亞硝化菌的種類

1、 亞硝化菌的種類，生長(zhǎng)特性，亞硝化過(guò)程與機(jī)理 摘要：從亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)特性出發(fā)，主要介紹了亞硝化細(xì)菌的種類，包括亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化弧菌屬，并探討了亞硝化過(guò)程中的氧化和生化機(jī)理。 關(guān)鍵詞：亞硝化菌，亞硝化作用，機(jī)理 1 亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)特性 亞硝化細(xì)菌又叫氨氧化細(xì)菌，有自養(yǎng)型與異氧型之分，一般認(rèn)為自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌是硝化作用的主要菌群。所有自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌，都是革蘭氏陰性細(xì)菌，自養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，以氨為唯一能源，以CO2為唯一碳源；混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，可同化有機(jī)物質(zhì)。亞硝酸細(xì)菌的生長(zhǎng)極為緩慢。在適宜的條件下需 24h 才能完成一次分裂周期。在進(jìn)行固體培養(yǎng)的過(guò)程中一般

2、需數(shù)月才能見到菌落生長(zhǎng)1。亞硝酸細(xì)菌喜歡微偏堿性的環(huán)境，適合大多數(shù)氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)的條件為：溫度25-30，pH 7.5-8.0，氨濃度2-10mmol/L。倍增時(shí)間8小時(shí)至數(shù)天。在純培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中若加入有機(jī)物質(zhì)如酵母提取物等將會(huì)抑制亞硝酸細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此在進(jìn)行亞硝酸細(xì)菌的分離培養(yǎng)時(shí)所培養(yǎng)分離的細(xì)菌的純度可利用在培養(yǎng)基中加入(酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等)有機(jī)物的方法進(jìn)行檢測(cè)2。但是自然環(huán)境中有機(jī)物質(zhì)對(duì)亞硝酸細(xì)菌的影響不如在純培養(yǎng)中的大大亞硝酸細(xì)菌對(duì)污水組成、pH和溫度等的改變都敏感3。 2亞硝酸細(xì)菌的分類 亞硝酸細(xì)菌的分類主要根據(jù)細(xì)菌形態(tài)的表型特征、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)膜的分布及它們16SRNA 序列的

3、同源性。1984-1989 年的伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)把硝化細(xì)菌分為九個(gè)屬：硝化桿菌屬、硝化刺菌屬、硝化球菌屬、硝化螺菌屬、亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬和亞硝化弧菌屬等。而目前則傾向于把亞硝酸細(xì)菌分為兩個(gè)單一細(xì)胞起源的群體，它們分別屬于變形菌綱的亞綱和亞綱。在對(duì)這兩個(gè)亞綱的亞硝酸細(xì)菌作進(jìn)一步的分類時(shí)，不同的學(xué)者還有些細(xì)微的差別。Votek 等認(rèn)為除了海洋亞硝酸球菌屬于變形菌亞綱外，其它的亞硝酸細(xì)菌即亞硝酸單孢菌和亞硝酸螺旋菌兩個(gè)種群屬于變形菌亞綱。其中亞硝酸單孢菌包括歐洲亞硝酸單孢菌和亞硝酸運(yùn)動(dòng)球菌，亞硝酸螺旋菌包括亞硝酸螺旋菌屬、亞硝酸顫菌屬和亞硝酸葉菌屬2。這種分

4、類方法可用圖1表示。 圖1 Votek 亞硝酸細(xì)菌分類法 Philips等認(rèn)為海洋亞硝化球菌和 N. halophilus屬于變形菌亞綱，其它的亞硝酸細(xì)菌屬于變形菌亞綱，包括亞硝化單孢菌屬和亞硝化螺旋菌屬4。 Juretschko 同樣認(rèn)為海洋亞硝化球菌和 N.halophilus 屬于變形菌亞綱，但是他認(rèn)為于變形菌亞綱亞硝酸細(xì)菌應(yīng)包括四個(gè)屬，即亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化 葉菌屬和亞硝化弧菌屬，而且后三個(gè)屬彼此關(guān)系密切5。 除了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)外，其它能把氨氧化成亞硝酸的細(xì)菌屬包括亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化球菌屬 （Nitrosococ

