多維氣相色譜及其在中藥領(lǐng)域中的研究進展

1、多維氣相色譜及其在中藥領(lǐng)域中的研究進展摘 要：多維氣相色譜是近年來發(fā)展較為迅速的一種色譜分離技術(shù)，其高分辨、高效、高峰容量以及易與質(zhì)譜等其他技術(shù)聯(lián)用等優(yōu)勢正成為研究應用的熱點。多維氣相色譜技術(shù)包含傳統(tǒng)二維氣相色譜法和全二維氣相色譜法，本研究對多維氣相色譜技術(shù)及其近年來在中藥研究中的應用進行了綜述，并對多維氣相色譜的發(fā)展趨勢和前景進行了展望。關(guān)鍵詞：多維氣相色譜；中藥；應用；綜述Developments and Applications of Multidimensional Gas Chromatography In Traditional Chinese MedicineAbstract:

2、The multidimensional gas chromatography (MDGC) is getting affractive due to its advantages, such as high speed and efficiency, and easy combination with other technologies. This review summarized the recent developments of MDGC, comprehensive two-dimensional gas chromatography(GC×GC), and its a

3、pplications in traditional Chinese medicine study. In addition, the prospect and further developments of MDGC were discussed.Key words: multidimensional gas chromatography; traditional Chinese medicine; application; review20世紀，有很多復雜的樣品用常規(guī)的色譜方法不能完全分開，如藥用植物活性成分、石油樣品1-2、植物精油、煙草研究3-7、煤焦油、生物醫(yī)藥樣品等。對這些樣品，人

4、們不得不采用復雜的、可能造成組分損失和變化的前處理方法對樣品進行預處理；或者對氣相色譜進行改進，如頂空氣相色譜法、衍生化氣相色譜法等。即便如此，由于各類樣品提取物的復雜性，單維的色譜分析不可能把所有欲分析的組分完全分離，因此需要發(fā)現(xiàn)具有更高分離能力的分析方法。多維氣相色譜(multidimensional gas chromatography，MDGC)是利用兩根或多根分離機制不同而又互相獨立的色譜柱對樣品進行分離分析的方法8，為中藥成分分析提供了較好的分辨率，通過組合不同的分離模式構(gòu)建多維系統(tǒng)有效地解決了復雜體系樣品的分析問題。本研究對多維氣相色譜技術(shù)及其近年來在中藥研究中的應用進行了綜述，

5、并對多維氣相色譜的發(fā)展趨勢和前景進行了展望。1多維氣相色譜的簡介1.1多維氣相色譜的概念在氣相色譜分析中，一旦遇到難分離的物質(zhì)時，改變固定相的選擇性是首先考慮的因素。因為熱力學上不能分離的成分，無論怎樣改變動力學條件，都不可能實現(xiàn)分離。反過來思考，不同化學成分的理化特性總是有一定的差別的，在非極性色譜柱上不能分離的成分，在極性柱上一般可以得到分離。根據(jù)分離度公式，增加分離度(R)的途徑有兩個，一是增加柱長，但R僅與柱長的平方根成正比，柱長增加2倍，R僅增加1.4倍，保留時間卻延長2倍，事倍功半。所以，增加柱長度不是提高分離度的最佳途徑。二是改變選擇性因子，假如從1.05增加到1.10，R將增加

6、1.9倍。所以，改變選擇性是提高分離度的最佳途徑。但是，對于高度復雜混合物，體系中可能包含不同沸點和不同極性的化合物，更換色譜柱，部分物質(zhì)的分離效果改善后，其他物質(zhì)的分離效果可能變差。所以，要改善總體分離效果，應采用多維氣相色譜(MDGC)。多維氣相色譜的早期開拓者-阿拉巴馬州立大學的Bertsch教授對MDGC的定義是9，兩根獨立控制且極性不同的色譜柱，通過一定的切換手段，將第一根色譜柱的餾分選擇性地轉(zhuǎn)移到第二根色譜柱進行二次分離，從而獲得比單柱更強大的分離能力的分離系統(tǒng)。根據(jù)Bertsch的定義，樣品前處理技術(shù)、GC/MS聯(lián)用等，都不屬于MDGC的范疇。如果沒有切換裝置，僅把兩根色譜柱直接

7、串連起來，也不能算MDGC。因為不同選擇性色譜柱直接連接，僅是一種調(diào)節(jié)總體選擇性的方式，其效果等同于采用混合固定相。1.2多維氣相色譜的操作原理多維氣相色譜的操作原理：一維色譜的某些餾份(t1和t2)，選擇性地轉(zhuǎn)移到二維柱，依靠兩柱選擇性的差異和峰容量的提高，使切割的成分獲得更充分的分離。Giddings10-11等人對多維色譜原理進行過深入研究。Giddings推算，在一維色譜中，即使峰容量提高到兩倍，考慮到隨機因素，基線分離組分最多只能增加37%。采用二維氣相色譜，峰容量將是兩柱的乘積(GC×GC)。假設兩根色譜柱的峰容量為50（中等情況），則二維氣相色譜系統(tǒng)的峰容量約2500，

