RNA干擾技術的特點

1、RNAi具有的特征RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制；RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA；RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠遠少于內源mRNA的數(shù)量）就能完全抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進行的；RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點；dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21 bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能

2、在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程?？赡苁荄icer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。RNAi的生物特性RNAi抑制轉座子活性兩方面的證據(jù)提示轉座子活性的抑制與siRNA有關 發(fā)現(xiàn)蠕蟲mut-7 基因參與RNAi 并且與轉座子的轉座抑制有關; 在果蠅中, 參與RNAi 的RNA 解螺旋酶Spindle-E 的突變將導致該基因引起的基因沉默的缺失, 同時提高了反轉錄轉座子活性。RNAi抵御病毒感染在擬南芥中研究轉基因引起基因沉默時發(fā)現(xiàn), sgs2/sd

3、e1基因突變的擬南芥對病毒的侵染表現(xiàn)出高度的敏感性 。RNAi參與異染色質的形成和維持Hall 等研究表明,著絲粒同源重復序列和RNAi 組分一起正負調節(jié)著異染色質的形成并共同促使異染色質組裝成核；Vople 等在敲除裂殖酵母( S. pombe) 的RNAi 途徑基因( 如Argonaute 、Dicer 、RDRP) 時發(fā)現(xiàn)異染色質轉錄得到的dsRNA可以在RNAi 途徑的參與下, 加工成si RNA,si RNA 募集異染色質蛋白1( HP1) , 然后靶向性引起相應異染色質區(qū)域的轉基因沉默。RNAi參與機體的發(fā)育調控及生理代謝RNAi 只抑制轉錄后的基因, 所以RNAi 在生物體發(fā)育學

4、研究中具有優(yōu)勢。Chuang 等用RNAi 技術進一步證實了AG、CLV3 、AP1 、PAN 等已知功能基因在擬南芥花發(fā)育過程中的功能。在RNAi 過程中形成的RISC 復合物可根據(jù)不同情況分別利用si RNA 或stRNA 行使不同的功能, 但最終均導致特定基因沉默。1.高效性：Elbashir等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25 nmol/L與100 nmol/L的起始雙鏈RNA產(chǎn)生的結果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低到1.5 nmol/L時產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當濃度降低到0.05 nmol/L時，沉默的效果才消失。Holen等也證實1100 nmol/L的雙鏈

5、RNA濃度對基因沉默的效果是一致的。這說明雙鏈RNA介導的基因沉默效率是相當高的。需要ATP：Zamore等認為RNAi過程中至少有2個步驟需要能量的供給：一是長的雙鏈RNA被 Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結合解鏈后形成有活性的RISC。特異性：Elbashir等和Brummel kamp等發(fā)現(xiàn)在2123個堿基對中有12個堿基錯配會大大降低對靶mRNA的降解效果。位置效應：Holen等根據(jù)人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4組雙鏈RNA來檢測不同位置的雙鏈RNA對基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類型的細胞中，hTF167i和hTF372i能

6、夠抑制85%90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中心依次相差3個堿基對在其左右各合成了幾組雙鏈RNA，有趣的是它們所能抑制該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和 hTF161i只與hTF167i相距9個和6個堿基，但它們幾乎沒有抑制該基因活性的能力。結果還表明雙鏈RNA對mRNA的結合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。競爭效應：Hoten等將10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無差異，但將20 nmol/L基因

7、抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低?？蓚鞑バ裕涸诰€蟲中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在線蟲細胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白SID1，它可以將雙鏈RNA轉運出細胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了SID1介導的雙鏈 RNA在細胞間的運輸。但在果蠅上并未發(fā)現(xiàn)有此基因的同源物，因此在果蠅上通過注射產(chǎn)生的RNAi不能擴散。植物中RNA干擾具有如下特點：(1)在確定基因功能時具有靶向性，在一個沉默載體中插入部分基因序列就能確定某一基因的功能；(2)能用來選擇性地沉默某一基因家族中的單個基

8、因或同時沉默一個基因家族中的多個基因；(3)PTGS能確定在敲除后發(fā)生發(fā)育早期死亡的基因功能；(4)PTGS具有系統(tǒng)性，可以通過植物的維管系統(tǒng)傳遞到植物的其它部分；(5)PTGS易于用于大規(guī)模、高通量的系統(tǒng)研究。人們通過構建RNAi文庫已成功的對線蟲胚胎發(fā)育進行了研究，此項工作在植物體系的研究中也正不斷取得進展。1. 比同 源 重組法更加簡便，周期大大縮短。2.對 于 哺 乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用RNAi技術研究它的功能。3. 由于 RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。4.R N Ai 還被用來研究在發(fā)育過

