第26章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)

1、貴陽醫(yī)學(xué)院貴陽醫(yī)學(xué)院 潘衛(wèi)潘衛(wèi)第二十六章第二十六章酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第2頁教學(xué)目標(biāo)與要求教學(xué)目標(biāo)與要求 掌握掌握酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)定義、分類及其應(yīng)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)定義、分類及其應(yīng)用原理；用原理；UAUA、BILBIL、尿素、肌酐、葡萄糖、糖化、尿素、肌酐、葡萄糖、糖化血清蛋白、血清蛋白、TGTG、TCHTCH、HDL-CHDL-C、LDL-CLDL-C、TBATBA酶促反應(yīng)法測定的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)與注意事項。酶促反應(yīng)法測定的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)與注意事項。 熟悉熟悉酶促反應(yīng)法測

2、定其它生物化學(xué)物質(zhì)的原理及其優(yōu)酶促反應(yīng)法測定其它生物化學(xué)物質(zhì)的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)與注意事項。缺點(diǎn)與注意事項。 了解了解上述酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)的方法學(xué)評價，上述酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)的方法學(xué)評價，以及其方法的歷史演變。以及其方法的歷史演變。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第3頁 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 酶反應(yīng)前后光吸收變化測定法酶反應(yīng)前后光吸收變化測定法脫氫酶指示系統(tǒng)測定法脫氫酶指示系統(tǒng)測定法過氧化物酶指示系統(tǒng)測定法過氧化物酶指示系統(tǒng)測定法酶循環(huán)測定法酶循環(huán)測定法 酶激活和酶抑制測定法酶激活和酶抑制測定法第3頁第一節(jié)第一節(jié) 酶反應(yīng)前后光吸收變化測定法酶

3、反應(yīng)前后光吸收變化測定法一、血清尿酸測定一、血清尿酸測定1利用吸光度的利用吸光度的差值計算差值計算物質(zhì)的物質(zhì)的含量含量二、血清膽紅素測定二、血清膽紅素測定第4頁第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第5頁第5頁尿酸（尿酸（UAUA）的酶法測定的酶法測定包括包括尿酸氧化酶法尿酸氧化酶法、尿酸酶紫外法尿酸酶紫外法、尿酸氧化尿酸氧化酶傳感器檢測法酶傳感器檢測法等。由于各種方法受試劑、儀等。由于各種方法受試劑、儀器等不同的影響，各方法之間的檢測結(jié)果偏差器等不同的影響，各方法之間的檢測結(jié)果偏差較大，結(jié)果之間缺乏可比性。目前，臨床上主較大，結(jié)果之間缺乏可比性。目前，臨床

4、上主要采用要采用尿酸氧化酶法尿酸氧化酶法和和酶紫外法酶紫外法測定。測定。一、一、血清尿酸血清尿酸（UAUA）測定）測定尿酸氧化酶法尿酸氧化酶法根據(jù)血清尿酸在尿酸酶的作用下生成尿囊素及根據(jù)血清尿酸在尿酸酶的作用下生成尿囊素及H H2 2O O2 2，生成的生成的H H2 2O O2 2與與4 4AAAA和和TOOSTOOS在在PODPOD的作用下最終生成紫的作用下最終生成紫紅色的醌亞胺，其顏色深淺與尿酸含量成正比。紅色的醌亞胺，其顏色深淺與尿酸含量成正比。OHTOOSAAOHOHCOOOHPOD222222224 紫紅色醌亞胺尿囊素尿酸尿酸酶第6頁第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)

5、酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第7頁第7頁尿酸紫外法尿酸紫外法利用尿酸在利用尿酸在282-292nm282-292nm處有特異吸收峰，在尿酸酶作用處有特異吸收峰，在尿酸酶作用下，生成產(chǎn)物在此波長范圍無吸收峰，因此，在此波下，生成產(chǎn)物在此波長范圍無吸收峰，因此，在此波長下測量酶作用前后的吸光度之差，便可計算血清尿長下測量酶作用前后的吸光度之差，便可計算血清尿酸的含量，該法為目前臨床實驗室的最佳方法。酸的含量，該法為目前臨床實驗室的最佳方法。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第8頁本方法需要高質(zhì)量石英比色皿，在使用紫外分光光度計本方法需要高質(zhì)量石英比色皿，在使用

6、紫外分光光度計前需對其波長進(jìn)行校正，還要注意控制反應(yīng)條件即溫度、前需對其波長進(jìn)行校正，還要注意控制反應(yīng)條件即溫度、時間及溶液的時間及溶液的pHpH值等；值等；第8頁自動生化分析儀通常不具備自動生化分析儀通常不具備290nm290nm左右的檢測波長，因而左右的檢測波長，因而該法在臨床實驗室基本沒有采用。該法在臨床實驗室基本沒有采用。尿酸酶紫外法的特異性和抗干擾性好，標(biāo)本用量少，無尿酸酶紫外法的特異性和抗干擾性好，標(biāo)本用量少，無需制備無蛋白濾液，而且方法簡便快速；需制備無蛋白濾液，而且方法簡便快速；血清尿血清尿酸（酸（UAUA）測定測定方法性能評價方法性能評價二、血清膽紅素測定二、血清膽紅素測定膽

7、紅素氧化酶法膽紅素氧化酶法 膽紅素呈黃色，在膽紅素呈黃色，在450nm450nm處有最大吸收峰，膽紅素氧化酶催處有最大吸收峰，膽紅素氧化酶催化膽紅素氧化形成膽綠素，隨著膽紅素被氧化，膽紅素在化膽紅素氧化形成膽綠素，隨著膽紅素被氧化，膽紅素在450nm450nm處吸光度下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關(guān)。在處吸光度下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關(guān)。在pHpH為為8.08.0的條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測的條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測450nm450nm吸光度的下降值反映的是總膽紅素的含量。吸光度的下降值反映的是總膽紅素的含量。第二十六章第二十六章

8、 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第10頁第10頁該法解決了長期以來用重氮反應(yīng)法測定膽紅素條件該法解決了長期以來用重氮反應(yīng)法測定膽紅素條件的不同，包括試劑種類和濃度不同以及反應(yīng)時間不同的不同，包括試劑種類和濃度不同以及反應(yīng)時間不同而造成測定值變異大的問題；而造成測定值變異大的問題；第10頁特別是對于特別是對于CBCB，由于，由于 BOD BOD僅對血清僅對血清CB CB 進(jìn)行選擇性氧進(jìn)行選擇性氧化化, , 而不對而不對-膽紅素和膽紅素和UB UB 發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)生氧化反應(yīng), , 因此反應(yīng)因此反應(yīng)具有較好的特異性。具有較好的特異性。酶法特異性高，重復(fù)性較好；酶法特異性高，重復(fù)