8、相當于一維色譜具有1000萬個理論塔板。顯然，如此高的分離能力，是常規(guī)的一維色譜不可能達到的。其實，峰容量并不是多維色譜分離的最主要因素，兩柱選擇性差異對分離的貢獻更大。在非極性柱上的重疊成分，到極性柱上一般都可以分開。在多維色譜中，首先需要兩柱分離機制不一樣。如果兩根色譜柱分離機制相同或過于相近，一維色譜上擠在一起的簇峰，轉(zhuǎn)移到二維柱上，仍然可能是一簇峰。1.3多維氣相色譜的分類多維氣相色譜中，應用比較多的是傳統(tǒng)二維氣相色譜法和全二維氣相色譜法。傳統(tǒng)二維氣相色譜法也可簡稱為二維氣相色譜法(Multidimensional gas chromatography，MDGC)無論從理論上還是應用上

9、，均已相當成熟，但仍存在不足之處；全二維氣相色譜法(comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC)發(fā)展比較成熟，已達到了實用水平。1.3.1二維氣相色譜法1984年，Giddings闡釋了傳統(tǒng)二維色譜法的基本理論。通常使用的二維氣相色譜法（GC+GC）一般采用中心切割法進行分析，即從第一根（維）色譜柱預分離后的很小一部分餾分，被再次進樣到第2根（維）色譜柱中進一步分離，而樣品中絕大多數(shù)其他組分被放空或被中心切割。盡管可以增加中心切割的次數(shù)來實現(xiàn)對感興趣組分的分離，但由于組分流出第1柱進入第2柱時，其譜帶已較寬，因此第二維

10、的分辨率會受到損失。另外，第二維的分析速度一般較慢，不能完全利用二維氣相色譜的柱容量，只能實現(xiàn)對部分感興趣組分的分離，無法對所有組分進行準確的定性和定量。1.3.2全二維氣相色譜法全二維氣相色譜是把分離機理不同且互相獨立的兩根色譜柱以串聯(lián)方式結(jié)合成的二維氣相色譜，兩根色譜柱由調(diào)制器連接，調(diào)制器起捕集、聚焦、再傳送的作用。從一維柱流出的每一段餾分，都經(jīng)調(diào)制器調(diào)制后再以脈沖方式送到二維色譜上分離，是全部的而不是部分的樣品轉(zhuǎn)移。在全二維氣相色譜分析中，餾分轉(zhuǎn)移周期一般為2-10秒，二維分離必須在2-10秒之內(nèi)完成，否則不同餾分將重疊，導致分析徹底失敗。二維色譜柱必須具備極快的分離速度，其特點必然是短

11、、細和薄液膜。二維柱不能太短，一般不宜小于lm，否則分離能力太差。二維柱也不能太細，以0.1mm內(nèi)徑居多，否則阻力太大，影響載氣流量。二維柱固定相液膜也不能太薄，一般不宜低于0.1µm，否則柱容量太小，過載導致分離度急劇變差。全二維氣相色譜的工作模式很像GC/MS。第二維色譜柱的快速分離，類似質(zhì)譜儀的快速掃描；第二維的色譜圖，類似全掃描質(zhì)譜圖12。檢測器檢測到的響應信號經(jīng)數(shù)據(jù)采集軟件處理后，得到三維色譜圖（x軸表示的是第1維柱的保留時間，y軸表示的是第2維柱的保留時間，z軸表示的是色譜峰的強度），或者是二維輪廓圖。1.3.3技術(shù)優(yōu)勢和劣勢比較12傳統(tǒng)二維氣相色譜法（MDGC）和全二維

12、氣相色譜法（cMDGC）各有優(yōu)勢和不足。MDGC的優(yōu)勢包括：(l)二維柱為常規(guī)毛細柱，不局限于快速柱，二維分離能力更高。(2)對于復雜體系中的目標成分， MDGC/MS可提供具有更好的定性定量結(jié)果。(3)對復雜體系中旋光物質(zhì)，采用常規(guī)手性GC柱，MDGC可提供更好的分離效果。(4)MDGC對檢測器沒有任何特殊要求，所有的GC檢測器都可以使用。(5)MDGC不需要特別的數(shù)據(jù)處理技術(shù)。MDGC的缺點包括：(1)樣品全分析需要多次進樣，耗時較長。(2)系統(tǒng)構(gòu)造復雜，毛細柱、限流管、中點限流器、監(jiān)視檢測器、分析檢測器等連接復雜，常常讓新手望而生畏。(3)方法開發(fā)手續(xù)復雜。系統(tǒng)載氣流量需精心調(diào)節(jié)，限流管

