組織細(xì)胞培養(yǎng)考試

1、單選， 25 分名解， 5個(gè)，10分簡答，論述，65 分一、名解1. 原代培養(yǎng) （ primary Culture) 從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段。細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞相互依賴性強(qiáng)。細(xì)胞獨(dú)立生存性差。2. 傳代培養(yǎng) ：當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，繼續(xù)接種進(jìn)行培養(yǎng)。這一過程稱為傳代。否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。3. 克隆形成率 （ Cloning Efficiency) ：細(xì)胞被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。4. 細(xì)胞系（ cell line)：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后，稱做細(xì)胞系。5. 無限細(xì)胞系 ： 細(xì)胞獲永久性增殖能力。核

2、型大多變成異倍體。6.克隆細(xì)胞株 :從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法,由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群 .7.細(xì)胞分裂指數(shù) （ Mitotic Index, MI) ：細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù) .8.細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制 (contact inhibition) 。9. 飼細(xì)胞 (Feeder cells)： 也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，用成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞長成單層后，用大劑量射線照射，使細(xì)胞失去增殖能力，但能存活和有代謝活動(dòng)。將其作為底物，其它細(xì)胞接種上面；飼細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也有利于其它細(xì)胞生長。飼細(xì)胞用于：特殊難培養(yǎng)細(xì)胞，注意避免用同源細(xì)胞

3、。二、大題1 血清的主要作用（ 1）提供細(xì)胞生存、生長和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子。（ 2）補(bǔ)充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。（ 3）含有生長基質(zhì)成分使細(xì)胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。（ 4）提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。（ 5）有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害。（ 6）提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞不受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。2 如何提高體外培養(yǎng)細(xì)胞的成活率成功的關(guān)鍵 :培養(yǎng)物必須貼附在底物上細(xì)胞生長和增殖（ 1）組織和細(xì)胞的供體年齡（ 2）培養(yǎng)條件：合理的培養(yǎng)基，血清，胰島素（ 3）貼附底物(4) 培養(yǎng)方法：酶消化分離，注意濃度以及消化時(shí)間3 培養(yǎng)用液有哪些？（ 1）平衡鹽溶液（ 2）

4、天然培養(yǎng)基（ 3）合成培養(yǎng)基（ 4）消化液（ 5） pH 調(diào)整液： NaHCO3 溶液、 HEPES （分子量 238.31）溶液(6) 抗生素溶液4 以心肌細(xì)胞（神經(jīng)元）為例，描述培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)過程？（一）取材（二）組織的分離1、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡 2 3 秒鐘（時(shí)間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。編輯版 word2、用 Hank s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用 Hank s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量

5、加入5 6 倍的 0.25%胰酶液， 37 中消化20 40 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離5、加入3 5ml 培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6、靜置5 10 分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。7、 1000rpm，離心10 分鐘，棄上清液。8、加入 Hank s液 5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。9、加入培養(yǎng)液 l 2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。10、將細(xì)胞調(diào)整到5× 105/ml 左右，轉(zhuǎn)移至 25ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 下培養(yǎng)。大鼠大腦皮層神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)組織來源新生大鼠1-2 日齡，碘 酒 ，灑精消

6、毒。取出大腦，分離腦膜 ，夾取兩側(cè)大腦皮質(zhì)放入接種培養(yǎng)液中，用D- Hank s沖洗二遍。剪碎， 0.5-1mm3,用 D- Hank s充分洗去殘血加入 5-10 倍量 0.25%胰蛋白酶，移入離心管中放到水37浴箱中消化 20-25 分鐘。終止消化離心洗滌1000 轉(zhuǎn) / 分 ， 5 分鐘棄上清。吹打制成細(xì)胞懸液。臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)后接種于事先涂好多聚賴氨酸培養(yǎng)板中。37 5%CO2 培養(yǎng) 2 天后換生長培養(yǎng)液5 細(xì)胞凍存過程？冷凍過程要緩慢。需要冷凍保存的細(xì)胞先在 4冰箱中放置 30 60 分鐘；然后轉(zhuǎn)入 -20 ，放置 30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入 -80 放置 16 18 小時(shí)（或過夜） ；最