9、性較好；血清膽紅素測定血清膽紅素測定方法性能評價方法性能評價第11頁第二節(jié)第二節(jié) 脫氫酶指示系統(tǒng)測定法脫氫酶指示系統(tǒng)測定法一、單酶反應(yīng)直接測定法：一、單酶反應(yīng)直接測定法：（一）血液乳酸與丙酮酸測定（一）血液乳酸與丙酮酸測定（二）血漿（二）血漿羥丁酸測定羥丁酸測定（三）血氨測定（三）血氨測定1脫氫酶脫氫酶指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)二、酶偶聯(lián)脫氫酶指示系統(tǒng)二、酶偶聯(lián)脫氫酶指示系統(tǒng) 測定法：測定法：（一）尿素測定（一）尿素測定（二）肌酐測定（二）肌酐測定（三）血漿碳酸氫根測定（三）血漿碳酸氫根測定第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第12頁第12頁根據(jù)根據(jù)340nm340

10、nm處吸光度的變化，計算以處吸光度的變化，計算以NADNAD（H H）或）或NADPNADP（H H）為輔酶的）為輔酶的酶促反應(yīng)中待測物的濃度酶促反應(yīng)中待測物的濃度氧化時待測物脫下的氫交給了氧化型輔酶，使其轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶；氧化時待測物脫下的氫交給了氧化型輔酶，使其轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶；還原時待測物需要的氫由還原型輔酶提供，使其轉(zhuǎn)化為氧化型輔酶還原時待測物需要的氫由還原型輔酶提供，使其轉(zhuǎn)化為氧化型輔酶生化物質(zhì)在脫氫酶的催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)生化物質(zhì)在脫氫酶的催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)概述概述第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第13頁第13頁一、單酶反應(yīng)一、單酶反

11、應(yīng)直接測定法直接測定法待測物可直接發(fā)生脫氫酶促反應(yīng)，并產(chǎn)待測物可直接發(fā)生脫氫酶促反應(yīng)，并產(chǎn)生可檢測的信號。生可檢測的信號。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第14頁第14頁血液乳酸測定的方法有血液乳酸測定的方法有乳酸氧化酶法乳酸氧化酶法、酶電極酶電極法法和和乳酸脫氫酶法乳酸脫氫酶法。血液丙酮酸的酶法測定主要包括乳酸脫氫酶法血液丙酮酸的酶法測定主要包括乳酸脫氫酶法和丙酮酸氧化酶法。和丙酮酸氧化酶法。臨床血液乳酸與丙酮酸測定大多采用臨床血液乳酸與丙酮酸測定大多采用乳酸脫乳酸脫氫酶法氫酶法。血液乳酸與丙酮酸血液乳酸與丙酮酸測定方法概述測定方法概述 第二十六章第

12、二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第15頁第15頁脫氫酶法測定乳酸脫氫酶法測定乳酸根據(jù)乳酸在乳酸脫氫酶（根據(jù)乳酸在乳酸脫氫酶（LDLD）催化下脫氫生成丙酮酸，氧化）催化下脫氫生成丙酮酸，氧化型型NAD+NAD+接受氫轉(zhuǎn)變成還原型接受氫轉(zhuǎn)變成還原型NADHNADH。加入硫酸肼可捕獲產(chǎn)物丙。加入硫酸肼可捕獲產(chǎn)物丙酮酸促成反應(yīng)完成。生成的酮酸促成反應(yīng)完成。生成的NADHNADH與乳酸為等量摩爾，于與乳酸為等量摩爾，于340nm340nm波長測定波長測定NADHNADH的吸光度，可計算出血液中的乳酸含量。的吸光度，可計算出血液中的乳酸含量。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測

13、定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第16頁第16頁脫氫酶法測定丙酮酸脫氫酶法測定丙酮酸是乳酸測定的逆反應(yīng)，丙酮酸在是乳酸測定的逆反應(yīng)，丙酮酸在LDLD的催化下，接受的催化下，接受NADHNADH遞遞給的氫，還原為乳酸并生成給的氫，還原為乳酸并生成NAD+NAD+。根據(jù)。根據(jù)NADHNADH吸光度的下降吸光度的下降值可測定樣品中的丙酮酸。值可測定樣品中的丙酮酸。本方法使用的偏磷酸易被氫離子催化成正磷酸而失去沉淀本方法使用的偏磷酸易被氫離子催化成正磷酸而失去沉淀蛋白的作用，偏磷酸溶液在蛋白的作用，偏磷酸溶液在4 4時僅能穩(wěn)定時僅能穩(wěn)定1 1周；周；丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液會發(fā)生聚合反應(yīng)，其聚合體的酶

14、促反應(yīng)速丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液會發(fā)生聚合反應(yīng)，其聚合體的酶促反應(yīng)速率與非聚合體不同，故丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液必須新鮮配制；率與非聚合體不同，故丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液必須新鮮配制；血中丙酮酸極不穩(wěn)定，血液抽出后血中丙酮酸極不穩(wěn)定，血液抽出后1min1min就會減低，如用偏磷就會減低，如用偏磷酸沉淀蛋白后放酸沉淀蛋白后放4 4時可穩(wěn)定時可穩(wěn)定8d8d；酮體易受飲食影響，劇烈運(yùn)動時乳酸可在短時間內(nèi)明顯增加酮體易受飲食影響，劇烈運(yùn)動時乳酸可在短時間內(nèi)明顯增加，因此，抽血前患者應(yīng)保持空腹和完全靜息至少，因此，抽血前患者應(yīng)保持空腹和完全靜息至少2h2h；第17頁第17頁抗凝劑用肝素抗凝劑用肝素- -氟化鈉較好。氟化鈉較好。

15、脫氫酶法測定乳酸和丙酮酸脫氫酶法測定乳酸和丙酮酸方法性能評價方法性能評價第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第18頁第18頁血漿血漿-羥丁酸的測定方法有羥丁酸的測定方法有酸氧化比色法酸氧化比色法、氣相色譜法氣相色譜法、酶法酶法和和毛細(xì)管等速電泳法毛細(xì)管等速電泳法等等脫氫酶法脫氫酶法是血漿是血漿-羥丁酸測定的常用方法。羥丁酸測定的常用方法。血漿血漿羥丁酸測定羥丁酸測定方法概述方法概述 第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第19頁第19頁脫氫酶法測定血漿脫氫酶法測定血漿羥丁酸羥丁酸-羥丁酸在羥丁酸在- -羥丁酸脫氫酶的催化