13、載氣流量必須和分析柱一致，限流管規(guī)格選擇較麻煩。是在分析柱和質(zhì)譜儀相聯(lián)的情況下，分析柱流量只能用軟件計算，無法直接測量。作為GC的最新進展，cMDGC的優(yōu)勢十分明顯，包括：(1)峰容量最高，是真正意義上的GC×GC。(2)全分析速度快。只需1次進樣，一個小時左右就可以完成全分析。(3)系統(tǒng)簡單，柱安裝、載氣流量設定都比MDGC簡便。(4)靈敏度高。毫秒級峰寬，信噪比大大提高，靈敏度大大提高。理論上比一維GC高20-50倍，實際上可提高5倍左右。(5) GC×GC-TOF-MS-Deconvolution，構(gòu)成4D分析，產(chǎn)生極其強大的分離、定性和定量能力。(6)定量結(jié)果更可靠

14、。強大的分離能力，大大降低本底干擾，提高定量準確度。(7)化合物族類分析功能。一維非極性柱按沸點或分子量分離，二維極性柱按官能團或極性分離，方便考察混合物中的同系物。全二維氣相色譜也存在不足。包括：(1)二維柱分離能力有限，因為只能用快速柱。(2)目標成分以及手性成分的分析不如MDGC。(3)二維柱的極性不能太強，強極性柱保留太強，影響分離速度柱。這時，不得不犧牲固定液選擇性這個最重要的分離因素。(4)對高沸點成分有一定局限，因為保留太強，可能影響二維分離速度。(5)對檢測器有一定要求，采樣速度必須足夠快，只有TOF、FID、微升池ECD等好用，NPD、AED、SCD、Q-MS等檢測器多少存在

15、一定問題。(6)數(shù)據(jù)處理技術(shù)高度復雜，數(shù)據(jù)解析成為瓶頸。(7)儀器昂貴，液氮消耗速度快。(8)實際應用效果反映，對復雜體系的分析能力低于預期。2多維氣相色譜技術(shù)和儀器的新進展2.1閥切換的多維毛細管氣相色譜系統(tǒng)隨著切換閥硬件的完善，死體積縮至微升級，溫度達320，聚酰亞胺、聚四氟等閥芯材料的活性相對較低，這些都為多維毛細管多維氣相色譜提供了更好的基礎(chǔ)。1998年，意大利Messina大學的L.Mendello等人13在2臺島津GC-14BGC的基礎(chǔ)上，采用Valco公司的1/32英寸六通閥，構(gòu)建了一套閥切換的MDGC系統(tǒng)。六通閥置于一個加熱的模塊中，可以避免組分冷凝，減少吸附。整個系統(tǒng)全自動，

16、兩臺GC也可單獨使用，互不影響。2.2 Deans壓力切換的多維毛細管氣相色譜系統(tǒng)多維氣相色譜走過了一條曲折的發(fā)展過程。80年代出現(xiàn)第一次高潮，當時人們把多維氣相色譜形容為“氣相色譜的一次革命”，“不亞于從填充柱到毛細柱的變革”，從此“將是多維氣相色譜的天下”。但是，GC/MS聯(lián)用的迅速發(fā)展，沖淡了多維氣相色譜的緊迫性和必要性。另外，當時的多維氣相色譜系統(tǒng)的自動化程度較低，很多是獨立的外部控制器，方法開發(fā)較為復雜。所以，多維氣相色譜90年代逐漸沉寂下來。大約在2000年之后，多維氣相色譜似乎又現(xiàn)高潮，儀器迅速增多，至少有7家公司提供多維氣相色譜整機或附件。盡管儀器構(gòu)造各式各樣，但原理上均屬于D

17、eans壓力切換。提供整機的公司包括：美國Mieroanalyties公司、德國Gerstel公司、日本島津公司、美國瓦里安公司等。提供成套升級附件的公司有澳大利亞SGE、美國安捷倫公司、美國PE公司等。所有系統(tǒng)都實現(xiàn)了自動化，控制軟件嵌入氣相色譜主機軟件中，所有參數(shù)均可在色譜軟件中設定，具備全自動和序列分析功能。特別值得一提的是，在儀器硬件方面出現(xiàn)重大創(chuàng)新。2007年，安捷倫公司首先推出了微板流路技術(shù)(capillary flow technology)，利用光電雕刻技術(shù)，在兩片不銹鋼平板上刻劃出毛細管氣路，然后將板粘合起來，制成Deans切換裝置。系統(tǒng)死體積更小，毛細柱安裝更簡便，活性較低

