綠色植物中色素的提取和分離

1、綠色植物中色素的提取和分離作者：日期：?綠色植物中色素的提取和分離 實驗名稱 綠色植物色素的提取及色譜分離 教學(xué)目標(biāo) 知識與技能 :通過對綠色植物色素的提取與分離, 了解天然產(chǎn)物分離提純的方法 教學(xué)重點 學(xué)習(xí)柱色譜和薄層色譜分離的基本原理及操作方法教學(xué)難點 薄層色譜、柱層析實驗操作要點的掌握和應(yīng)用教學(xué)方法 陳述法，講演法教學(xué)過程 講述【實驗?zāi)康摹?. 通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質(zhì)分離提純方法；2.通過對柱色譜和薄層色譜操作方法的掌握, 加深了解微量有機物色譜分離、鑒定的原理。 講述【背景知識】綠色植物的葉、莖中，如菠菜葉, 含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙）和葉黃素( 黃）等多種天

2、然色素。葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素 a(C55H72O5 N4 g) 和葉綠素 b(C 5570 O6 N M） , 其差別僅是葉綠素中一個甲基被甲?；〈鷱亩纬闪巳~綠素。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡(luò)合物，是植物進行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a的含量通常是 b的3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團, 但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。胡蘿卜素(C 0 H56 ) 是具有長鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即a- 胡蘿卜素、 - 胡蘿卜素和 - 胡蘿卜素，其中 - 胡蘿卜素含量最多，也最重要。葉黃素 (C4 H56 O2 ）是胡蘿卜素的羥基衍生物，

3、 它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。 與胡蘿卜素相比 , 葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。本實驗先根據(jù)各種植物色素的溶解度情況將胡蘿卜素( 橙）、葉黃素 ( 黃）、葉綠素 a和葉綠素 b從菠菜葉中提取出來 , 然后根據(jù)各化合物物理性質(zhì)的不同用色譜法進行分離和鑒定。圖示【分離產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式】葉綠素 a、葉綠素 b、葉黃素 ( 黃 ) 和胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)式如下圖所示： 講述【色譜法原理】色譜法是分離、提純和鑒定有機化合物的重要方法。其分離原理是利用混合物中各個成分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，當(dāng)選擇某一個條件使各個成分流過支持劑或吸附劑時, 各成分可由于其物理性質(zhì)的不同而得到分離。與經(jīng)典的分離提純手

4、段( 重結(jié)晶 , 升華 , 萃取和蒸餾等）相比，色譜法具有微量、快速、簡便和高效等優(yōu)點。按其操作不同，色譜可分為薄層色譜、柱色譜、紙色譜、氣相色譜和高壓液相色譜等。在此, 我們學(xué)習(xí)柱色譜和薄層色譜（ TLC)。1.柱色譜原理液體樣品從柱頂加入, 流經(jīng)吸附柱時， 即被吸附在柱中固定相（吸附劑 ) 的上端 , 然后從柱頂加入流動相（洗脫劑 ) 淋洗，由于固定相對各組分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移, 吸附能力弱的組分隨洗脫劑首先流出，吸附能力強的組分后流出，分段接收, 以此達到分離、提純的目的。2.薄層色譜原理由于混合物中的各個組分對吸附劑( 固定相 ) 的吸附能力不同, 當(dāng)展開劑（流動相）流經(jīng)

5、吸附劑時, 發(fā)生無數(shù)次吸附和解吸過程，吸附力弱的組分隨流動相迅速向前移動, 吸附力強的組分滯留在后, 由于各組分具有不同的移動速率，最終得以在固定相薄層上分離。其應(yīng)用主要有: 跟蹤反應(yīng)進程 ; 鑒定少量有機混合物的組成；分離;尋找柱色譜的最佳分離條件等。提問試比較葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素三種色素的極性，為什么胡蘿卜素在層析柱中移動最快？ 講述 【實驗試劑】新鮮菠菜 3、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、硅膠、中性氧化鋁講述和演示 【實驗步驟】.菠菜色素的提取過程取 g新鮮菠菜葉于研缽中拌勻研磨5 分鐘 , 殘渣用 20 的石油醚 - 乙醇（ 2:1) 混合液進行提取, 共提取兩次。把浸取液合并過濾