5、cus）、亞硝化 弧 菌 屬 （Nitrosovibrio）、亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）、亞硝化膠團(tuán)菌屬（Nitrosogloea）、亞硝化囊菌屬（Nitrosocystis）。土壤生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化螺菌屬。海洋生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬。鹽湖生境中則有亞硝化單胞菌屬6。 2.1亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) 7 在亞硝化單胞菌屬中，N.europaea是最早被分離并描述的種。除此以外，已確定的種還有8個(gè)，隨著研究的深入，新種還會(huì)繼續(xù)增加。 亞硝化單胞菌屬菌株呈桿狀或橢球狀。菌體單生，很少成鏈

6、。菌體游離或包埋在黏液內(nèi)。細(xì)胞有內(nèi)膜，呈扁平泡囊，分布于四周。革蘭氏染色陰性，好氧生長(zhǎng)。生長(zhǎng)溫度范圍5-30 ，最適生長(zhǎng)溫度30左右。生長(zhǎng)pH值范圍5.8-8.5,最適生長(zhǎng)Ph值范圍7.5-8.0。能量(主要指ATP)和還原力主要指NAD(P)H2來(lái)源于氨的氧化。許多菌株產(chǎn)生脲酶，能夠利用尿素。以CO2為碳源，進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)；細(xì)胞擁有羧酶體(carboxysome)，內(nèi)含Calvin循環(huán)中固定CO2的關(guān)鍵酶二磷酸核酮糖羧化酶。也能以CO2或有機(jī)物作為碳源，進(jìn)行混養(yǎng)（混合營(yíng)養(yǎng)）生長(zhǎng)，但不能以有機(jī)物作為碳源，進(jìn)行異氧生長(zhǎng)。細(xì)胞產(chǎn)生豐富的細(xì)胞色素，使細(xì)胞懸液呈黃色或紅色。強(qiáng)光照和高氧分壓可抑制生長(zhǎng)。

7、2.2亞硝化球菌屬(Nitrosococcus) Nitrosococcus包含N.oceanus、N.mobilis和N.halophilus三個(gè)種。菌體呈球狀至橢球狀，可以是單球菌、雙球菌和四聯(lián)球菌，常包埋于黏液內(nèi)而形成菌膠團(tuán)。細(xì)胞有內(nèi)膜，呈扁平泡囊，分布于四周或堆積于中央。革蘭氏染色陰性。依靠叢生鞭毛或單生鞭毛運(yùn)動(dòng)。好氧生長(zhǎng)。生長(zhǎng)溫度范圍5-30，最適生長(zhǎng)溫度30左右。生長(zhǎng)pH 范圍6.0-8.0，最適生長(zhǎng)Ph 范圍7.5-8.0。能量和還原力來(lái)源于氨的氧化。一些菌株產(chǎn)生脲酶，能夠利用尿素，能自養(yǎng)生長(zhǎng)，也能混養(yǎng)生長(zhǎng)，但不能異樣生長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)含有豐富的細(xì)胞色素，使細(xì)胞懸液呈黃色或紅色。 2.

8、3亞硝化螺菌屬(Nitrosospira) Nitrosospira只有N.briensis一個(gè)種。菌體呈螺旋狀，有3-20圈。細(xì)胞沒有內(nèi)膜，也沒有羧酶體。革蘭氏染色陰性。好氧生長(zhǎng)。生長(zhǎng)溫度范圍20-35。生長(zhǎng)pH范圍7.0-8.0。能量和還原力來(lái)源于氨的氧化。嚴(yán)格自養(yǎng)生長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)含細(xì)胞色素，但不含其他色素。 2.4亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus) Nitrosolobus只有N.multiformis一個(gè)種。菌體形態(tài)多樣，裂片形細(xì)胞被內(nèi)陷的細(xì)胞膜分隔，每個(gè)細(xì)胞有1-4個(gè)中心小室，其外面有5-20個(gè)膜結(jié)合的小室環(huán)繞。以縊縮的方式分裂。革蘭氏染色陰性。好氧生長(zhǎng)。能量和還原力來(lái)源于氨的氧化