9、程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中起著關鍵作用。 途徑主要存在于細胞漿中，與反義核酸、核酶相比， 具有以下特點。特異性。 是嚴格按照堿基配對法則與靶 結合的，故只引起同源 的降解。研究表明，在 個堿基中，錯配 個堿基就會大大降低干擾效應。遺傳性。 分子可擴散至生物體各個細胞，干擾效應可遺傳給后代。研究表明，通過注射或浸泡，在二代線蟲中仍可觀察到對靶基因的抑制作用。但這種遺傳效應可持續(xù)幾代以及高等細胞中是否也存在上訴現(xiàn)象尚不明確。位置效應。研究表明只有針對編碼區(qū)的 才產(chǎn)生干擾效應，對內含子區(qū)域的 不產(chǎn)生干擾效應。 等根據(jù)人組織因子（

10、 ，）的不同位置合成了四組雙鏈 分別觀察其干擾效應，結果顯示 和 有 的基因沉默效率， 只能抑制部分基因， 幾乎無干擾效應。放大效應。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，少量就能夠使大量目的基因沉默，即使細胞增殖 倍，這種沉默現(xiàn)象仍然存在，表明 存在擴增機制.41 高度特異性當一段與基因同源的dsRNA注射入果蠅胚胎時，它可以特異性地在果蠅體內干擾靶基因的表達。而其他即使是與靶基因同屬一個基因家族的基因都不會受到干擾。42 高穿透性RNAi具有距注射點遠距離作用的能力。在線蟲中干擾效應甚至可通過生殖系統(tǒng)傳遞到后代個體。43 高效率性RNA干擾作用是在目的基因被轉錄后，通過對細胞質中同源mRNA的快速降解，最終由

11、于該基因缺少mRNA而無法產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物。果蠅的RNAi實驗結果在23d即可以得到結果，這是其他傳統(tǒng)實驗技術所無法比擬的。44 高穩(wěn)定性以3端懸垂，rI堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定，無需像反義核酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期。RNAi有以下6個重要特性：高特異性。特異性地抑制目的基因。RNAi能夠非常特異地只降解與其序列相應的單個內源基因的mRNA。靶序列的選擇性。RNAi的靶序列需要慎重選擇，外顯子序列的dsRNA能產(chǎn)生特異高效的基因抑制作用，而只具內含子序列的dsRNA則無此效應。高效性。RNAi抑制基因表達具有很高的效率，可以達到缺失突變表型的程度，而且相對很少量的dsRNA就能完全抑

12、制相應基因的表達?？蓚鞑ズ涂蛇z傳性。RNAi抑制基因表達的效應可以在不同細胞間長距離傳送和維持。在線蟲中干涉效應可以傳遞給子代。較強的穩(wěn)定性。siRNA分子3端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細胞內可穩(wěn)定存在34天，半衰期遠長于反義寡聚核苷酸ATP依賴性。去除樣品中的ATP，RNAi現(xiàn)象降低或消失，顯示RNAi是一個依賴ATP的過程，可能與Dicer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量有關12特征。RNAi在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，對染色體DNA序列的復制和轉錄過程不產(chǎn)生任何影響。高度特異性：這是RNAi最大的特點，導入細胞的dsRNA只特異性的抑制與RNAi同源的靶基因序列，siRNA

13、中只要有任何一個堿基與靶序列錯配，也會明顯減弱干擾效應口。高效性：相對較少的dsRNA就可以達到明顯的抑制基因表達的效果，引起該基因的表型缺失突變。濃度、時間依賴性：RNAi效應存在時間、濃度雙重依賴性，干擾效應常出現(xiàn)在注射dsRNA后6 h，在注入dsRNA的23 d后作用最強，可持續(xù)效應72 h以上，而其干擾強度則隨著濃度的增高而增強。傳遞性和遺傳性：將dsRNA注射于線蟲體內后發(fā)現(xiàn)，dsRNA可以突破細胞界限，在不同細胞甚至生物體間長距離傳遞和維持，并引起其他細胞的基因沉默，表明了RNAi作用的可傳遞性。同時也發(fā)現(xiàn)，siRNA介導的RNAi具有一定的可遺傳性。將dsRNA注入秀麗新線蟲的

