān)，我們在有光或黑暗中將MoCDIP轉(zhuǎn)殖到水稻原生質(zhì)體。任何一個條件培養(yǎng)下的原生質(zhì)體樣品之間的細(xì)胞活力沒有差別，表明在水稻原生質(zhì)體中由MoCDIP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程是光獨立的（表1）。與此相反，在黑暗中的本塞姆氏煙草葉片中MoCDIP瞬時表達(dá)不誘導(dǎo)任何細(xì)胞死亡性病變（表1），這表明在在本塞姆氏煙草葉片中MoCDIP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是光依賴的。有研究表明，一些抗凋亡蛋白如BCL-2家族蛋白和bax抑制劑-1（BI-1）可以抑制各種類型的細(xì)胞死亡，并在酵母，植物，和哺乳動物中都能發(fā)揮這種功能（Watanabe 和Lam 2009）?？沟蛲龅鞍椎倪^表達(dá)被證明可以通過多種刺激來抑制細(xì)胞死亡，揭示了不同類

41、型的細(xì)胞死亡可具有共同的下游機(jī)制(Dickman等. 2001)。我們測試了Bcl-xL，所述BCL-2家族中的一員，以確定MoCDIP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否可通過抗凋亡蛋白被抑制。預(yù)先浸潤攜帶該Bcl-xL的農(nóng)桿菌細(xì)胞的表達(dá)載體在浸潤攜帶MoCDIP，WtsE，或Bax的農(nóng)桿菌細(xì)胞后沒有產(chǎn)生細(xì)胞死亡癥狀。與此相反，預(yù)先滲入了含有空載體的本塞姆氏煙葉在MoCDIP，WtsE，或Bax蛋白誘導(dǎo)的瞬時表達(dá)顯示出明顯的細(xì)胞死亡的癥狀。這個結(jié)果表明，在本塞姆氏煙草葉中MoCDIP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡能夠被抗凋亡蛋白抑制（表1）。表 1稻瘟菌的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白在水稻原生質(zhì)體和本塞姆氏煙草葉子中的抑制測定a RP

42、=水稻原生質(zhì)體, NBL = 本塞姆氏煙草葉子, DPI = diphenyleneiodonium sulfate, + = 細(xì)胞死亡,= 無細(xì)胞死亡, ND = 未確定。b LaCl3用蒸餾水溶解，與同體積的水用于水稻原生質(zhì)體或本塞姆氏煙草葉片的對照。c A一個空載體 PGD作為對照。觀察到對照對細(xì)胞死亡測定沒有影響。1.7 MoCDIP的序列和結(jié)構(gòu)分析。 序列分析表明，5個已識別的MoCDIP在它們的序列高度多樣化，與已知的在不同病原體上的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)效應(yīng)蛋白如Nep1-like proteins (Qutob等2006), INF1 (Kamoun等. 1997), ToxA (Ciu

43、ffetti等. 1997), ToxB (Martinez等. 2001), or Nip (Mattinen等. 2004).沒有序列同源性。針對稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫和NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，在其他生物體的稻瘟病菌的基因組測序中，MoCDIP2和MoCDIP4具有相對大的同源物數(shù)目（補充圖S2）。與此相反，MoCDIP1和MoCDIP5僅在其他微生物的蛋白質(zhì)中有同源性（補充圖S2），MoCDIP3在稻瘟病菌基因組或在其它生物體的基因組測序中都沒有同源物。同源性搜索也透露MoCDIP2屬于某個包含CFEM蛋白序列的家族，這個蛋白可充當(dāng)一個細(xì)胞表面受體，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子，或在宿主真菌相互作用中作為粘附

44、分子(Kulkarni等. 2003)；MoCDIP4是一種高度保守糖苷水解酶家族61蛋白質(zhì)的同系物(Davies 和 Henrissat 1995)；雖然MoCDIP1和MoCDIP5兩種蛋白質(zhì)之間沒有序列相似性，但都與蓖麻毒素B凝集素蛋白有相似之處。為了進(jìn)一步描述參與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的MoCDIP的性質(zhì)，我們搜查了蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域并基于域的預(yù)測進(jìn)行了缺失突變體的功能分析。構(gòu)建MoCDIP的缺失突變體，除了MoCDIP3，因為它不包含任何預(yù)測域，分別在水稻原生質(zhì)體和本塞姆氏煙草葉中（圖6）進(jìn)行測試。瞬時表達(dá)實驗表明，N-末端區(qū)域的突變體MoCDIP1，氨基酸（aa）1185，足以用于誘導(dǎo)植物細(xì)胞