9、。主要自養(yǎng)生長(zhǎng)，也能混養(yǎng)生長(zhǎng)，但不能異樣生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度25-30。最適生長(zhǎng)pH 7.5。 2.5亞硝化弧菌屬(Nitrosmdbrio) Nitrosmdbrio只有N.tenuis一個(gè)種。菌體細(xì)長(zhǎng)弧狀，細(xì)胞沒有內(nèi)膜，羧酶體不明顯。革蘭氏染色陰性。嚴(yán)格好氧生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)Ph 范圍7.5-7.8。能量和還原力來(lái)源于氨的氧化。主要自養(yǎng)生長(zhǎng)，也能混養(yǎng)生長(zhǎng)，但不能異樣生長(zhǎng)。 表1 各種氨氧化細(xì)菌的特征 特 征 亞硝化單胞菌屬 (Nitrosomonas) 亞硝化球(Nitrosococcus) 亞硝化螺菌屬 (Nitrosospira) 亞硝化葉菌屬 (Nitrosolobus) 亞硝化弧菌屬 (

10、Nitrosmdbrio) 形 態(tài) 桿狀至橢球狀 球狀至橢球狀 緊密螺旋狀 多形狀 細(xì)長(zhǎng)弧狀 鞭 毛 極生至偏極生 叢生或單生 周生 周生 極生至偏極生 細(xì)胞內(nèi)膜排列方式 呈扁平泡囊，分布于四周 呈泡囊分布于四周或堆積于中央 無(wú)內(nèi)膜 使細(xì)胞分隔 無(wú)內(nèi)膜 菌體大小 (0.7-1.5)* (1.0-2.4) (1.5-1.8)* (1.7-2.5) (0.3-0.8)* (1.0-8.0) (1.0-1.5)* (1.0-2.5) (0.3-0.4)* (1.1-3.0) G+C/% 47.4-51.0 50.5-51 54.1 53.9-59.1 54 時(shí)代時(shí)間/h 8-12 24 Ch.A 化

11、能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 儲(chǔ)存物 多聚磷酸 肝糖，多聚磷酸 肝糖，多聚磷酸 細(xì)胞色素,色素 淡黃至淡紅 淡黃至淡紅 淡黃至淡紅 淡黃至淡紅 pH值范圍 5.8-8.5 8.0-9.0 8.5-9.5 8.2-9.0 7.5-7.8 溫度范圍/ 5-30(25-30)1 2-30 15-30(20-35)1 15-30 25-30 -52 1:為最適溫度范圍；2:為最低溫度范圍。 3亞硝化反應(yīng)過(guò)程與機(jī)理 亞硝化作用則是硝化作用從 NH4+ 或NH3到 NO2- 的反應(yīng)過(guò)程，是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，由氨氧化細(xì)菌（NH3-oxidizers，又被稱為初級(jí)硝化細(xì)

12、菌primary nitrifiers）、亞硝化細(xì)菌 （ammonia-oxidizingbacteria）來(lái)完成。 生化氧化8： NH4+ + 1.5O2 + 2HCO3- 亞硝酸菌 NO2- + 2H2CO3 + （240-350kJ/mol） （1） 生化合成： 13NH4+ + 23HCO3- 亞硝酸菌 10NO2- + 8H2CO3 + 3C5H7NO2 + 19H20 （2） 則第一階段的總反應(yīng)式（包括氧化和合成）為： 55NH4+ + 76O2 +109HCO3- 亞硝酸菌 C5H7NO2 + 54NO2- +104H2CO3 + +57H20 （3） 氨氧化細(xì)菌是一類化能自養(yǎng)型

13、細(xì)菌，氨是其進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)的唯一能源。從熱力學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，亞硝化細(xì)菌利用的基質(zhì)為低級(jí)能源。相對(duì)于呼吸鏈上的電子載體而言，氨氧化的氧化還原電位值E0(NO2- / NH4+)= 340 mV，氧化磷酸化效率很低，所能產(chǎn)生的ATP非常有限。 亞硝化細(xì)菌中不存在基質(zhì)水平磷酸化，它們依靠氧化磷酸化來(lái)貯存能量。在 25 ，pH 7 的條件下，NH3 氧化為NO2- 的吉布斯自由能為 -274.7 kJ·(mol N)-1，即使全部轉(zhuǎn)化為 ATP，最多僅產(chǎn)生8.4 mol ATP·(mol NH4+)-1。NH3氧化所釋放的電子只能傳遞給呼吸鏈上較低端的物質(zhì)，因此NH3的氧化反應(yīng)不可能直接