14、性腺后，在其子代中也誘導出了同樣的基因抑制現(xiàn)象，即證明了它的遺傳性。3.1 高序列特異性RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，19 nt的dsRNA 幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的1nt 突變掉后，它對基因的抑制作用就消失了，這種高度的序列特異性能夠使dsRNA能夠非常特異地誘導與之序列同源的mRNA降解，避免降解與目的mRNA同家族的其他mRNA，從而實現(xiàn)對目的基因的精確沉默。因此，RNAi具有重大的醫(yī)學價值。3.2 高效性RNAi 存在級聯(lián)放大效應，由于Dicer 酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA 的結合并降解后者，產(chǎn)生新的siRNA ；新產(chǎn)生的siRNA可再次

15、與Dicer酶形成RISC復合體，介導新一輪的同源mRNA 降解的多次利用，如此循環(huán)，使相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內源mRNA 的數(shù)量) 就能產(chǎn)生強烈的RNAi效應(每個細胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應)，并可達到缺失突變體表型的程度。相比普通的siRNA，具有短發(fā)卡結構的雙鏈RNA ( short hairpin RNA, shRNA)產(chǎn)生的RNAi效應更強。3.3 RNAi抑制作用迅速RNAi基因的表達發(fā)生在轉錄后，通過細胞質中同源mRNA的快速降解，最終使該基因缺少mRNA 而無法產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物。3.4 RNAi作用的靶基因位點有選擇性外源性dsRNA 的轉入只

16、對成熟mRNA 的產(chǎn)生作用，對mRNA前體沒有或很少具有影響，以內含子或啟動子序列構成的外源dsRNA無法引起RNAi效應。3.5 具有高穩(wěn)定性與反義寡核苷酸不同，siRNA 是3' 端懸掛TT 堿基的雙鏈RNA，所以化學性質很穩(wěn)定，無須象反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期。3.6 可傳播性和可遺傳性RNAi抑制基因表達的效應可以越過細胞界限，在不同的細胞間長距離傳遞和維持。在線蟲中干涉效應可以傳遞到子代，但這種遺傳只限于子一代，子二代往往又恢復到野生型。3.7 RNAi效應的依賴性只有連續(xù)輸入dsRNA，沉默效應才能持續(xù)下去，否則將產(chǎn)生短暫的沉默反應，而且這種效應的強度與初

17、始dsRNA的濃度有關。RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制。注射該基因的內含子或啟動子序列的dsRNA都沒有干涉效應。翻譯抑制劑對RNAi不產(chǎn)生影響。RNAi具有較高的特異性。起初人們認為RNAi和siRNA的產(chǎn)生可能是序列非特異性的因為Fire和Mell發(fā)現(xiàn)將化學合成的dsRNA注入線蟲體內，只要當dsRNA大于26bp時就會發(fā)生RNAi，而dsRNA阻斷基因表達的效能與其長度呈正相關，并且不包含腺嘌呤，尿嘧啶，或胞嘧啶的dsI礬A也可誘發(fā)RNAi。但實際上dsRNA發(fā)揮干擾作用時對序列相關性要求還是有較高要求的，序列不同的dsRNA與目標基因mRNA要求它們相同的連續(xù)序列長度大于3035n

18、t，目標基因方可被抑制，而當該長度為1423nt時抑制效率是非常低的，這些結果顯示，使用長的dsRNA或是兩相關序列>90同源時基因抑制將會發(fā)生。而另一方面，slRNA若不與mRNA結合其自身又是不穩(wěn)定的，易于降解。這一穩(wěn)定性提供了快速的特異性篩選，即不論何種來源的dsRNA若細胞內沒有與其互補的可供抑制的mRNA序列與之結合，由于它的不穩(wěn)定性，接下來的反應不能繼續(xù)進行，反應被終止。而若是有可結合的互補mRNA反應則繼續(xù)進行。這些均說明siRNA抑制基因表達是具有序列特異性的。RNAi抑制基因表達具有高效性。極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基閃的表達，RNAi是通過自身放大機制來發(fā)揮作

