實驗4細菌革蘭氏染色法

1、Central Laboratory of Biology實驗四實驗四 油鏡的使用及細菌革蘭氏染色法油鏡的使用及細菌革蘭氏染色法微生物學實驗Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University課前提問與目的要求課前提問與目的要求【課前提問課前提問】1.1.油鏡的特點及使用范圍是什么？油鏡的特點及使用范圍是什么？2.2.革蘭氏染色的原理是什么？革蘭氏染色的原理是什么？【目的要求目的要求】1. 1. 學習并掌握油鏡的原理和使用方法；學習并掌握油鏡的原理和使用方法；2. 2. 了解革蘭氏染色原理；

2、了解革蘭氏染色原理；3. 3. 學習并掌握革蘭氏染色的方法。學習并掌握革蘭氏染色的方法。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【基本原理基本原理】1. 1. 油鏡提高分辨率油鏡提高分辨率油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間是隔一層油質。油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間是隔一層油質。如香柏油的折射率如香柏油的折射率n=1.52n=1.52，與玻璃相同。，與玻璃相同。a)a)光線通過不減低視野的照明度；光線通過不減低視野的照明度；b)b)更主要能增加數值孔徑，提高顯微鏡的放

3、大效能。更主要能增加數值孔徑，提高顯微鏡的放大效能。 分辨率分辨率=/2NA =/2NA =光波波光波波 （物鏡的數值孔徑值）（物鏡的數值孔徑值）NA=NA=n nsinsin = =鏡口角的半數鏡口角的半數可知可知n n（介質折射率）對提高顯微鏡的分辯力起著關鍵性的作（介質折射率）對提高顯微鏡的分辯力起著關鍵性的作用。用。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University2. 2. 革蘭氏染色革蘭氏染色革蘭氏染色法可將細菌分成革蘭氏陽性（革蘭氏染色法可將細菌分成革蘭氏陽性（G+G+）和革

4、蘭氏陰性）和革蘭氏陰性（G-G-）兩種類型，細菌對革蘭氏染色的不同反應是由于它們）兩種類型，細菌對革蘭氏染色的不同反應是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。細胞壁的成分和結構不同而造成的。首先利用草酸銨結晶紫初染，所有細菌都會著上結晶紫的藍首先利用草酸銨結晶紫初染，所有細菌都會著上結晶紫的藍紫色。然后利用盧戈氏碘液作為媒染劑處理，由于碘與結晶紫色。然后利用盧戈氏碘液作為媒染劑處理，由于碘與結晶紫形成碘紫形成碘- -結晶紫復合物，增強了染料在菌體中的滯留能力。結晶紫復合物，增強了染料在菌體中的滯留能力。之后用之后用95%95%乙醇作為脫色劑進行處理時，兩種細菌的脫色效果乙醇作為脫色劑進行處理

5、時，兩種細菌的脫色效果不同。不同。【基本原理基本原理】Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University革蘭氏陽性細菌細胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂質含量低，革蘭氏陽性細菌細胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂質含量低，肽聚糖本身并不結合染料，但其所具有的網孔結構可以滯留碘肽聚糖本身并不結合染料，但其所具有的網孔結構可以滯留碘- -結晶紫復合物，現在一般認為乙醇處理可以使肽聚糖網孔收縮結晶紫復合物，現在一般認為乙醇處理可以使肽聚糖網孔收縮而使碘而使碘- -結晶紫復合物滯留在細胞壁，菌體保持原有的藍紫色

6、。結晶紫復合物滯留在細胞壁，菌體保持原有的藍紫色。而革蘭氏陰性細菌細胞壁肽聚糖含量低，交聯度低，壁薄且而革蘭氏陰性細菌細胞壁肽聚糖含量低，交聯度低，壁薄且脂質含量高，乙醇處理時脂質溶解，細胞壁通透性增加，原先脂質含量高，乙醇處理時脂質溶解，細胞壁通透性增加，原先滯留在細胞壁中的碘滯留在細胞壁中的碘- -結晶紫復合物容易被洗脫下來，菌體變?yōu)榻Y晶紫復合物容易被洗脫下來，菌體變?yōu)闊o色，用復染劑（如番紅）染色后又變?yōu)閺腿緞╊伾t）。無色，用復染劑（如番紅）染色后又變?yōu)閺腿緞╊伾t）。【基本原理基本原理】Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sci

