篩選標記和目的基因

1、篩選標篩選標記與目的基因記與目的基因楊旭楊旭160919012篩選標篩選標記基因是一種已知功能或已知序列記基因是一種已知功能或已知序列的的基因基因，能夠起著特異性標記的作用能夠起著特異性標記的作用。在在基因工程意義上來說，它是重組基因工程意義上來說，它是重組DNA載體的重要載體的重要標記，通常用來檢驗轉化成功與標記，通常用來檢驗轉化成功與否否篩選標記基因在遺傳轉化中擔負著區(qū)分轉化體和篩選標記基因在遺傳轉化中擔負著區(qū)分轉化體和非轉化體的重要作用。非轉化體的重要作用。合適的篩選標記基因及其相應的篩選劑是轉基因合適的篩選標記基因及其相應的篩選劑是轉基因成功的關鍵。成功的關鍵。1.新霉素磷酸轉移酶新霉

2、素磷酸轉移酶 II(NPT II)(npt II) npt基因最初是從大腸桿菌轉座子 Tn5 中分離得到的， 即氨基糖苷磷酸轉移酶 基因， 它編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此 npt基因作為篩選標記基因可以使轉化細胞對抗生素如卡那霉素、 G418、 巴龍霉素、 新霉素等產(chǎn)生抗性， 進而達到篩選的效果。目前， 該基因仍是植物基因工程中運用很廣泛的選擇標記基因。2.潮霉素磷酸轉移酶潮霉素磷酸轉移酶(HPT)(hpt) 從大腸桿菌中分離出來的 hpt 基因可以編碼 HPT， 使其具有潮霉素 B的抗性。hpt 基因被證明是單子葉植物較為理想的篩選基因，因其選擇效率高、 基因型差異小

3、、 對轉化細胞不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生毒害作用、 再生的轉基因植株育性較好等優(yōu)點在水稻、玉米和小麥等作物上得到了廣泛應用。目前， 大多數(shù)轉基因水稻的有關研究中， 均以 HPT 作為抗性選擇標記。3.草丁膦草丁膦 N 乙酰轉移酶乙酰轉移酶(PAT)(bar) 編碼 PAT 的 bar基因最初是從吸水鏈霉菌中分離出來的。PAT 能使草丁膦的自由氨基乙?；?， 從而使草丁膦對植物無毒害作用。這種篩選體系具有快速簡便、 高效， 細胞產(chǎn)生的假轉化體少， 并且使植物獲得優(yōu)良的抗除草劑農(nóng)藝性狀的優(yōu)點。它是目前用得最多的選擇標記基因之一。4. - 微管蛋白基因微管蛋白基因 從牛筋草中分離得到的 微管蛋白基因突變體對二硝

4、基苯胺類除草劑(TFL)具有抗性。目前， 已經(jīng)作為篩選標記基因應用于單子葉植物和雙子葉植物遺傳轉化研究工作中。5.磷酸甘露糖異構酶磷酸甘露糖異構酶(PMI)(manA) 編碼 PMI 的 manA基因最初是從大腸桿菌中分離提取出來的， 目前在酵母、動物及人體中都已分離得到編碼該蛋白的基因。然而， 除肉桂和一些豆類外， 自然界的植物中大都沒有編碼 PMI 的基因， 因此以甘露糖為篩選劑的篩選體系在絕大多數(shù)植物的遺傳轉化中都可以應用。并且被證明對環(huán)境和人體健康都十分安全。但是容易受到培養(yǎng)基或外植體內(nèi)其他糖類水平等生理因素的干擾，因此該篩選體系的完善還有待進一步的研究。6.木糖異構酶木糖異構酶(xy