19、用【l引，但dsRNA需要一個最小的長度才能產(chǎn)生有效的干擾效果。dsRNA小片斷如果小于2123nt，特異性將明顯降低，不能保證不與細胞內非靶向基因相互作用，如遠遠大于2123nt，互補序列可能延伸，超出抑制范圍。RN加有濃度，時間雙重依賴性。干擾效應通常出現(xiàn)在注射dsRNA6小時后，可持續(xù)72小時以上。RNAi基因表達的效應可以突破細胞界限，在不同細胞甚至生物體間長距離傳遞和維持，并可傳遞給子一代。RNAi是生物基因組削弱或抵抗外來遺傳訊息入侵的保護性機制，已成為近年來研究基因功能、腫瘤治療的新方法，該技術具有以下重要特征：高效性和濃度依賴性(Schneider et al，2005)，只需

20、要少量的siRNA就可以引發(fā)RNAi現(xiàn)象。這是因為整個過程中存在倍增放大機制。Martens等在網(wǎng)狀原蟲的RNAi試驗中敲除RrpA(RdRP的同源體)后則無法檢測到siRNA，但在體外系統(tǒng)中仍可檢測到，且量非常少(Martens etal，2002)；高特異性，siRNA具有高度特異性，只針對某一目的RNA或是其同源序列發(fā)揮作用。而對其他基因或是相關基因序列并沒有沉默作用，這也是RNAi最大的優(yōu)點，針對性強。此外與基因敲除相比，根據(jù)目標基因設計合成的siRNA具有高度特異性，不同siRNA對同一基因的沉默效果不同，從而可以模擬數(shù)量遺傳性狀；可遺傳性，將siRNA植入生物體內，從根本上改變了這

21、種生物的基因組成。因此具有遺傳性。Fire等(1998)做過相關試驗。將針對某基因的siRNA注入線蟲的性腺后在其子代中同樣檢測不到該基因的表達。31高效性注入細胞內的siRNA的量比細胞內的mRNA量要少得多。但因為其自身的循環(huán)放大機制仍可對目的基因產(chǎn)生有效的阻斷。32高特異性由dsRNA降解成的小的干擾RNA，除其正義鏈3 7端的兩個堿基在序列識別中不起主要作用以外，其余堿基在序列識別中都是必需的。單個堿基的改變即可以使RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA，針對同源基因共有序列的RNAi則可使同源基因全部失活。33共抑制性RNAi是由雙鏈RNA介導的轉錄后基因沉默機制，它的啟動子相當

22、活躍，外源基因可以轉錄，但不能正常積累mRNA。RNAi作用不僅使外源基因在轉錄后水平上失活，同時誘導與其同源的內源基因沉默。34種屬時效性Irie等發(fā)現(xiàn)在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細胞中只能維持一段時間，一般注入dsRNA后的23 d，RNAi的作用最明顯，而后12 d內，靶mRNA的豐度就能恢復到注射dsRNA之前的水平。這可能是由于RNA依賴的核苷脫氨酶脫氨基活性的逐步增高，導致siRNA的生成減少而受到抑制。35 dsRNA的長度限制性Dicer酶能與200500 bp范圍內的dsRNA結合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片

23、段長度限制性。RNA 干擾（RNA ineeence，RNAi）是生物基因組抵抗病毒或轉座子之類的外來遺傳元件入侵的一種保護性機制，RNAi具有4個重要特征11：（1）高效性：少量的雙鏈RNA（sRNA）就可以使相應的基因表達受到抑制， 即其發(fā)生過程中有正反饋的信號放大效應；（2）高特異性：雙鏈RNA（sRNA）可以特異地降解與之序列相對應的單個內源基因的RNA,無關基因不受影響；（3）可遺傳性及遠距離效應：RNAi 基因表達的效應不僅能夠傳遞給子一代，而且可以在同一個生物體的不同細胞甚至生物體間進行長距離的傳遞和維持；（4）ATP依賴性：RISC 的形成和Dice 酶切割sRNA 的過程中都

24、需要ATP 的參與；因此，RNA 干擾想要發(fā)生效應則必須要依賴ATP 的參與。31 高序列特異性RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，19 nt的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的1 nt突變后，它對基因的抑制作用就消失了，這種高度的序列特異性能夠使dsRNA非常特異地誘導與之序列同源的mRNA降解，避免降解與目的mRNA同家族的其他mRNA，從而實現(xiàn)對目的基因的精確沉默。因此，RNAi具有重大的醫(yī)學價值。32 高效性RNAi存在級聯(lián)放大效應，由于Dicer酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA的結合并降解后者，產(chǎn)生新的siRNA；新產(chǎn)生的siRNA可再次與Dice