16、下，被氧化生成乙酰乙酸，羥丁酸脫氫酶的催化下，被氧化生成乙酰乙酸，同時同時NAD+NAD+被還原為被還原為NADHNADH，在，在pH8.5pH8.5時測定時測定340nm340nm波長下波長下NADHNADH吸光度吸光度上升的速率，就可以計算出血漿中上升的速率，就可以計算出血漿中- -羥丁酸的濃度。羥丁酸的濃度。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第20頁 由于易受飲食影響，原則上應(yīng)空腹取血，由于易受飲食影響，原則上應(yīng)空腹取血，-羥丁羥丁酸避免在室溫放置，酸避免在室溫放置，4 4可以穩(wěn)定可以穩(wěn)定30d30d。第20頁脫氫酶法測定血漿脫氫酶法測定血漿羥丁酸

17、羥丁酸方法性能評價方法性能評價 試劑中如含有草酸，可以抑制內(nèi)源性試劑中如含有草酸，可以抑制內(nèi)源性LDLD對乳酸的對乳酸的氧化反應(yīng)。氧化反應(yīng)。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第21頁第21頁血氨測定方法概述血氨測定方法概述 血氨的測定主要有兩類方法：血氨的測定主要有兩類方法：兩步法，先從血漿中分離出氨，再進(jìn)行測定，如離子交換樹兩步法，先從血漿中分離出氨，再進(jìn)行測定，如離子交換樹脂法；脂法；一步法，即不需要分離就可以直接測定，如酶法和離子選擇一步法，即不需要分離就可以直接測定，如酶法和離子選擇電極法。電極法。 離子交換樹脂法離子交換樹脂法是血氨測定的參考方

18、法；是血氨測定的參考方法；氨電極法氨電極法由于氨氣由于氨氣敏電極選擇性較高，所以方法特異性好，準(zhǔn)確度高，但耐用性差敏電極選擇性較高，所以方法特異性好，準(zhǔn)確度高，但耐用性差，且電極的穩(wěn)定性受溫度、滲透壓、中介液等多種因素影響。，且電極的穩(wěn)定性受溫度、滲透壓、中介液等多種因素影響。目前，目前，酶法酶法由于方法簡單、特異性高而被廣泛應(yīng)用。由于方法簡單、特異性高而被廣泛應(yīng)用。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第22頁第22頁谷氨酸脫氫酶法測定血氨谷氨酸脫氫酶法測定血氨 在谷氨酸脫氫酶在谷氨酸脫氫酶(GLDH)(GLDH)作用下，血漿中氨與作用下，血漿中氨與- -

19、酮戊二酸和酮戊二酸和NADPHNADPH反應(yīng)，生成谷氨酸和反應(yīng)，生成谷氨酸和NADP+NADP+，NADPHNADPH在在340nm340nm吸光度的下降程度與反應(yīng)體系中氨的濃度呈吸光度的下降程度與反應(yīng)體系中氨的濃度呈正比關(guān)系。正比關(guān)系。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第23頁 該法在該法在pH7.0pH7.0以上時，以上時，ADPADP是是GLDHGLDH的穩(wěn)定劑和激活劑，的穩(wěn)定劑和激活劑，能加速反應(yīng)；用能加速反應(yīng)；用NADPHNADPH取代原來的取代原來的NADHNADH，既可縮短反應(yīng)時，既可縮短反應(yīng)時間，又能防止假陽性（因為血漿中有許多以間，又能

20、防止假陽性（因為血漿中有許多以NADHNADH為輔酶的為輔酶的脫氫酶，用脫氫酶，用NADHNADH時易產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)）；時易產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)）；第23頁該法特異性強(qiáng)、快速，是較為理想的氨分析方法；該法特異性強(qiáng)、快速，是較為理想的氨分析方法；谷氨酸脫氫酶法測定血氨谷氨酸脫氫酶法測定血氨方法性能評價方法性能評價床旁取血后應(yīng)立即分離血清并盡快進(jìn)行測定，防止外床旁取血后應(yīng)立即分離血清并盡快進(jìn)行測定，防止外源性氨的污染。源性氨的污染。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第24頁第24頁二、酶偶聯(lián)脫氫酶二、酶偶聯(lián)脫氫酶指示系統(tǒng)測定法指示系統(tǒng)測定法待當(dāng)待測物不可直接發(fā)生脫氫酶促反

21、應(yīng)時，可通待當(dāng)待測物不可直接發(fā)生脫氫酶促反應(yīng)時，可通過一個或多個輔助酶反應(yīng)，使其產(chǎn)物可發(fā)生脫氫過一個或多個輔助酶反應(yīng)，使其產(chǎn)物可發(fā)生脫氫酶反應(yīng)，并產(chǎn)生可檢測的信號。酶反應(yīng)，并產(chǎn)生可檢測的信號。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第25頁第25頁尿素測定方法概述尿素測定方法概述 尿素的測定方法可分為尿素的測定方法可分為化學(xué)比色法化學(xué)比色法和和尿素酶法尿素酶法兩大類。兩大類。 尿素酶法尿素酶法簡單、快速、準(zhǔn)確、特異性簡單、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，易于自動化。強(qiáng)，易于自動化。第26頁酶偶聯(lián)脫氫酶法測定酶偶聯(lián)脫氫酶法測定尿素尿素尿素酶催化尿素分解產(chǎn)生氨，氨在谷氨酸脫

22、氫酶（尿素酶催化尿素分解產(chǎn)生氨，氨在谷氨酸脫氫酶（GLDHGLDH）的作用下使的作用下使NADHNADH氧化為氧化為NAD+NAD+，然后在，然后在340nm340nm下測定吸光度下測定吸光度的降低值，用標(biāo)準(zhǔn)對照速率法即可計算出血清尿素的含量的降低值，用標(biāo)準(zhǔn)對照速率法即可計算出血清尿素的含量第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第27頁但該法存在內(nèi)源性氨和外源性氨，以及內(nèi)源性脫氫酶和還但該法存在內(nèi)源性氨和外源性氨，以及內(nèi)源性脫氫酶和還原型輔酶的干擾，需采用含原型輔酶的干擾，需采用含LDLD抑制劑（如高濃度丙酮酸）抑制劑（如高濃度丙酮酸）的雙試劑法來測定，否則

23、測定結(jié)果偏高。的雙試劑法來測定，否則測定結(jié)果偏高。第27頁酶偶聯(lián)脫氫酶法測定酶偶聯(lián)脫氫酶法測定尿素方法性能評價尿素方法性能評價尿素酶偶聯(lián)脫氫酶法測定血清尿素方法簡便、快速，尿素酶偶聯(lián)脫氫酶法測定血清尿素方法簡便、快速，適用于臨床常規(guī)分析適用于臨床常規(guī)分析第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第28頁第28頁肌酐測定方法概述肌酐測定方法概述肌酐酶法測定主要有肌酐酶法測定主要有肌酐亞氨酸水解酶偶肌酐亞氨酸水解酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶法聯(lián)谷氨酸脫氫酶法和和酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法法兩種。兩種。第29頁脫氫酶法測定肌酐脫氫酶法測定肌酐肌酐在肌酐亞氨基水解酶肌