5、lA) xylA 基因是由赤褐色鏈球菌和嗜熱厭氧桿菌中分離出來的。木糖是半纖維素的主要組成部分， 是生物體內(nèi)含量僅次于葡萄糖的糖類。同甘露糖一樣， 木糖也是許多植物細胞不能代謝利用的糖類， 例如煙草、馬鈴薯和番茄不能用 D- 木糖作為唯一碳源。然而木糖異構酶(D- sylose ketol- isomerse)可以催化木糖成為 D- 木酮糖， D-木酮糖可作為碳源。這種篩選方法比 nptII 基因的篩選效率高 10 倍左右， 并且發(fā)芽更快。研究證明這種酶是生物安全的并且在食品工業(yè)中得到普遍應用。7.擬南芥擬南芥 ATP 結合域結合域(ABC)轉運蛋白轉運蛋白 ABC 蛋白是植物中普遍存在的蛋白

6、質(zhì)。在 ABC 蛋白質(zhì)家族中它們有 30%40%的結構是相似的。擬南芥 ABC 轉運蛋白是依據(jù)它們結構域的同源性來分類的， 但是它們的功能還不是很清楚。植物基因 Atwbc19(2 178 bp)編碼一種特殊的擬南芥 ABC 轉運蛋白， 這種蛋白可使轉基因植株具有卡那霉素的抗性。但是這種抗性機制與轉基因煙草用的 CaMV 35S啟動子啟動細菌抗藥基因的表達機制是不同的。由于 ABC轉運蛋白是植物內(nèi)源蛋白， 所以在同樣的抗性基因遺傳轉化工作中 Atwbc19 作為篩選標記可以替代現(xiàn)在應用廣泛的細菌標記基因。因此這種標記基因可能對于農(nóng)業(yè)轉基因研究來說是具有應用價值的。8.色氨酸合酶色氨酸合酶 be

7、ta1(TSB1) 色氨酸(Trp)是一種存在于植物中的必需氨基酸， 它不能在動物中合成。通常狀態(tài)下植物并不合成 Trp， 只有處于傷害環(huán)境等脅迫條件下才誘導合成 Trp。 在植物中，AtTSB1 基因的主要作用是將吲哚和絲氨酸轉變成為 Trp。目前， Hsiao 等研究發(fā)現(xiàn) AtTSB1 基因在植物轉基因中可以作為一種新穎的非抗生素篩選標記， 對 5- 甲基色氨酸(5MT)或重金屬的選擇既簡便又快捷。在含有 75M 5MT 或者300 M CdCl 2 的 MS 培養(yǎng)基上篩選轉化植株效果很明顯。通過以上研究結果得出結論， AtTSB1 轉基因植物中積累Trp 可以限制 Cd 2 + 和其他重

8、金屬的增加， 或者抑制金屬轉運物的活動。因此， 重要的禾本科作物應用 AtTSB1 基因作為篩選標記基因遺傳轉化得到的轉基因植株能夠種植在重金屬污染的土壤中。9.氨基糖苷腺苷酰轉移酶基因氨基糖苷腺苷酰轉移酶基因(aadA) 雙子葉植物葉綠體轉化多采用 aadA 基因， 用壯觀霉素(spectinomycin)進行篩選， 獲得同質(zhì)葉綠體轉化細胞的篩選周期不同受體材料差異很大， 分化植株的前期篩選一般 2 8 個月， 甜菜葉綠體轉化篩選8 個月后才分化植株 。棉花葉綠體轉基因從槍擊受體胚性愈傷到獲得同質(zhì)葉綠體轉基因植株則長達 18 個月 。單子葉禾本科植物對壯觀霉素具有天然抗性， 因此， 水稻葉綠

9、體轉化時 aadA 基因的篩選采用鏈霉素， 鏈霉素的作用機理主要抑制非轉化細胞分化綠苗和根的形成， 愈傷組織階段篩選效果很不明顯， 后期分化綠苗以及生根階段效果才體現(xiàn)出來， 其作為禾本科作物的篩選標記， 效果并不理想。報告基因報告基因 （reporter gene ） 是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因 ，其與目的基因融合后的表達產(chǎn)物可用來標定目的基因的表達調(diào)控。報告基因的基本單元包括啟動子和報告基因兩個部分。其中報告基因編碼易檢測蛋白或酶，而啟動子則調(diào)控序列表達。報告基因的選擇原則報告基因的選擇原則報告基因的產(chǎn)物和蛋白活性的定量檢測方法容易建立，并且快速簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好在被轉染的宿