45、的細(xì)胞死亡。然而，N末端區(qū)域，氨基酸1至162，它缺乏PbH1基序中的氨基酸1至185的片段，失去誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力，這表明PbH1基序可能在誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的作用。在N-末端，MoCDIP2的CFEM結(jié)構(gòu)域是誘導(dǎo)水稻的細(xì)胞死亡的有效區(qū)域，這表明在細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)中預(yù)測GPI錨定蛋白不是必需的。至于MoCDIP4，缺乏纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）的缺失突變體，被發(fā)現(xiàn)只能誘導(dǎo)微弱的細(xì)胞死亡，而且缺乏接頭片段與CBD域的突變體不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，這表明C-末端連接體片段和CBD域的是在誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡中具有重要的功能。該試驗也表明，缺乏C末端或缺少潛在鋅結(jié)合位點基序的MoCDIP5突變體不能誘

46、導(dǎo)水稻原生質(zhì)體和煙草本塞姆氏煙葉的細(xì)胞死亡，這表明要于植物中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡MoCDIP5的全部長度都是必須的。圖6. 稻瘟病菌的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白（MoCDIP）的結(jié)構(gòu)分析。MoCDIP及其缺失突變體的示意圖在左側(cè)顯示。MoCDIP的預(yù)測結(jié)構(gòu)域或基序用有顏色的矩形表示。被刪除的區(qū)域用虛線表示。MoCDIP及其缺失突變體在本塞姆氏煙草葉子或稻原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)。煙草本塞姆氏葉的農(nóng)桿菌滲入試驗的結(jié)果或轉(zhuǎn)染的水稻原生質(zhì)顯示在右側(cè)。標(biāo)志+，+ - 和 -分別表示明顯的細(xì)胞死亡，弱的細(xì)胞死亡和無細(xì)胞死亡。原生質(zhì)體結(jié)果的數(shù)據(jù)條顯示出的平均值來自在一個實驗中的三個一式三份的樣品。每個實驗至少重復(fù)3次，具有相似的

47、結(jié)果。2 討論2.1 水稻與稻瘟菌的相互作用的轉(zhuǎn)錄組分析。使用不同的基因預(yù)測算法，約12的注釋基因（1,546）被預(yù)測為在稻瘟病菌基因組中鑒定的效應(yīng)蛋白(Soanes等l. 2008)。這些預(yù)測的基因在感染的水稻植物的表達(dá)在很大程度上是未知的。通過采用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）分析，RL-SAGE和SuperSAGE分析被感染的稻葉在早期感染階段，防御轉(zhuǎn)錄組對稻瘟病菌感染的特征(Ebbole 等. 2004; Gowda 等. 2007; Kim 等. 2001; Matsumura 等. 2003; Rauyaree 等. 2001)。然而，這些研究只確定了少數(shù)的真菌基因，主要是因為在被感染的組

48、織中真菌的RNA的比例相對較低，測序覆蓋率是不夠深。最近，用于從受感染的植物組織中富集真菌RNA的改進(jìn)的方法已經(jīng)被用來分析稻瘟病菌和稻的相互作用轉(zhuǎn)錄組。Kim和 associates（2010）應(yīng)用EST加上消減雜交技術(shù)分析從病葉感染晚期得到的cDNA庫。一共有712 個uniEST從菌體中被鑒定，占總uniEST的31。Mosquera和同事（2009）開發(fā)了一種程序，以產(chǎn)生嚴(yán)重感染的水稻葉鞘，這個程序允許總RNA即具有高比例的RNA（高達(dá)20）的分離，這種RNA源自稻瘟病菌的活體營養(yǎng)侵入性的菌絲。通過采用基因芯片分析，作者確定了262個真菌基因和210個水稻基因，在活體營養(yǎng)入侵期間誘導(dǎo)可達(dá)

49、10倍。在這項研究中，我們采用三個高通量技術(shù)，即RL-SAGE，MPSS和SBS，來分析稻瘟病菌感染的水稻組織的轉(zhuǎn)錄組。而RL-SAGE技術(shù)僅用于研究感染了親和的分離菌的稻葉組織在96hpi的基因表達(dá)圖譜， MPSS和SBS被用于研究接種任一親和或不親和的分離菌在接種后不同的時間點水稻葉片組織的基因表達(dá)譜。接種兩種不親和的和親和的菌株的水稻葉片在72 hpi，只有非常有限數(shù)量的真菌基因被鑒定，因為稻葉上沒有明顯癥狀或僅有極少數(shù)褐色病變出現(xiàn)。在接種親和的分離菌的96 hpi，水稻葉片出現(xiàn)典型的易感病斑。同樣，從嚴(yán)重感染的葉子中檢測到相當(dāng)多的真菌轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。我們從分別RL-SAGE-96h，MPSS