24、酐在肌酐亞氨基水解酶(CRDI)(CRDI)的作用下水解為的作用下水解為N-N-甲基甲基- -乙內(nèi)酰脲和乙內(nèi)酰脲和NH4+NH4+，NH4+NH4+與與NADPHNADPH和和-酮戊二酸在酮戊二酸在GLDHGLDH的作用下，生成的作用下，生成L-L-谷氨酸和谷氨酸和NADP+NADP+，記錄記錄340 nm340 nm處吸光度的下降，進(jìn)而計算出標(biāo)本中肌酐的濃度。處吸光度的下降，進(jìn)而計算出標(biāo)本中肌酐的濃度。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第30頁第30頁該方法的主要缺點(diǎn)是試劑不夠穩(wěn)定，且肌酐酶來源該方法的主要缺點(diǎn)是試劑不夠穩(wěn)定，且肌酐酶來源困難，使得試劑

25、盒價格昂貴，影響其在臨床實驗室的困難，使得試劑盒價格昂貴，影響其在臨床實驗室的普遍使用。普遍使用。肌酐脫氫酶法與參考方法高效液相色譜法具有良好的相關(guān)肌酐脫氫酶法與參考方法高效液相色譜法具有良好的相關(guān)性，精密度好、準(zhǔn)確度高、線性范圍寬，不受黃疸、乳糜血性，精密度好、準(zhǔn)確度高、線性范圍寬，不受黃疸、乳糜血、溶血和臨床常用治療藥物及體內(nèi)代謝物的干擾，結(jié)果更趨、溶血和臨床常用治療藥物及體內(nèi)代謝物的干擾，結(jié)果更趨于真值，易于自動化分析，可用于血液及尿液的檢測。于真值，易于自動化分析，可用于血液及尿液的檢測。肌酐脫氫酶法性能評價肌酐脫氫酶法性能評價相比之下，肌氨酸氧化酶法具有靈敏度高，線性范相比之下，肌氨

26、酸氧化酶法具有靈敏度高，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。圍寬，試劑穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第31頁第31頁血漿碳酸氫根血漿碳酸氫根測定方法概述測定方法概述血漿血漿HCOHCO3 3- -測定方法主要有測定方法主要有離子選擇電極法離子選擇電極法、滴定法滴定法和和酶速率法酶速率法等。等。酶速率法酶速率法為為HCOHCO3 3- -直直接參與化學(xué)反應(yīng)，操作簡單，反應(yīng)特異，接參與化學(xué)反應(yīng)，操作簡單，反應(yīng)特異，更適合臨床常規(guī)檢測。更適合臨床常規(guī)檢測。第32頁酶法測定血漿碳酸氫根酶法測定血漿碳酸氫根血漿中的血漿中的HCOHCO3 3- -在

27、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCPEPC）催化下，與磷）催化下，與磷酸烯醇式丙酮酸（酸烯醇式丙酮酸（PEPPEP）反應(yīng)，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和）反應(yīng)，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和蘋果酸脫氫酶（蘋果酸脫氫酶（MDHMDH）反應(yīng)，生成蘋果酸，同時將）反應(yīng)，生成蘋果酸，同時將NADHNADH氧化成氧化成NADNAD+ +；在；在340nm340nm波長處吸光度的降低與樣品中波長處吸光度的降低與樣品中HCOHCO3 3- -含量成正比。含量成正比。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第33頁第33頁 在準(zhǔn)備試劑和收集標(biāo)本時，應(yīng)嚴(yán)

28、格密封，以最大限度在準(zhǔn)備試劑和收集標(biāo)本時，應(yīng)嚴(yán)格密封，以最大限度地減少干擾如標(biāo)本中地減少干擾如標(biāo)本中COCO2 2的揮發(fā)；的揮發(fā)；酶法測定血漿碳酸氫根酶法測定血漿碳酸氫根性能評價性能評價試劑渾濁或試劑空白吸光度小于試劑渾濁或試劑空白吸光度小于1.01.0時都不能使用；時都不能使用；內(nèi)源性丙酮酸和內(nèi)源性丙酮酸和LDLD對反應(yīng)產(chǎn)生干擾，此干擾可由草氨酸對反應(yīng)產(chǎn)生干擾，此干擾可由草氨酸鈉消除。鈉消除。第34頁第34頁四、血清總膽固醇四、血清總膽固醇三、血清三酰甘油三、血清三酰甘油一、葡萄糖一、葡萄糖第三節(jié)第三節(jié) 過氧化物酶指示系統(tǒng)測定法過氧化物酶指示系統(tǒng)測定法過氧化物酶過氧化物酶指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)測定

29、法測定法二、糖化血清蛋白二、糖化血清蛋白五、血清五、血清HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第35頁第35頁TrinderTrinder反應(yīng)指示終反應(yīng)指示終點(diǎn)點(diǎn)生化物質(zhì)在氧化酶的催化下，生成生化物質(zhì)在氧化酶的催化下，生成H2O2過氧化物酶指示系統(tǒng)是臨床生化物質(zhì)過氧化物酶指示系統(tǒng)是臨床生化物質(zhì)最常用的測定方法最常用的測定方法概述概述第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第36頁第36頁葡萄糖葡萄糖測定方法概述測定方法概述葡萄糖的檢測方法較多，可歸納為葡萄糖的檢測方法較多，可歸納為

30、氧化還氧化還原法原法（無機(jī)化學(xué)法）、（無機(jī)化學(xué)法）、縮合法縮合法（有機(jī)化學(xué)（有機(jī)化學(xué)法）和法）和酶法酶法（生物化學(xué)法）三類。（生物化學(xué)法）三類。酶法酶法包括包括葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（GOD-PODGOD-POD）法）法、己糖激酶（己糖激酶（HKHK）法）法、葡萄糖脫氫酶法葡萄糖脫氫酶法和和葡葡萄糖氧化酶萄糖氧化酶- -氧速率（氧速率（GOD-PORGOD-POR）法。法。第37頁葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖葡萄糖根據(jù)根據(jù)GODGOD可以高特異性的催化葡萄糖氧化成為葡萄糖酸并同時產(chǎn)生可以高特異性的催化葡萄糖氧化成為葡萄糖酸并同時產(chǎn)生H H2 2O O2 2，生成的，生成的H