10、主細胞中不存在報告基因產(chǎn)物或類似的內(nèi)源性物質(zhì)報告基因表達率與目的基因轉錄水平同步1 報告基因的類型和特點報告基因的類型和特點1.1 氯霉素乙酰轉移酶基因（氯霉素乙酰轉移酶基因（ CAT ）氯霉素乙酰轉移酶 基因最早應用于檢測哺乳動物中的基因表達. 作為報告基因，氯霉素乙酰轉移酶基因表達產(chǎn)物比較穩(wěn)定，且在活性很低的水平就能被檢測出來. CAT 能催化氯霉素乙?；磻?，將乙?；鶑囊阴］o酶 A 轉移到氯霉素的 3-羥基位上，再通過測量放射性標記的底物實現(xiàn)量化 . CAT 在真核細胞中的本底很低，結果重現(xiàn)性好且靈敏度高，是真核基因表達調(diào)控研究中最早使用的報告基因之一. 然而，由于依賴放射性元素，存在對

11、操作者和環(huán)境的安全性問題，因此其應用前景受到了一定的限制. 與之類似的報告基因有潮霉素磷酸轉移酶 （HPT ） ，-葡 糖 醛苷酶基因 （GUS ） 等.1.2 - 半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（-galactosidase ） -半乳糖苷酶 是大腸桿菌乳糖操縱子中 lacZ 基因的產(chǎn)物，在遺傳學、 細胞生物學和分子生物學研究中廣泛應用于監(jiān)測和校正轉染效率 . -半乳糖苷酶能催化包括乳糖在內(nèi)的各種半乳糖苷的水解. 大腸桿菌-半乳糖苷酶比較穩(wěn)定，易于檢測且無需放射性元素，相對于CAT 有更好的優(yōu)越性. -半乳糖苷酶根據(jù)所使用的不同底物的情況， 濃度低至 1 amol 都可以被檢測出。1.3 熒

12、光素酶基因（熒光素酶基因（Luc ）熒光素酶 是指能催化不同底物 （如熒光素、 腔腸素等） 發(fā)生氧化使其發(fā)射出熒光的一類酶的總稱。 目前最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶 （BL ） 和螢火蟲熒光素酶 （FL ） 兩大類。FL 的檢測線性范圍寬達 78 個數(shù)量級，檢測靈敏度可達 10 -19 mol（比 CAT 高 100倍） ，現(xiàn)已成為哺乳細胞中的最常使用的報告基因. 高靈敏度、 多用途、 半衰期短、 背景極低和相對簡單的分析方法是螢火蟲熒光蛋白流行使用的主要原因. 常用的檢測熒光素酶的方法有液閃法和光照度計法. 隨著具有膜透過性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的發(fā)現(xiàn)和使用，無需裂解細胞即可檢測酶的

13、活性.1.4 熒光蛋白基因熒光蛋白基因 熒光蛋白家族是從水螅蟲綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)熒光蛋白家族是從水螅蟲綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為量為 2030 kD 的同源性蛋白，包括綠色、的同源性蛋白，包括綠色、 紅色、紅色、 黃色和青色熒光黃色和青色熒光蛋白等。蛋白等。 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 （GFP ） 是其中應用的最多的一種，最初是其中應用的最多的一種，最初是從維多利亞發(fā)光水母是從維多利亞發(fā)光水母 （Aequorea victoria ） 中分離得到中分離得到. 下村修下村修在研究水母的發(fā)光機制時發(fā)現(xiàn)腔腸素在研究水母的發(fā)光機制時發(fā)現(xiàn)腔腸素 （coalenterazine ）

