血清學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí) 驗(yàn) 目 錄 實(shí)驗(yàn)一：0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液的制備實(shí)驗(yàn)二：1%雞紅血球懸液的制備實(shí)驗(yàn)三：禽流感血凝試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四：禽流感血凝抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五：口蹄疫病毒3ABC-ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)六：豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液的制備一、目的要求掌握磷酸鹽緩沖液的制備方法，為后續(xù)的血清學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。二、藥械及耗材電子天平，小電爐，藥匙，1000ml燒杯，玻棒，500ml三角瓶（帶棉塞），pH試紙；Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸餾水；1 N NaOH、1N HCl（滴管瓶塞）。三、試驗(yàn)程序配方：Na2HPO4.12H2O 2.

2、9克 KH2PO4 0.3克 NaCl 8.0克 蒸餾水 1000ml將上述成分稱量在燒杯中，加熱攪拌溶解，待完全溶解以后，調(diào)整pH值至7.4。然后分裝在3個(gè)三角瓶中（每瓶大約330ml），加棉塞，橡皮筋捆扎，置高壓滅菌器中121 15min滅菌處理，備用。實(shí)驗(yàn)二 1雞紅血球懸液的制備一、目的要求掌握雞紅血球懸液的制備方法，為后續(xù)的血凝和血凝抑制試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。二、藥械與耗材公雞，玻璃注射器（30ml），16大針頭，5檸檬酸鈉；800型離心機(jī)，玻璃離心管（10ml），洗耳球，10ml移液管，2ml移液管，棉花；0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液。三、試驗(yàn)程序 從心臟采集公雞的抗凝血約25ml，平

3、均分裝3支離心管； 作對(duì)稱平衡以后，3000rpm離心10min，棄上清液，保留紅血球泥； 加入適量PBS，用乳頭滴管輕輕地洗滌紅血球，然后作對(duì)稱平衡，3000rpm離心10min，棄上清液，保留紅血球泥； 重復(fù)上述操作23次，直至上清液清亮透明； 用10ml移液管輕輕地吸去上清液棄之，保留紅血球泥； 用10ml移液管向三角瓶中加入49.5mlPBS，再用2ml移液管吸取0.5ml紅血球泥，棉花擦去移液管外壁粘附的紅血球。將0.5ml紅血球泥放入49.5mlPBS中，混勻置于4冰箱備用。實(shí)驗(yàn)三 禽流感血凝（HA）試驗(yàn)一、目的要求流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識(shí)別并吸附于紅細(xì)胞表面受

4、體結(jié)構(gòu)，HA試驗(yàn)由此得名。本試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法。可用于流感病毒分離株HA亞型的鑒定，也可用來檢測(cè)禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。二、藥械與耗材磷酸鹽緩沖液、3.8%檸檬酸鹽溶液、96孔V型血凝板、50L移液槍、25L移液槍、微量振蕩器。1%雞紅細(xì)胞懸液制備，參照實(shí)驗(yàn)二。三、診斷試劑和待檢樣本禽流感病毒血凝素分型抗原。四、試驗(yàn)程序 在微量反應(yīng)板的112孔均加入25L PBS，換滴頭。 吸取25L病毒懸液加入第1孔，混勻。 從第1孔吸取25L病毒液加入第2孔，混勻后吸取25L加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取25L棄去，換滴頭。

5、每孔再加入25L PBS。 每孔均加入25L 1%雞細(xì)胞懸液（注：勿必將紅細(xì)胞懸液搖勻）。 振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40分鐘后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下）。對(duì)照孔紅細(xì)胞將成為明顯的鈕扣狀沉到孔底。結(jié)果判定：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。以使紅細(xì)胞100%凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)作為血凝效價(jià)。實(shí)驗(yàn)四 禽流感血凝抑制（HI）試驗(yàn)一、目的要求流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。本試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)

6、方法?？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來檢測(cè)禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。二、藥械與耗材磷酸鹽緩沖液、3.8%檸檬酸鹽溶液、96孔V型血凝板、50ul移液槍、25ul移液槍、微量振蕩器。1%雞紅細(xì)胞懸液制備，參照實(shí)驗(yàn)二。三、診斷試劑和待檢樣本禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型血清以及陰性血清。四、試驗(yàn)程序根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4，即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1：256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1：64（256/4）。 在微量反應(yīng)板的111孔加入25ulPBS，第1

7、2孔加入50L PBS。 吸取25ul血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25L于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25L棄去。 111孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25L，室溫靜置至少30分鐘。 每孔加入25L 1%雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40分鐘，對(duì)照紅細(xì)胞將呈鈕扣狀沉于孔底。結(jié)果判定：以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于22，陽性對(duì)照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于23為可疑需重復(fù)試驗(yàn);HI價(jià)大于或等于24為陽性。實(shí)驗(yàn)五 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(NSP 3

8、ABC-I-ELISA)一、目的要求 口蹄疫(FMD)是一種高度接觸性傳染病,傳播迅速,可形成世界性大流行,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和國(guó)際畜產(chǎn)品貿(mào)易具有嚴(yán)重的負(fù)面影響?？刂坪拖麥鏔MD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群在采用疫苗的國(guó)家,大多數(shù)動(dòng)物血清口蹄疫病毒(FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白和病毒相關(guān)抗原(VIAA,即3D)抗體均為陽性。因此,一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和VIAA的診斷方法很難確定口蹄疫病毒感染與否。只有將感染動(dòng)物和隱性帶毒動(dòng)物與疫苗免疫動(dòng)物加以區(qū)分，才能為FMD的控制和消滅提供科學(xué)的依據(jù)。目前的疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中去除絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動(dòng)物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3BC抗體產(chǎn)生，而自然感染動(dòng)

9、物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體，也有非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。因此檢測(cè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測(cè)隱性感染動(dòng)物，而且可以區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。 本試驗(yàn)采用FMD NSP 3ABC-I-ELISA試劑盒檢測(cè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。用于活畜進(jìn)口調(diào)運(yùn)、疫區(qū)凈化檢疫和群體無癥狀感染評(píng)價(jià)，區(qū)分感染和免疫動(dòng)物。二、藥械及耗材 2ml指彈頭離心管，吸水紙，110ul移液槍，10100ul移液槍,500ul移液槍，250ml燒杯，液體稀釋槽，小、中、大移液槍尖。三、診斷試劑和待檢樣本3ABC-I-ELISA診斷試劑盒、待檢血清樣本。四、試驗(yàn)程序 將試劑盒配備的25倍濃縮PBST用

10、無離子水或蒸餾水做1：25倍稀釋待用。 待檢血清樣品和陽性、陰性對(duì)照血清用血清稀釋液1：21倍稀釋（120ul血清稀釋液加血清6ul），每孔加入100ul，陰、陽性對(duì)照血清樣品平行加兩孔，用封口膜封口，37結(jié)合30分鐘。 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。 用血清稀釋液按1：100比例稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100ul，用封口膜封口，37結(jié)合30分鐘。 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。 每孔加入50ul底物溶液B（H2O2）和50ul底物溶液A（TMB）混勻。封口膜封口，37避光作用10-15分鐘。 每孔加入100ul終止液（H2SO4）。 輕輕搖振混勻，測(cè)定波長(zhǎng)450nm吸光值。結(jié)果判定：陽性對(duì)照平均OD值應(yīng)大于0.6；陰性對(duì)照應(yīng)小于0.2。結(jié)果計(jì)算：樣品效價(jià)為：（OD樣品