31、H2 2O O2 2參與參與TrinderTrinder反應(yīng)，生成醌亞胺色素，在反應(yīng)，生成醌亞胺色素，在505nm505nm波長波長下比色檢測，生成的吸光度與葡萄糖濃度成正比。下比色檢測，生成的吸光度與葡萄糖濃度成正比。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第38頁第38頁 GODGOD僅高特異的催化僅高特異的催化-D-D-葡萄糖，而葡萄糖中葡萄糖，而葡萄糖中型約占型約占36%36%，因此葡萄糖的完全氧化需要使，因此葡萄糖的完全氧化需要使型變旋型變旋為為型；型；葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖性能評價葡萄糖性能評價 現(xiàn)在的試劑大多含有變旋酶，可促進(jìn)

32、現(xiàn)在的試劑大多含有變旋酶，可促進(jìn)型向型向型的轉(zhuǎn)變，延長孵育時間也可以達(dá)到自發(fā)變旋。型的轉(zhuǎn)變，延長孵育時間也可以達(dá)到自發(fā)變旋。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第39頁第39頁糖化血清蛋白糖化血清蛋白測定方法概述測定方法概述 血清清蛋白在高血糖情況下會發(fā)生糖基化，主要是清蛋白肽血清清蛋白在高血糖情況下會發(fā)生糖基化，主要是清蛋白肽鏈鏈189189位的賴氨酸與葡萄糖結(jié)合形成的高分子酮胺結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位的賴氨酸與葡萄糖結(jié)合形成的高分子酮胺結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)類似于果糖胺，因此糖化血清蛋白（類似于果糖胺，因此糖化血清蛋白（GSPGSP）的測定也稱為果糖胺）的測定也稱為果糖胺

33、的測定。的測定。 GSP GSP的常用測定方法有的常用測定方法有硝基四氮唑藍(lán)（硝基四氮唑藍(lán)（NBTNBT）化學(xué)比色法）化學(xué)比色法和和酮酮胺氧化酶（胺氧化酶（KAOKAO）法）法。 NBT NBT法基于酮胺結(jié)構(gòu)可以在堿性環(huán)境中與法基于酮胺結(jié)構(gòu)可以在堿性環(huán)境中與NBTNBT反應(yīng)生成藍(lán)紫色反應(yīng)生成藍(lán)紫色的化合物。與的化合物。與NBTNBT法相比，法相比，KAOKAO法的精密度和準(zhǔn)確度更高。法的精密度和準(zhǔn)確度更高。第40頁酮胺氧化酶法測定酮胺氧化酶法測定糖化血清蛋白糖化血清蛋白GSPGSP在蛋白酶在蛋白酶K K的作用下可形成糖化蛋白片段，的作用下可形成糖化蛋白片段，該片段在該片段在KAOKAO的作用下

34、分解為氨基酸、葡萄糖和的作用下分解為氨基酸、葡萄糖和H H2 2O O2 2，生成的，生成的H2O2H2O2即可用即可用TrinderTrinder反應(yīng)測定。反應(yīng)測定。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第41頁第41頁 KAOKAO法穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，具有酶法的基本優(yōu)點(diǎn)；法穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，具有酶法的基本優(yōu)點(diǎn)；酮胺氧化酶法測定糖化酮胺氧化酶法測定糖化血清蛋白性能評價血清蛋白性能評價 樣本在樣本在4 4可保存可保存3 3周，周，-20-20保存保存5 5周。當(dāng)病人血周。當(dāng)病人血漿蛋白低于漿蛋白低于35g/L35g/L時，時，GSPGSP偏低。偏低。第二十六章第

35、二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第42頁第42頁血清三酰甘油血清三酰甘油測定方法概述測定方法概述 血清三酰甘油（血清三酰甘油（TGTG）測定方法有）測定方法有物理化學(xué)法物理化學(xué)法（同（同位素稀釋位素稀釋- -質(zhì)譜法）、質(zhì)譜法）、化學(xué)法化學(xué)法和和酶法酶法三類。三類。 酶法是目前臨床測定血清酶法是目前臨床測定血清TGTG的常規(guī)方法。常用的的常規(guī)方法。常用的酶法有酶法有甘油磷酸脫氫酶（甘油磷酸脫氫酶（GDHGDH）法）法和和GDHGDH偶聯(lián)偶聯(lián)NBTNBT的比色的比色法法，以及，以及甘油磷酸氧化酶偶聯(lián)甘油磷酸氧化酶偶聯(lián)TrinderTrinder反應(yīng)法反應(yīng)法。第43頁甘

36、油磷酸氧化酶法測定甘油磷酸氧化酶法測定血清三酰甘油血清三酰甘油血清血清TGTG可被可被LPLLPL水解為水解為甘油和脂肪酸，生成的甘油和脂肪酸，生成的甘油被甘油激酶（甘油被甘油激酶（GKGK）及及ATPATP磷酸化后形成磷酸化后形成3-3-磷酸甘油，磷酸甘油氧磷酸甘油，磷酸甘油氧化酶（化酶（GPOGPO）氧化）氧化3-3-磷磷酸甘油產(chǎn)生酸甘油產(chǎn)生H H2 2O O2 2，生成，生成的的H H2 2O O2 2參與參與TrinderTrinder反應(yīng)反應(yīng)而被測定。而被測定。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第44頁第44頁與與GDHGDH法相比，該方法易受

37、到還原性物質(zhì)的干擾，法相比，該方法易受到還原性物質(zhì)的干擾，但是由于方法穩(wěn)定，測定簡單，仍然是目前主要采用但是由于方法穩(wěn)定，測定簡單，仍然是目前主要采用的檢測方法。的檢測方法。由于乳糜微粒含有大量的由于乳糜微粒含有大量的TGTG，可影響檢測結(jié)果，因，可影響檢測結(jié)果，因此需空腹此需空腹12h12h以上采血；以上采血；該法可采用血清或血漿標(biāo)本，若采用血漿，應(yīng)將該法可采用血清或血漿標(biāo)本，若采用血漿，應(yīng)將結(jié)果乘以標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)結(jié)果乘以標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)1.031.03，并在報告單上注明，并在報告單上注明；該法通常被稱為該法通常被稱為GPO-PAPGPO-PAP法，結(jié)果比法，結(jié)果比GDHGDH法約低法約低3% 3% ；甘

38、油磷酸氧化酶法測定甘油磷酸氧化酶法測定血清三酰甘油性能評價血清三酰甘油性能評價第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第45頁第45頁血清總膽固醇血清總膽固醇測定方法概述測定方法概述 血清總膽固醇（血清總膽固醇（TCTC）測定方法種類繁）測定方法種類繁多，主要有多，主要有放射性核素稀釋放射性核素稀釋- -質(zhì)譜法質(zhì)譜法、化學(xué)化學(xué)法法和和酶法酶法。 酶法的主要方法為酶法的主要方法為膽固醇氧化酶（膽固醇氧化酶（COD-COD-PAPPAP）法）法。第46頁膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇膽固醇根據(jù)根據(jù)GODGOD可以高特異性的催化葡萄糖氧化成為