50、-96h，SBS-96h的庫中確定了3091（17），2327（12.3）和5099（11.4）個顯著的稻瘟病菌的標(biāo)記。結(jié)合三種技術(shù)的結(jié)果，我們總共鑒定了6413個稻瘟病菌的基因，其中包括被預(yù)測為編碼推定分泌蛋白和可能在植物中表達(dá)的851個基因。我們的結(jié)果連同那些以前報道會為進(jìn)一步研究水稻和稻瘟菌相互作用的分子機(jī)制提供有價值的信息。3個96h庫的聚類分析表明，從RL-SAGE，MPSS和SBS回收的轉(zhuǎn)錄物部分重疊，與以前使用MPSS，RL-SAGE和寡核苷酸比較式基因體晶片（oligo array）方法的稻瘟菌轉(zhuǎn)錄譜的結(jié)果類似（Gowda等，2006）。該結(jié)果還表明，使用多個不同的方法可以提供

51、更全面的基因表達(dá)譜。當(dāng)考慮到個人的技術(shù)，SBS似乎是轉(zhuǎn)錄分析最有效的方法。RL-SAGE-96h庫和MPSS-96h中類似的數(shù)目稻瘟菌基因被確定（3008個和2401個特有的稻瘟菌基因從分別兩個庫中被鑒定），共有4730個稻瘟病菌基因從SBS-96-h庫中被鑒定（圖1B），幾乎是其它兩種方法鑒定的基因數(shù)的兩倍。此外，從SBS-96h回收的稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄物包含上的大多數(shù)來自RL-SAGE-96h和MPSS-96h的稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。我們的研究結(jié)果表明，由于轉(zhuǎn)錄的深覆蓋這兩種水稻和稻瘟病菌的許多弱表達(dá)轉(zhuǎn)錄物從庫中被回收。隨著測序成本的迅速下降，基于SBS的超快速測序法或其他新一代測序平臺將允許進(jìn)行

52、更深入植物病原體相互作用轉(zhuǎn)錄組的表征。 2.2 利用水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)對稻瘟菌的效應(yīng)物進(jìn)行功能鑒定。 在受感染的水稻植物中進(jìn)行的稻瘟病菌效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄分析為在植物（在水稻中表達(dá)的基因）稻瘟病菌相互作用的功能分析提供了起點。在過去的二十年中，通過定位克隆(Kang等. 1995; Orbach等. 2000; Sweigard 等. 1995)，基因關(guān)聯(lián)分析(Yoshida 等. 2009)，或功能缺失(Ahn 等. 2004; Jeong 等. 2007; Kim 等. 2005; Talbot 等. 1993)的方法分離得到了一些稻瘟菌無毒或致病性效應(yīng)的基因。前兩個過程是費時，繁瑣，而

53、且價格昂貴的。至于功能喪失的方法，它往往由于許多基因可能具有重疊的功能而受到阻礙。；例如很多敲除突變的分泌蛋白基因有沒有可識別的表型（Mosquera等，2009）。因此，經(jīng)濟(jì)有效的，高效率的功能獲得方法將是鑒定稻瘟病菌效應(yīng)物的一個有價值的替代方法。至于功能獲得的鑒定，農(nóng)桿菌滲入瞬時檢測是一種廣泛使用的方法，用于許多茄科植物的植物病原菌效應(yīng)物的功能表征，特別是本塞姆氏煙草和普通煙草(Munkvold 和 Martin 2009)。但是，此農(nóng)桿菌滲入方法是不適用于單子葉植物。我們曾經(jīng)報道的原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)系統(tǒng)能夠直接在水稻細(xì)胞中完成檢測(Chen 等. 2009a)。近日，Yoshida和同事

54、（2009年）以及Okuyama和同事（2011）檢測到在水稻原生質(zhì)體同時表達(dá)抗病基因和其在稻瘟菌中的同源無毒基因的過敏反應(yīng)。利用該系統(tǒng)，他們成功地篩選出稻瘟Avr-Pia,Avr-Pii,Avr-Pik/km/kp和稻瘟病抗性基因Pia。在這項研究中，我們確定了五個稻瘟菌效應(yīng)物能夠在水稻細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。結(jié)果表明，稻原生質(zhì)體表達(dá)分析是大規(guī)模篩選鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的效應(yīng)物或過敏反應(yīng)的高效方法。2.3 在稻瘟病菌和水稻之間的相互作用中MoCDIP的作用。 不同于許多細(xì)菌病原體，其經(jīng)由III型分泌系統(tǒng)在宿主細(xì)胞內(nèi)傳送效應(yīng)蛋白，真核植物病原體似乎通過真核（II型）分泌途徑（Panstruga和200