18、（不銹鋼經(jīng)過硅烷化處理）。2009年，美國PE公司新推出的Deans切換系統(tǒng)，也采用了微板流路技術(shù)。3多維氣相色譜在中藥研究中的應用中藥作為天然產(chǎn)物，組成十分復雜，組分間含量差異很大，并且在復方中藥制劑中，數(shù)種中藥材配伍使用，增加了質(zhì)量控制及分析研究的難度。武建芳等14建立了分析莪術(shù)揮發(fā)油組成的全二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，實現(xiàn)了莪術(shù)揮發(fā)油的單個組分與族組分分析，鑒定出匹配度大于800的組分有249種，其中單萜18種，單萜含氧衍生物34種，倍半萜35種，倍半萜含氧衍生物37種，有69種組分的體積分數(shù)>0.02%。武建芳等15還對連翹揮發(fā)油的組成分析建立了全二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。連翹

19、揮發(fā)油組成復雜，且大部分組分為痕量組分。通過優(yōu)化色譜條件，使得組分的分離得到大大改善，同時鑒定出更多痕量組分，鑒定的匹配度大于800的組分有220種，多于以往的文獻報道。Qiu等16分別使用兩種檢測器，對來自5個不同產(chǎn)地的15個羌活揮發(fā)油樣品進行定性和定量分析，其中四川產(chǎn)道地羌活定性鑒別出相似度大于800的組分共769個。結(jié)合程序升溫，各揮發(fā)油樣品均可以得到包含組分結(jié)構(gòu)信息的二維譜圖，根據(jù)單萜、單萜含氧衍生物、倍半萜、倍半萜含氧衍生物等四類物質(zhì)實現(xiàn)了明顯的族分離。各產(chǎn)地羌活揮發(fā)油樣品的定性定量結(jié)果顯示，四川產(chǎn)道地羌活揮發(fā)油的化學成分與其他4個產(chǎn)地的藥材相比有很大差異，其中以單萜類和倍半萜含氧衍

20、生物類成分的含量差異最為顯著。對15個樣品的分析數(shù)據(jù)進行主成分分析，獲得了滿意的聚類結(jié)果，并且找到20個對聚類分析影響最為顯著的化合物，即導致不同產(chǎn)地羌活揮發(fā)油的化學成分差異的標記物均屬于單萜類或倍半萜含氧衍生物類化合物，與定性定量分析結(jié)果相一致。Dimandja等17應用MDGC技術(shù)對薄荷油和荷蘭薄荷油進行分析，并與氣相-質(zhì)譜聯(lián)用方法進行比較，發(fā)現(xiàn)薄荷醇、薄荷酮為薄荷油的主要成分，而香芹酮、薄荷醇和檸檬烯則為荷蘭薄荷油的主要成分，并且證實了全二維氣相色譜用于揮發(fā)油分析的優(yōu)越性。除此之外，采用多維氣相色譜系統(tǒng)對黃花蒿18、薄荷19等中藥的化學成分進行分析研究，同樣取得了應用傳統(tǒng)一維氣相色譜無法

21、企及的分離效果。4展望多維氣相色譜已經(jīng)在成分復雜的中藥研究中發(fā)揮了重要作用。相信隨著色譜儀器技術(shù)的不斷進步，MDGC在動態(tài)分析范圍、分離能力、分析通量和檢測靈敏度等方面還會有更大的發(fā)展，為解決復雜中藥分析體系的一些關(guān)鍵問題發(fā)揮不可替代的作用20-21。如上所述，由于MDGC采用柱結(jié)合模式、調(diào)制器的設計對樣品的分離效果及整個系統(tǒng)的性能都有較大影響，因此設計和優(yōu)化適合的調(diào)制器是今后MDGC研究的一個熱點問題。不同分離模式之間的匹配組合、與質(zhì)譜的聯(lián)用和自動化分析等同樣也是MDGC研究的重要內(nèi)容和方向22。Deans壓力切換技術(shù)仍將是今后多維氣相色譜的主流方向。隨著對復雜系統(tǒng)分析要求的不斷提高，隨著多

22、維氣相色譜系統(tǒng)的自動化、一體化的發(fā)展，多維氣相色譜的應用將進一步擴展。多維氣相色譜的使用將更加簡便，效率更高23。對于中藥研究，多維氣相色譜在目標物分析、手性分析等方面可發(fā)揮更大的作用。參考文獻：1 花瑞香,阮春海,王京華,等.全二維氣相色譜法用于不同石油餾分的族組成分布研究J.化學學報,2002,60(12):2185-2191.2 李艷艷.全二維氣相色譜用于輕質(zhì)石油餾分中芳烴含量的測定J.色譜,2006,24(4):380-384.3 李海峰,路鑫,鹿洪亮,等.全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)用于煙葉中酸性成分的分離與分析J.高等學?；瘜W學報,2006,27

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