39、葡可以高特異性的催化葡萄糖氧化成為葡萄糖酸并同時產(chǎn)生萄糖酸并同時產(chǎn)生H H2 2O O2 2，生成的，生成的H H2 2O O2 2參與參與TrinderTrinder反應(yīng)，生成醌亞胺色素，在反應(yīng)，生成醌亞胺色素，在505nm505nm波長波長下比色檢測，生成的吸光度與葡萄糖濃度成正下比色檢測，生成的吸光度與葡萄糖濃度成正比。比。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第47頁第47頁樣本若未及時檢測，置樣本若未及時檢測，置2 2-8-8冷藏可穩(wěn)定冷藏可穩(wěn)定1 1個月，個月，- -2020冷凍可穩(wěn)定冷凍可穩(wěn)定1 1年。年。因此若采用血漿做為檢測標(biāo)本，應(yīng)將結(jié)果乘

40、以標(biāo)準(zhǔn)系因此若采用血漿做為檢測標(biāo)本，應(yīng)將結(jié)果乘以標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)數(shù)1.031.03，并在報告單上注明；，并在報告單上注明；同血清同血清TGTG檢測一樣，血漿的結(jié)果比血清約低檢測一樣，血漿的結(jié)果比血清約低3% 3% ；COD-PAPCOD-PAP法標(biāo)本用量小，結(jié)果可靠；法標(biāo)本用量小，結(jié)果可靠；膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇性能評價性能評價第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第48頁第48頁血清血清HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C測定方法概述測定方法概述 國外國外將常規(guī)測定將常規(guī)測定HDL-CHDL-C的方法分為的方法分為3

41、3代：第代：第1 1代為代為化學(xué)沉淀化學(xué)沉淀法法；第；第2 2代為代為硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖- -鎂（鎂（DS-Mg2+DS-Mg2+）分離法）分離法；第；第3 3代為代為勻勻相測定法相測定法。國內(nèi)國內(nèi)的檢測方法也可分為的檢測方法也可分為3 3代：第代：第1 1代為代為電泳法電泳法；第第2 2代為代為化學(xué)沉淀法化學(xué)沉淀法，19951995年中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會曾在國內(nèi)年中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會曾在國內(nèi)推薦推薦磷鎢酸磷鎢酸- -鎂（鎂（PTA-Mg2+PTA-Mg2+）法）法作為作為HDL-CHDL-C測定的常規(guī)方法；測定的常規(guī)方法；第第3 3代為目前廣泛使用的勻代為目前廣泛使用的勻相測定法相測定法。 血

42、清血清LDL-CLDL-C的測定相對比較復(fù)雜，方法有的測定相對比較復(fù)雜，方法有FriedewaldFriedewald公公式法式法、PlanellaPlanella公式法公式法；聚乙烯硫酸鹽（聚乙烯硫酸鹽（PVSPVS）沉淀法）沉淀法是目是目前中華醫(yī)學(xué)會推薦的前中華醫(yī)學(xué)會推薦的LDL-CLDL-C測定方法；美國測定方法；美國CDCCDC測定測定LDL-CLDL-C的的參考方法為參考方法為超速離心法（超速離心法（- -脂蛋白定量法）脂蛋白定量法）。第49頁勻相法測定勻相法測定HDL-CHDL-C利用一系列反應(yīng)先將利用一系列反應(yīng)先將CMCM、VLDLVLDL、LDLLDL或其反應(yīng)產(chǎn)物清除，然或其反

43、應(yīng)產(chǎn)物清除，然后加入一種特殊的選擇性表面活性劑，使后加入一種特殊的選擇性表面活性劑，使HDLHDL顆粒形成可溶顆粒形成可溶狀態(tài)，其釋放的膽固醇和膽固醇酯與狀態(tài)，其釋放的膽固醇和膽固醇酯與CEHCEH及及CODCOD反應(yīng)，生成反應(yīng)，生成的的H H2 2O O2 2用用TrinderTrinder反應(yīng)測定。反應(yīng)測定。第50頁勻相法測定勻相法測定HDL-CHDL-C同同HDL-CHDL-C一樣，血清中除一樣，血清中除LDL-CLDL-C外，外，HDLHDL、CMCM和和VLDLVLDL等在某些表等在某些表面活性劑的作用下，可改變其脂蛋白結(jié)構(gòu)并解離，釋放出來面活性劑的作用下，可改變其脂蛋白結(jié)構(gòu)并解離，

44、釋放出來的微粒化膽固醇分子與膽固醇酶試劑反應(yīng)后生成的微?；懝檀挤肿优c膽固醇酶試劑反應(yīng)后生成H2O2H2O2，因此，因此也需要進(jìn)行前處理后，剩下完整也需要進(jìn)行前處理后，剩下完整LDLLDL的顆粒進(jìn)行下一步反應(yīng)。的顆粒進(jìn)行下一步反應(yīng)。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第51頁第51頁勻相法測定血清中的勻相法測定血清中的HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C的最主要區(qū)別在于第一步反應(yīng)時的最主要區(qū)別在于第一步反應(yīng)時加入的反應(yīng)促進(jìn)劑不同，其目的都是使除了待測物質(zhì)以外的其他干擾加入的反應(yīng)促進(jìn)劑不同，其目的都是使除了待測物質(zhì)以外的其他干擾物質(zhì)被清除掉，從而使測

45、定結(jié)果僅僅反映的是待測物質(zhì)的含量；物質(zhì)被清除掉，從而使測定結(jié)果僅僅反映的是待測物質(zhì)的含量；勻相法測定勻相法測定HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C性能評價性能評價該法具有較好的精密度和線性范圍，干擾物質(zhì)較少，而且樣品用量該法具有較好的精密度和線性范圍，干擾物質(zhì)較少，而且樣品用量少且無需預(yù)處理，自動化程度高，結(jié)果精確度、準(zhǔn)確度高，因而近來少且無需預(yù)處理，自動化程度高，結(jié)果精確度、準(zhǔn)確度高，因而近來在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用；在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用；缺點(diǎn)是成本相對較高。缺點(diǎn)是成本相對較高。第52頁第四節(jié)第四節(jié) 酶循環(huán)測定法酶循環(huán)測定法第52頁三、血清同型半胱氨酸三、血清同型半胱