7、ences, Hubei Normal University圖圖4-1 4-1 革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞壁比較革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞壁比較Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【實驗用品實驗用品】1.1.菌種：大腸桿菌菌種：大腸桿菌16h16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌萄球菌16h16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.2.試劑：革蘭氏染液，草酸銨結晶紫染液，盧戈氏（試劑：革蘭氏染液，草酸銨結晶紫染

8、液，盧戈氏（LugolLugol）碘）碘液，液，95%95%乙醇，番紅復染液等。乙醇，番紅復染液等。3.3.儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內裝儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架，鑷子，載玻香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架，鑷子，載玻片夾子，載玻片支架，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。片夾子，載玻片支架，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【方法步驟方法步驟】1. 1.

9、涂片：將大腸桿菌（涂片：將大腸桿菌（16h16h）和金黃色葡萄球菌（）和金黃色葡萄球菌（16h16h）分別）分別涂片、干燥、固定。涂片、干燥、固定。2. 2. 染色：染色：1 1）初染：加草酸銨結晶紫一滴（以剛好將菌膜覆蓋為宜），）初染：加草酸銨結晶紫一滴（以剛好將菌膜覆蓋為宜），染色染色1 12min2min后傾去染液，水洗至流出水無色；后傾去染液，水洗至流出水無色；2 2）媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋）媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min1min，傾去碘液，水洗至流出水無色。傾去碘液，水洗至流出水無色。3 3）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水（從邊緣吸，以防

10、擦去菌）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水（從邊緣吸，以防擦去菌體），將玻片傾斜，并襯以白背景，用體），將玻片傾斜，并襯以白背景，用95%95%乙醇滴洗至剛剛無紫乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約色為止，約20203030秒，立即用水沖去乙醇；秒，立即用水沖去乙醇；Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【方法步驟方法步驟】4 4）復染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復染液染色）復染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復染液染色2min2min，水洗，吸去殘水晾干（圖，水洗，吸去殘水晾干

11、（圖4-14-1）。）。3.3.鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4.4.混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。菌混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。菌齡和脫色程度對染色結果影響較大。齡和脫色程度對染色結果影響較大。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【方法步驟方法步驟】A. A. 初染初染B. B. 水洗水洗

12、C. C. 媒染媒染D. D. 水洗水洗E. E. 脫色脫色F. F. 水洗水洗G. G. 復染復染H. H. 水洗水洗I. I. 吸干吸干圖圖4-1 4-1 革蘭氏染色程序革蘭氏染色程序Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【方法步驟方法步驟】獲得本實驗成功的關鍵：獲得本實驗成功的關鍵：1 1）選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染）選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。成紅色而造成假陰性。2 2）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假

13、陽性。）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。3 3）脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，）脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。脫色過度造成假陰性。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University【實驗結果實驗結果】圖圖4-2 4-2 大腸桿菌染色結果大腸桿菌染色結果 圖圖4-3 4-3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合染色結果大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合染色結果Central Laboratory of BiologyCollege o

14、f Life Sciences, Hubei Normal University【注意事項注意事項】涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。過熱（以玻片不燙手為宜）。加熱時使用載玻片夾子及試管夾，以免燙傷。加熱時使用載玻片夾子及試管夾，以免燙傷。使用染料時注意避免沾到衣物上。使用染料時注意避免沾到衣物上。使用乙醇脫色時勿靠近火焰。使用乙醇脫色時勿靠近火焰。實驗后洗手。實驗后洗手。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Nor

15、mal University【實驗報告實驗報告】1. 1. 結果結果1 1）繪出油鏡下觀察的混合區(qū)菌體圖像。）繪出油鏡下觀察的混合區(qū)菌體圖像。2 2）填表）填表 菌名菌名菌體顏色菌體顏色細菌形態(tài)細菌形態(tài)結果（結果（G G+ +,G,G- -）大腸桿菌大腸桿菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌表表4-1 4-1 結果記錄表結果記錄表Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences, Hubei Normal University2. 2. 思考題思考題1 1）革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？）革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？2 2）現有一株未知桿菌，個體明顯大于大腸桿菌，請你鑒定該）現有一株未知桿菌，個體明顯大于大腸桿菌，請你鑒定該菌是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性，如何確定你染色結果的正確菌是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性，如何確定你染色結果的正確性？性？3 3）為什么用老齡菌進行革蘭氏染色會造