25、r酶形成RISC復合體，介導新一輪的同mRNA降解的多次利用，如此循環(huán)，使得相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內源mRNA的數(shù)量)就能產(chǎn)生強烈的RNAi效應，并可達到缺失突變體表型的程度。33 RNAi抑制作用迅速RNAi發(fā)生在轉錄后，通過細胞質中同源mRNA的快速降解，最終使該基因缺少mRNA而無法產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物。34 RNAi作用的靶基因位點有選擇性外源性dsRNA的轉入只對成熟mRNA產(chǎn)生作用，對mRNA前體沒有或很少有影響，以內含子或啟動子序列構成的外源dsRNA無法引起RNAi效應。35具有高穩(wěn)定性與反義寡核苷酸不同，siRNA是37端懸掛rI-I堿基的雙鏈RNA，所以化學性質

26、很穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期。31序列上的高度特異性：siRNA與靶基因的mRNA在序列上嚴格遵循堿基配對原則，這樣就能特異性地干擾靶基因表達，而和靶基因同屬一個基因家族的其他基因則不會受到影響。32抑制基因表達的高效性：RNAi對基因表達的抑制率可達90以上，而且僅需極少量的dsRNA就能產(chǎn)生強烈的RNAi，這種極高的抑制效率是傳統(tǒng)實驗技術所無法媲美的。33化學性質的高度穩(wěn)定性：由于siRNA是在3端帶有2個TT堿基的dsRNA，所以化學性質非常穩(wěn)定，不需要通過廣泛的化學修飾來提高半衰期。34 RNAi抑制作用的迅速性：RNAi能快速降解胞質中的靶mRNA，從而

27、使靶基因無法產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物，達到沉默靶基因的目的。35 RNAi效應的依賴性舊J：沉默效應只有連續(xù)輸入dsRNA才能持續(xù)下去，而且dsRNA的初始濃度影響RNAi效應的強度。36 RNAi效應的可遺傳性和高穿透性：dsRNA可通過質膜、細胞間隙和細胞屏障而轉運，并能在不同細胞或生物間長距離傳遞和維持，甚至可傳給子代(線蟲)。31 RNAi是轉錄水平的基因沉默只有針對mRNA的基因沉默才是有效的。以內含子為靶向的RNAi無干擾效果。32高特異性RNAi是以siRNA為導向，對與siRNA互補的mRNA發(fā)揮干擾作用的。siRNA通常只有2125bp，外源導入的siRNA最長有報道29bp的。只有在

28、siRNA與靶基因完全互補配對的情況下，RISC才能發(fā)揮作用，一個堿基的突變都可能導致干擾失效。又由于并非所有的mRNA位點都可以被siRNA干擾阻斷，受體結合位點和二級結構都會影響RNAi效果，不當?shù)慕Y合位點常常導致干擾無效24，25】。通常一段siRNA只能干擾一種或一類基因，因此具有高特異性。33高效性通過對RNAi的機制的了解可以看出，一個起始siRNA在與靶基因結合后即可以在RISC作用下把靶基因降解成大量新的RNA片段，自身又可以在RDR的作用下復制擴增，形成干擾回路，使干擾效果成指數(shù)倍增長。34系統(tǒng)性在植物中，RNAi信號可以通過胞問連絲和篩管進行細胞間短距離和長距離的傳遞，從而

29、是干擾擴散到整個組織或植株。動物細胞中RNAi信號可以在相關跨膜蛋白介導下形成跨膜通道，達到擴散效果。線蟲中發(fā)現(xiàn)的由sidl基因編碼SID1蛋白即是一種與沉默信號相關的跨膜蛋白26。哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)有SID1蛋白同源物【15。病毒引起的外源RNAi甚至是可以遺傳的。RNAi引導和控制的組蛋白修飾及異染色質狀態(tài)也被認為可以遺傳。35顯效快對哺乳動物細胞注入siRNA，在數(shù)分鐘內即可發(fā)現(xiàn)干擾現(xiàn)象，在23h是效果最為顯著。通常在1-2d后干擾現(xiàn)象完全消失。通過病毒載體介導RNAi，可以使干擾效果持續(xù)lm。3。l RNAi現(xiàn)象具有種族特異性Barstead等【l在dsRNA轉染實驗中發(fā)現(xiàn)，未分化胚胎干