46、氨酸二、血清膽汁酸二、血清膽汁酸一、血清甘油一、血清甘油四、血漿四、血漿NH4NH4+ +酶循環(huán)酶循環(huán)測定法測定法第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第53頁概述概述 酶循環(huán)法是一種可以大大提高待測物測定靈敏度，減酶循環(huán)法是一種可以大大提高待測物測定靈敏度，減少共存物質(zhì)干擾，達(dá)到高靈敏度和高特異度測定要求的一少共存物質(zhì)干擾，達(dá)到高靈敏度和高特異度測定要求的一類技術(shù)。類技術(shù)。 根據(jù)試劑酶的結(jié)合方式和輔酶的用法，可以將酶循環(huán)根據(jù)試劑酶的結(jié)合方式和輔酶的用法，可以將酶循環(huán)法分為法分為底物循環(huán)法底物循環(huán)法和和輔酶循環(huán)法輔酶循環(huán)法。根據(jù)反應(yīng)方式的不同又。根據(jù)反應(yīng)方式

47、的不同又可將底物循環(huán)法分為可將底物循環(huán)法分為氧化酶脫氫酶反應(yīng)法氧化酶脫氫酶反應(yīng)法和和脫氫酶輔酶反脫氫酶輔酶反應(yīng)法應(yīng)法等。等。第54頁產(chǎn)物循環(huán)產(chǎn)物循環(huán)- -氧化酶氧化酶- -脫氫酶脫氫酶系統(tǒng)測定血清甘油系統(tǒng)測定血清甘油甘油和甘油和ATPATP在甘油激酶（在甘油激酶（GKGK）催化下形成甘油）催化下形成甘油-3-3-磷酸（磷酸（G-3-PG-3-P），后者可被磷酸甘油氧化酶（），后者可被磷酸甘油氧化酶（GPOGPO）氧化為磷酸二羥苯酮（）氧化為磷酸二羥苯酮（DHAPDHAP），而甘油），而甘油-3-3-磷酸脫氫酶（磷酸脫氫酶（G-3-PDG-3-PD）又可將）又可將DHAPDHAP還原回還原回G-

48、3-PG-3-P，在此過程中伴有，在此過程中伴有NADHNADH向向NAD+NAD+的轉(zhuǎn)化，反應(yīng)反復(fù)循環(huán)。的轉(zhuǎn)化，反應(yīng)反復(fù)循環(huán)。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第55頁第55頁 在反復(fù)循環(huán)中在反復(fù)循環(huán)中G-3-PG-3-P和和DHAPDHAP的量不變，而產(chǎn)物的量不變，而產(chǎn)物H H2 2O O2 2則則隨著每次循環(huán)不斷遞增，同時隨著每次循環(huán)不斷遞增，同時NADHNADH不斷遞減。在規(guī)定時不斷遞減。在規(guī)定時間間t t內(nèi)，內(nèi)， H H2 2O O2 2累計的量決定于累計的量決定于t t和每分鐘循環(huán)次數(shù)，因此和每分鐘循環(huán)次數(shù)，因此其靈敏度大大超過一般的酶法分析

49、；其靈敏度大大超過一般的酶法分析；產(chǎn)物循環(huán)產(chǎn)物循環(huán)- -氧化酶氧化酶- -脫氫酶脫氫酶系統(tǒng)測定血清甘油性能評價系統(tǒng)測定血清甘油性能評價 檢測的指示系統(tǒng)有：檢測的指示系統(tǒng)有：1 1、用連續(xù)檢測法測定、用連續(xù)檢測法測定NADHNADH（340nm340nm）的變化速率。）的變化速率。2 2、產(chǎn)物、產(chǎn)物H H2 2O O2 2可偶聯(lián)可偶聯(lián)PODPOD，通過，通過TrinderTrinder反應(yīng)比色測定。反應(yīng)比色測定。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第56頁第56頁血清膽汁酸測定血清膽汁酸測定方法概述方法概述 血清總膽汁酸（血清總膽汁酸（TBATBA）的測定方

50、法包括）的測定方法包括層層析法析法、放免法和酶法放免法和酶法等。酶法又可分為等。酶法又可分為酶熒酶熒光法光法、酶比色法酶比色法和和酶循環(huán)法酶循環(huán)法。目前推薦的方法是目前推薦的方法是酶循環(huán)法酶循環(huán)法，該法靈敏度，該法靈敏度高、特異性好，已得到廣泛應(yīng)用。高、特異性好，已得到廣泛應(yīng)用。第57頁底物循環(huán)底物循環(huán)- -脫氫酶脫氫酶- -輔酶系統(tǒng)輔酶系統(tǒng)測定血清膽汁酸測定血清膽汁酸3-3-羥基類固醇脫氫酶（羥基類固醇脫氫酶（3-HSD3-HSD）可催化膽汁酸和）可催化膽汁酸和3-3-酮類固醇之間的反應(yīng)，正反應(yīng)對輔酶酮類固醇之間的反應(yīng)，正反應(yīng)對輔酶硫代氧化型輔酶硫代氧化型輔酶（thiothio-NAD+-N

51、AD+）的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于輔酶）的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于輔酶（NAD+NAD+），而逆反應(yīng)對還原型輔），而逆反應(yīng)對還原型輔酶酶（NADHNADH）的親和力大于硫代還原型輔酶）的親和力大于硫代還原型輔酶（thiothio-NADH-NADH），當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的），當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的thiothio-NAD+-NAD+和和NADHNADH時，少量膽汁酸生成少量的時，少量膽汁酸生成少量的3-3-酮類固醇，并在兩者之間構(gòu)成循環(huán)，不斷產(chǎn)酮類固醇，并在兩者之間構(gòu)成循環(huán)，不斷產(chǎn)生黃色的硫代還原型輔酶生黃色的硫代還原型輔酶（thiothio-NADH-NADH），反應(yīng)速度與待測物膽汁酸濃度呈正比。），反應(yīng)速度與待

52、測物膽汁酸濃度呈正比。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第58頁第58頁 由于膽汁酸在體內(nèi)的濃度只有微摩爾水平，因此由于膽汁酸在體內(nèi)的濃度只有微摩爾水平，因此常規(guī)方法難以測定，采用此循環(huán)反應(yīng)，其靈敏度可常規(guī)方法難以測定，采用此循環(huán)反應(yīng)，其靈敏度可增加數(shù)十倍，只要增加數(shù)十倍，只要NADHNADH足夠多，時間越長產(chǎn)物越多，足夠多，時間越長產(chǎn)物越多，直到系統(tǒng)中某一反應(yīng)物耗盡為止。直到系統(tǒng)中某一反應(yīng)物耗盡為止。底物循環(huán)底物循環(huán)- -脫氫酶脫氫酶- -輔酶系統(tǒng)輔酶系統(tǒng)測定血清膽汁酸性能評價測定血清膽汁酸性能評價 循環(huán)酶法測定血清膽汁酸檢測的是循環(huán)酶法測定血清膽汁酸