14、 和鈣離子和鈣離子與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白發(fā)藍色熒光，同時激發(fā)與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白發(fā)藍色熒光，同時激發(fā) GFP，使其發(fā)綠色熒光使其發(fā)綠色熒光GFP 是一條由是一條由 238 個氨基酸所組成的單體蛋白，相個氨基酸所組成的單體蛋白，相對分子質(zhì)量為對分子質(zhì)量為 27kD，用，用 395 nm 的紫外光和的紫外光和 475 nm 的藍光激發(fā)，的藍光激發(fā)，可在可在 508 nm 處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物. GFP 相對分子質(zhì)量小、相對分子質(zhì)量小、 熒光穩(wěn)定、熒光穩(wěn)定、 對活細胞無害、對活細胞無害、 檢測方法容檢測方法容易易 ，還

15、可以用流式細胞儀對懸浮細胞進行高靈敏度和特異性檢測，還可以用流式細胞儀對懸浮細胞進行高靈敏度和特異性檢測，加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶等作用均不能使它滅活加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶等作用均不能使它滅活. GFP 的上述諸多優(yōu)點已使其成為眾多報告基因中的后起之秀，被稱為的上述諸多優(yōu)點已使其成為眾多報告基因中的后起之秀，被稱為“活細胞的分子探針活細胞的分子探針” . 然而，然而，GFP 在某些特定的細胞中不表達，在某些特定的細胞中不表達，因此在實驗前需要進行目的細胞和檢測手段的初選因此在實驗前需要進行目的細胞和檢測手段的初選 . 此外，由于野此外，由于野生型生型 GFP 無放大作用，

16、因此它比熒光素酶靈敏度低無放大作用，因此它比熒光素酶靈敏度低. 自從自從 1991 年年 GFP 基因克隆以來，已經(jīng)有多種基因克隆以來，已經(jīng)有多種 GFP 突變體問世，有藍綠色熒光蛋突變體問世，有藍綠色熒光蛋白白 （CFP ） 、 黃色熒光蛋白黃色熒光蛋白 （YFP ） 和藍色熒光蛋白和藍色熒光蛋白 （BFP ） ，它們都顯現(xiàn)出優(yōu)于野生型它們都顯現(xiàn)出優(yōu)于野生型 GFP 的特性的特性2 報告基因的應用報告基因的應用報告基因能實時定量檢測細胞活動和生理化學物質(zhì)的變化情況，并且具有實時性、 非侵入性、可靠性、 易檢測、 可重復性、 高敏感性、 可用于大規(guī)模檢測等優(yōu)點，因此在植物基因工程、動物基因表達

17、調(diào)控、 分子顯影影像學、 啟動子活性分析、 基因轉移分析、 信號轉導通路研究、 受體功能鑒定、細胞毒性檢測、 生物大分子的相互作用、 藥物開發(fā)的生物篩選等諸多領域都有廣泛的應用.2.1 報告基因在植物學研究中的應用報告基因在植物學研究中的應用在植物基因工程研究領域，已使用的報告基因主要是抗菌素抗性基因和編碼催化人工底物形成熒光物質(zhì)的酶基因。前者常用的報告基因有氯霉素乙酰轉移酶基因 （CAT ） 、 新霉素磷酸轉移酶基因 （NPT ） 、 潮霉素磷酸轉移酶基因 （HPT ）以及慶大霉素轉移基因等，后者則包括 -葡糖醛苷酶基因 （GUS ） 、 螢火蟲熒光素酶基因 （Luc ） 和綠色熒光蛋白基因 （GFP ） 等。新霉素磷酸轉移酶基因 （NPT ） 來自大腸桿菌 aphA2 基因，是目前在植物基因轉化中應用最廣泛的選擇標記基因2.2 報告基因在動物學研究中的應用報告基因在動物學研究中的應用在動物基因表達調(diào)控的研究中，經(jīng)常會使用到報告基因. 常用的有氯霉素乙酰轉移酶基因、 -乳糖苷酶基因、 二氫葉酸還原酶基因、 熒光酶基因等. 目前應用較多的是 GFP 的突變體 增強型綠色熒光蛋白 （eGFP ） ，發(fā)射出的熒光強度比GFP 強 435 倍，因此，比 GFP 更適合作為一種報告基因來研究基因表達、 調(diào)控、 細