55、9多茲），以分泌大量的細(xì)胞外蛋白(Panstruga and Dodds 2009)。一些分泌蛋白被轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞并且在宿主細(xì)胞質(zhì)中起抑制宿主防御功能。在寄主的質(zhì)外體空間還有許多其他功能來方便病原體的寄生生活。后者包括降解酶，毒素，或植物酶的抑制劑。最近，建議給予效應(yīng)物一詞的一個更廣泛的定義。由于分泌蛋白施加給植物細(xì)胞的一些效果，定義中應(yīng)包含這些分泌蛋白（Hogenhout等，2009）。在過去的幾十年中，已經(jīng)從真核植物病原中確定一些質(zhì)外體效應(yīng)物與毒素或激發(fā)子活性可以在植物中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(Rep 2005)。許多質(zhì)外體效應(yīng)物在半活體營養(yǎng)或死體營養(yǎng)植物病原體的毒力中發(fā)揮積極作用(Ottmann

56、等. 2009; Qutob 等. 2006)。從42個在植物中表達(dá)的稻瘟病菌鑒定的分泌蛋白中，我們成功地確定了五個新的效應(yīng)物MoCDIP1到MoCDIP5誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡。鑒于這些基因在感染階段表達(dá)，特別是96 hpi（圖4），我們推測，其中一些誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的效應(yīng)物可在重度感染的死體營養(yǎng)階段后期有利于稻瘟病菌的定殖，這是不同病理系統(tǒng)之間的共同機(jī)制(Gijzen 和 Nurnberger 2006)。確定這些效應(yīng)物在水稻細(xì)胞的受體并定義引起水稻細(xì)胞壞死的相互作用將會是十分有趣的。5個MoCDIP在它們的序列中高度多樣化。MoCDIP3不與任何已知蛋白有任何顯著相似度，MoCDIP1，MoCDI

57、P2，MoCDIP4和MoCDIP5都與稻瘟病菌或其他微生物有密切相關(guān)的同系物。我們的分析還表明，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的五個不同MoCDIP有相似生理的表現(xiàn)型，如對光反應(yīng)，鈣離子通道的抑制劑和以的Bcl-X1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡抑制。這些結(jié)果一起表明，5 個MoCDIP的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)機(jī)制可能是類似的，但它們的序列是十分不同的。在五個MoCDIP中，MoCDIP4屬于一個各種各樣的微生物的纖維素分解酶的大家族。相關(guān)的同源蛋白包括內(nèi)切葡聚糖酶，木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶。一些以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一酶家族的基因編碼成員表達(dá)通過絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)發(fā)病機(jī)理，以及其他功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用s (Le

58、v and Horwitz 2003; Madhani 等. 1999; Roberts 等. 2000)。然而因為纖維素酶之間的冗余，敲除一個甚至幾個基因的基因編碼纖維素分解酶有很少或沒有后果的毒力(Lev and Horwitz 2003)。在這份報告中，我們證明MoCDIP4，一個公認(rèn)的內(nèi)切葡聚糖酶，當(dāng)它在植物細(xì)胞中表達(dá)時誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，我們的發(fā)現(xiàn)為通過該纖維素分解酶可以幫助入侵微生物的機(jī)制提供了新的線索。MoCDIP4包含兩個保守結(jié)構(gòu)域，糖基水解酶家族61域和真菌的核心區(qū)域。最近，真菌核心區(qū)域已被證明是能誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的疫霉屬誘導(dǎo)凝集素CBEL(Gaulin 等. 2006)和木

59、霉膨脹素的植物根系定殖起著重要作用的一種結(jié)構(gòu)(Brotman 等. 2008)。更有趣的是，這個區(qū)域在微生物被確定為新型的PAMP（Brotman 等. 2008; Gaulin 等. 2006）。與以前的報道一致，我們發(fā)現(xiàn)MoCDIP4的核心區(qū)域在誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的過程中起著重要作用（圖6），增強了核心區(qū)域發(fā)揮功能上保守的作用的觀念，如在不同的植物病理體系中充當(dāng)一個PAMP激發(fā)子。3 材料和方法3.1 植物材料和真菌菌株。在本研究中所用水稻（Oryza sativa）材料為野生型日本晴水稻和攜帶抗稻瘟病基因Pi9的轉(zhuǎn)基因日本晴水稻（Qu 等. 2006）。在這項研究中使用的稻瘟病菌菌株包括Che86061和KJ201。3.2 RL-SAGE，MPS