53、檢測的是395415nm395415nm波波長時反應(yīng)中氧化型長時反應(yīng)中氧化型thiothio-NAD+-NAD+轉(zhuǎn)化為還原型轉(zhuǎn)化為還原型thiothio- -NADHNADH的增加速度。的增加速度。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第59頁第59頁血清同型半胱氨酸測定血清同型半胱氨酸測定方法概述方法概述 測定同型半胱氨酸的方法包括測定同型半胱氨酸的方法包括氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法、熒熒光偏振免疫分析光偏振免疫分析（FPIAFPIA）、）、酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法、HPLCHPLC法法和和酶學(xué)分析法酶學(xué)分析法。其中。其中HPLCHPLC法是最常用的

54、方法，但是需要特法是最常用的方法，但是需要特殊設(shè)備。殊設(shè)備。 循環(huán)酶法是利用酶的底物特性，放大靶物質(zhì)（被測循環(huán)酶法是利用酶的底物特性，放大靶物質(zhì)（被測物）的檢測方法，此法僅循環(huán)靶物質(zhì)，具有快速、簡便物）的檢測方法，此法僅循環(huán)靶物質(zhì)，具有快速、簡便、靈敏度高，易于自動化等特點(diǎn)。、靈敏度高，易于自動化等特點(diǎn)。第60頁底物循環(huán)底物循環(huán)- -脫氫酶脫氫酶- -輔酶系統(tǒng)輔酶系統(tǒng)測定血清同型半胱氨酸測定血清同型半胱氨酸在三在三- -乙乙- -羧乙基膦（羧乙基膦（TCEPTCEP）作用下，結(jié)合型）作用下，結(jié)合型HcyHcy轉(zhuǎn)化為游離型轉(zhuǎn)化為游離型HcyHcy，游離型，游離型HcyHcy與與s-s-腺苷腺苷甲

55、硫氨酸（甲硫氨酸（SAMSAM）在）在HcyHcy甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，形成蛋氨酸（甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，形成蛋氨酸（MetMet）和）和S-S-腺苷同型半胱氨酸腺苷同型半胱氨酸（SAHSAH），），SAHSAH被被SAHSAH水解酶水解成腺苷和水解酶水解成腺苷和HcyHcy，形成的，形成的HcyHcy可以循環(huán)加入反應(yīng)，從而放大可以循環(huán)加入反應(yīng)，從而放大檢測信號，腺苷（檢測信號，腺苷（AdoAdo）水解為次黃嘌呤（）水解為次黃嘌呤（inosineinosine）和氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下）和氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下，使，使NADHNADH轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為NAD+NAD+，樣本中的，樣本中的HcyH

56、cy的濃度與的濃度與NADHNADH的變化成正比。的變化成正比。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第61頁第61頁 酶循環(huán)法是目前臨床測定血清酶循環(huán)法是目前臨床測定血清HcyHcy最新的一種化學(xué)最新的一種化學(xué)方法，與以前免疫化學(xué)法、電泳法、色譜法等相比，方法，與以前免疫化學(xué)法、電泳法、色譜法等相比，具有操作簡單，可自動化等優(yōu)點(diǎn)；具有操作簡單，可自動化等優(yōu)點(diǎn)；底物循環(huán)底物循環(huán)- -脫氫酶脫氫酶- -輔酶系統(tǒng)測定輔酶系統(tǒng)測定血清同型半胱氨酸性能評價血清同型半胱氨酸性能評價 隨著對同型半胱氨酸臨床研究的深入，其定量測定隨著對同型半胱氨酸臨床研究的深入，其定量測

57、定意義越來越受到重視，因此本實驗的檢測方法及試劑意義越來越受到重視，因此本實驗的檢測方法及試劑具有很高的推廣及應(yīng)用價值。具有很高的推廣及應(yīng)用價值。第62頁氨循環(huán)氨循環(huán)- -合成酶合成酶- -脫氫酶系統(tǒng)脫氫酶系統(tǒng)測定血漿測定血漿NHNH4 4+ +靶物質(zhì)靶物質(zhì)NHNH4 4+ +和脫氨和脫氨-NAD-NAD在在NADNAD合成酶和合成酶和MgMg2 2+ +存在下可被催存在下可被催化生成亮氨酸和化生成亮氨酸和NADNAD+ +，亮氨酸經(jīng)亮氨酸脫氫酶催化形成，亮氨酸經(jīng)亮氨酸脫氫酶催化形成為氧化異己酸和為氧化異己酸和NHNH4 4+ +，同時將，同時將NADNAD+ +轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為NADHNADH，

58、生成的，生成的NHNH4 4+ + 進(jìn)入循環(huán)往復(fù)反應(yīng)，在進(jìn)入循環(huán)往復(fù)反應(yīng)，在340nm340nm處測定處測定NADNAD+ + 形成形成NADHNADH吸光度的增加即可計算出吸光度的增加即可計算出NHNH4 4+ +的含量。的含量。第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第63頁第63頁 該法測定血漿該法測定血漿NH4+NH4+具有快速、特異性高、微量的特點(diǎn)；具有快速、特異性高、微量的特點(diǎn)；氨循環(huán)氨循環(huán)- -合成酶合成酶- -脫氫酶系統(tǒng)脫氫酶系統(tǒng)測定血漿測定血漿NHNH4 4+ +性能評價性能評價 在技術(shù)上酶法不需預(yù)先分離氨，沒有堿水解步驟，在技術(shù)上酶法不需預(yù)

59、先分離氨，沒有堿水解步驟，減少了陽性偏差。減少了陽性偏差。第64頁第五節(jié)第五節(jié) 酶激活和酶抑制測定法酶激活和酶抑制測定法一、無機(jī)離子測定：一、無機(jī)離子測定：（一）丙酮酸激酶法測定鉀離子（一）丙酮酸激酶法測定鉀離子（二）（二）-半乳糖苷酶法測定鈉離子半乳糖苷酶法測定鈉離子（三）淀粉酶法測定氯離子（三）淀粉酶法測定氯離子（四）異檸檬酸脫氫酶法測定鎂離子（四）異檸檬酸脫氫酶法測定鎂離子1酶激活和酶激活和酶抑制酶抑制測定法測定法二、微量元素測定：二、微量元素測定：（一）超氧化物歧化酶法測定銅離子（一）超氧化物歧化酶法測定銅離子（二）碳酸酐酶法測定鋅離子（二）碳酸酐酶法測定鋅離子 三、有機(jī)磷測定三、有機(jī)

60、磷測定第65頁概述概述第65頁 1酶激酶激活劑活劑MgMg2 2+ +ZnZn2 2+ +K K+ +ClCl- -第二十六章第二十六章 酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)酶促反應(yīng)法測定生物化學(xué)物質(zhì)第66頁第66頁第66頁Add TitleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title style無機(jī)離子、微量元素?zé)o機(jī)離子、微量元素可使該酶重新具有活性可使該酶重新