30、細胞RNAi現(xiàn)象明顯，而分化胚胎細胞中則不明顯或僅能檢測到微弱的效應。Miyagishi等111利用u6啟動子合成3末端4個尿苷酸突出的siRNA基因沉默，實驗證實siRNA效應依賴于靶序列，并與其二級結構RNA結合蛋白質存在與否有關。用與同一轉錄的不同靶區(qū)為模板可能產(chǎn)生不同的抑制水平。Rnase家族具有保守的序列也決定被裂解成的siRNA同樣具有種族特異性。32 RNAi具有高效率性RDRP等類似物的存在使RNAi效應呈級量增長，比單純用正義或反義RNA效應增強達數(shù)十倍之多。在線蟲、西紅柿、真菌、擬菌芥等生物中都發(fā)現(xiàn)了RDRP的同源物，并證實它們都參與RNAi。雖然在人體內未發(fā)現(xiàn)類似果蠅同源

31、物，但可能有其替代物存在。讓許多科學家感到歡欣鼓舞的是，極少量的dsRNA便可封閉整個基因。RNAi效應可由注射部位傳遞到整個機體并進人生殖腺，傳遞給子代。33 RNAi技術具高成功率線蟲全基因組于1998年測序完畢，大部分基因的功能是通過RNAi的方式進行破譯的。50一80序列RNAi技術有效¨引。與反義核苷酸技術及基因敲除相比具有更簡易、方便的特點。以前研究一個基因需要幾個月的時間，但現(xiàn)在則只需數(shù)天時間。利用媒介合成的siRNA可使CHD。蛋白減少超過90。RNAi可以非常簡單地代替基因敲除來制備特定基因缺失表型的個體，并研究該基因的功能。RNAi是發(fā)生在轉錄后水平的基因沉默。d

32、sRNA具有很高的特異性，能特異地將與其同源的mRNA降解。Andrew在植物中用3種轉基因誘導的轉錄后的基因沉默(PTGS)都檢測到有約25 nt(nucleotide)長的siRNA(short interferenceRNA)。Shi Chenyang等從已轉染dsRNA的未分化的胚胎干細胞、卵母細胞以及老鼠胚胎細胞的細胞質提取物中都發(fā)現(xiàn)有2123 nt長的siRNA。這些siRNA可能具有指導核酸酶特異地識別靶mRNA而將其降解的功能，2123 nt以下的片段還沒有發(fā)現(xiàn)，由于這些片段不穩(wěn)定，易被胞內其他核酸酶降解。極低濃度的dsRNA就能完全抑制基因的表達。這可能由于RNA存在復制或由

33、于dsRNA具有很強的催化功能。dsRNA抑制效應具有傳遞性。Timmons等用含目的基因表達dsRNA載體大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，RNA從腸中吸收，但在體細胞及生殖細胞中都有分布表達。此外，RNAi不僅發(fā)生在親代動物本身，其子代伴隨基因表達過程也產(chǎn)生了強烈而特異的抑制效應。細胞的這種抑制能力還能在細胞與細胞之間通過胞間連絲傳遞，甚至可以通過植物的維管組織在整個植物體中傳遞。Jorgenese等將有共抑制現(xiàn)象的植物作為砧木，沒有抑制現(xiàn)象的植物作為接穗，一段時間以后在接穗中產(chǎn)生了共抑制現(xiàn)象。說明有某種信號分子通過植物的維管系統(tǒng)進行傳遞，由于這種系統(tǒng)獲得的沉默具有序列特異性的特點，這種信號分子可能是一種

34、RNA與蛋白質的復合體。dsRNA模板有選擇性。對不同目的基因結構序列而合成的dsRNA所產(chǎn)生的抑制效應存在顯著差異。Fire等發(fā)現(xiàn)，基因外顯子編碼區(qū)的dsRNA能夠產(chǎn)生特異和高效的抑制作用，而人對應于內含子和啟動子序列的dsRNA不能發(fā)生可檢測的抑制效應。高穩(wěn)定性：以3末端突出的TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定。無需象反義核酸那樣進行進行廣泛的化學修飾以提高半衰期。高效率：在低于反義核酸幾個數(shù)量級的濃度下，就能使目標基因的表達降到極低水平甚至完全抑制從而產(chǎn)生缺失突變體表型。高特異性：siRNA除正義鏈3末端突出的2個堿基在序列識別中不起主要作用外其他單個堿基的改變均可能使RNAI效應大大減弱。而針對同源基因共有序列的RNAi則導致同源基因共同失活。高傳遞性：RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限在不同細胞問長距離傳遞和維持。在某些生物中RNA