7、后放入液氮中長期保存。6 2-巰基乙醇的作用在雜交瘤技術(shù)中，常在 DMEM 培養(yǎng)基中加入 2-巰基乙醇（ 2-Me). 2-Me 對(duì)細(xì)胞的生長有非常重要的作用，（ 1）能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖； （2）避免過氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害；7 胰蛋白酶溶液特點(diǎn)？胰酶的主要作用是使 細(xì)胞間 的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散。胰酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的種類和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。一般來講，胰酶濃度大、作用溫度高、作用時(shí)間長，對(duì)細(xì)胞分離能力也大，但超過一定的限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰酶溶液 在 pH8.0，溫度為 37 時(shí)，作用能力最強(qiáng) （但是是在ph7.2 時(shí)使用，無 Ca2+、Mg2+ 用）。注意：鈣離子、 鎂離子和血清蛋

8、白的存在會(huì)降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用無Ca2+、Mg2+的 D- Hanks 平衡鹽溶液配制成 0.25%溶液。三、選擇1 培養(yǎng)細(xì)胞生存環(huán)境，溫度：人哺乳動(dòng)物： 36.5 ± 0.5 ;鳥類： 38.5 ;一般培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比高溫強(qiáng)溫度上升不超過 39 時(shí),細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比。39 40 1小時(shí) ,受損傷的細(xì)胞可能恢復(fù)；41 42 1小時(shí) ,嚴(yán)重?fù)p傷 ,個(gè)別細(xì)胞恢復(fù)；43 以上 1 小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。溫度不低于 0時(shí) ,細(xì)胞代謝有影響 ,無傷害作用 ; 置于 25 35，細(xì)胞能生存，但生長速度減慢；放在 4 數(shù)小時(shí) ,再放回 37 細(xì)胞仍繼續(xù)生長。細(xì)胞代謝隨溫度

9、降低而緩慢，溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí),細(xì)胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。2 所有細(xì)胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；編輯版 word是合成 3， 2 和一磷酸腺苷時(shí)所需物;是能源和碳的來源。如沒有谷胺酰胺細(xì)胞生長不良而發(fā)生細(xì)胞死亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷胺酰胺。谷胺酰胺在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)放置在 20 冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷胺酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱內(nèi)可放置兩周以上時(shí)重新加入原來量的谷胺酰胺。3 天然培養(yǎng)基：用人或動(dòng)物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清。血清含有多種促生長因子、貼附因子及其它活性物質(zhì)等。加入 5血清：維持細(xì)胞不死或緩

10、慢生長；加入 10 20血清：細(xì)胞增殖生長。4 消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）和抗生素。（ 1）紫外線消毒 ：用于 空氣 ，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5 米，且消毒物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。（ 2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀荆瑴責(zé)嵯緯r(shí)，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥

11、門，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開始記算消毒時(shí)間。常用物品消毒壓力及時(shí)間：培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121磅, ,2015 分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121 ,15 磅 , 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；（ 3）干熱消毒：玻璃瓶，干熱滅菌170 , 4 小時(shí)（ 4）濾過消毒：培養(yǎng)液消毒（ 4）化學(xué)消毒法：最常見的是 70%酒精及 1的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。5 細(xì)胞凍存（ 2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。（ 3）細(xì)胞

12、濃度控制在：1× 107 5× 107/ml。（ 4）使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑。一般情況下，用于冷凍保存完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中血清濃度大于 20。（ 5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，最常用的冷凍保護(hù)劑是 DMSO( 二甲基亞砜 )，使用終濃度為5 10。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO 作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60 。因?yàn)椋?DMSO能誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele） ,羥乙基淀粉等。特別注意：（ 1）細(xì)胞在冷凍過程中在 -20 冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過 1 小時(shí)，以防

13、止冰晶過大而破壞細(xì)胞。也可跳過 - 20 這一步驟直接放入 -80 冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。（ 2） DMSO 稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。（ 3） DMSO 必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的。新買的DMSO 本身處于無菌狀態(tài)，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管或瓶中， 4保存。 避免反復(fù)凍融造成 DMSO 裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。 并可減少污染機(jī)會(huì)。如要過濾 DMSO ，必須選用耐 DMSO 的尼龍濾膜。6 細(xì)胞解凍與復(fù)蘇冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)：（ 1）快速解凍。凍存細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入 37 水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過 3 分鐘）。編輯版 word（ 2）解凍操作過程動(dòng)作要輕。由于冷凍保存過的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動(dòng)作要輕。一般情況下，解凍后的細(xì)