14、耦聯(lián)到呼吸鏈上第一個(gè)成分煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotine amide dinucleotide,NAD )的還原反應(yīng)，能量不得不用于使電子躍遷到這一較高能級(jí)，即用于所謂的逆電子流過(guò)程中。這些因素使得亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)很緩慢，世代期為836 h，經(jīng)過(guò)710 d的培養(yǎng)菌落很微小，大多直徑在100m 左右。利用相同數(shù)量的能量，亞硝化單胞菌所產(chǎn)生的細(xì)胞物質(zhì)僅為異養(yǎng)菌的 1 %4 %，這是因?yàn)樾枰腁TP和還原力來(lái)還原CO26。 但從生化水平上看，硝化作用遠(yuǎn)非如此簡(jiǎn)單，它涉及多種酶催化的代謝途徑，并伴隨著 復(fù)雜的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化。 在亞硝化細(xì)菌的作用下, 氨轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛岬难趸^(guò)程中, 氮原子價(jià)從-3

15、變至+3, 電子的移動(dòng)達(dá)6個(gè), 故必然會(huì)有中間產(chǎn)物, 但中間產(chǎn)物究竟有幾個(gè), 現(xiàn)仍不大清楚現(xiàn)已證明, 其中一種中間體是羥胺（NH2OH），認(rèn)為由羥胺進(jìn)一步氧化成亞硝酸必需經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段, 即羥胺脫氫形成像硝酰(NOH)那樣的氧化態(tài)中間體, 然后在酶的作用下由硝酰轉(zhuǎn)變成亞硝酸。而亞硝酸在硝化細(xì)菌的作用下可直接氧化成NO3-9。亞硝化作用涉及多種酶催化的代謝途徑，即為：NH 3 氨單加氧酶 NH 2 OH 羥胺氧還酶 NO 羥胺氧還酶 NO2- 。 氨氧化為羥胺的生化反應(yīng)可表示為7 ： NH3 + 0.5O2 NH2OH G = +17 kJ/ mol （4） 0.5O2 +2H+ +2e- H2O

16、 G = -137 kJ/ mol （5） NH3 + O2 + 2H 氨單加氧酶 NH2OH + H2O G = -120kJ/ mol （6） 根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的自由能變化判斷，在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，氨的羥化反應(yīng)不易進(jìn)行（4）式；需要氧的還原反應(yīng)（5）式來(lái)拉動(dòng)。只有當(dāng)兩個(gè)反應(yīng)耦合時(shí)（6）式氨的氧化才能順利進(jìn)行。 羥胺氧化成亞硝酸鹽被認(rèn)為是一個(gè)分兩步進(jìn)行的反應(yīng)，中間產(chǎn)物可能是與酶結(jié)合的HNO，也可能是NO。羥胺氧化為亞硝酸鹽的生化反應(yīng)可表示為7 ： NH2OH + 5H2O HNO2 + 4H+ +4e- G =+23 kJ/ mol 0.5O2 + 2H+ + 2e- H2O G =-137 kJ/

17、mol NH2OH +0.5O2 羥胺氧還酶 HNO2 + 2H+ + 2e- G =-114 kJ/ mol 首先在氨單加氧酶( AMO)的催化下將氨氧化成羥氨，再經(jīng)羥氨氧化還原酶（HAO）的催化下將羥氨氧化成亞硝酸，進(jìn)而由硝化細(xì)菌的亞硝酸鹽氧化還原酶催化形成硝酸10。 圖2 亞硝化菌的氨氧化機(jī)制 參考文獻(xiàn) 1 Nejidat A ,et al. Isolation and characterization of a functional promoter from Nitrosrmonas europaea J . FEMS Microbiol Lett , 1996 ,137 :912.

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