6、，濾液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入等體積的水洗滌后棄去下層的水- 乙醇層， 石油醚層再用等體積的水洗滌兩次, 以除去乙醇和其它水溶性物質(zhì)。石油醚層用無水Na2 SO4進行干燥、濃縮為2m。取一半做柱層析分離, 其余留作薄層層析分析。.柱色譜的一般過程及菠菜色素的分離:【柱色譜的一般過程】(1 ）選擇吸附劑 :常用的吸附劑：氧化鋁，硅膠，氧化鎂, 碳酸鈣 , 活性炭等選擇規(guī)則 : 吸附劑必須與被吸附物質(zhì)和展開劑無化學(xué)作用；吸附劑的顆粒大小要適中; 可以根據(jù)被提純物質(zhì)的酸、堿性選擇合適的吸附劑。化合物的吸附能力與分子極性的關(guān)系: 分子極性越強 ( 或分子中所含極性較大的基團）其吸附能力也較強。極性基團的

7、吸附能力排序如下：Cl-, Br-, I-<CC<-OCH3<-CO 2R<CO<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-CO2H（2）選洗脫劑 :根據(jù)被分離物各組分的極性和溶解度選擇相應(yīng)極性的溶劑，當(dāng)單一溶劑無法很好洗脫時，可考慮選擇混合溶劑。溶劑的洗脫能力按遞增次序排列如下: 己烷（石油醚 ) 、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、水。( ）裝柱：色譜柱的大小應(yīng)視處理量而定，柱長與直徑之比, 一般為1 :1 20： 1。固定相用量與分離物質(zhì)用量比約為50:1 00:1 。裝柱的方法分濕法和干法兩種

8、, 無論哪一種 , 裝柱的過程中都要嚴格排除空氣 , 吸附劑不能有裂縫。 上樣前必須使吸附劑在洗脫劑的流動過程中進行沉降至高度不變?yōu)橹?，此為壓柱? ）上樣 : 將要分離的混合物用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂? 用滴管沿柱壁慢慢加入吸附劑表面。(5 ）淋洗分離： 當(dāng)被分離物的溶液面降至吸附劑表面時，立即加入洗脫劑進行淋洗, 此時可以配合薄層層析來確定各組分的分離情況?！静げ松氐姆蛛x】取15-2 g 中性氧化鋁進行濕法裝柱。填料裝好后， 從柱頂加入上述濃縮液,先用 9:1 的石油醚 - 丙酮進行洗脫, 當(dāng)?shù)谝粋€橙黃色色帶( 胡蘿卜素 ) 即將流出時 , 換一接收瓶接收, 約需要洗脫劑 40 mL。換用 7

9、: 的石油醚丙酮進行洗脫 , 當(dāng)?shù)诙€棕黃色色帶（葉黃素) 即將流出時，換一接收瓶接收。此時, 繼續(xù)更換洗脫劑, 用3： 1的正丁醇乙醇- 水洗脫，分別在層析柱的上端可見藍綠色和黃綠色的兩個色帶, 此為葉綠素a和葉綠素b。3.薄層色譜(Thin L y Chrom gra hy) 的操作方法：【薄層色譜的操作方法】(1 ）點樣：將樣品用低沸點的溶劑配成1 5的溶液 , 用內(nèi)徑小于1 m的毛細管6 點樣。點樣前，先用鉛筆在薄層板上距一端1 cm處輕輕劃一橫線作為起始線, 然后用毛細管吸取樣品, 在起始線上小心點樣，斑點直徑不超過 2 m；如果需要重復(fù)點樣，則待前次點樣的溶劑揮發(fā)后, 方可重復(fù)點樣

10、 , 以防止樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，影響分離效果。若在同一板上點兩個樣，樣點之間距離在1- 5 c為宜。待樣點干燥后 , 方可進行展開。（2) 展開和展開劑： 薄層展開要在密閉的器皿中進行，加入展開劑 高度為0. cm8 。把帶有樣點的板 ( 樣點一端向下 ) 放在展開器中，并與器皿成一定的角度。蓋上蓋子, 當(dāng)展開劑上升到離板的頂部約1 cm 處時取出 ,并立即標(biāo)出展開劑的前沿位置, 待展開劑干燥后，觀察斑點的位置。(3 ）顯色 : 若化合物不帶色, 可用碘薰或噴顯色劑后觀察，若化合物有熒光, 可在紫外燈下觀察斑點的位置。（4)R 值：一個化合物在薄層板上上升的高度與展開劑上升高度的比

11、值稱為該化合物的R 值:Rf化合物移動的距離展開劑移動的距離【薄層色譜應(yīng)用】當(dāng)實驗條件嚴格控制時，每種化合物在選定的固定相和流動相體系中有特定的R值, 把不同的化合物的fR值的數(shù)據(jù)積累起來可以供鑒定化合物使用。但是，在實際工作中，f 值的重復(fù)性較差，因此不能孤立地用比較Rf 值來進行鑒定。 然而 , 當(dāng)未知物與已知物在同一薄層板上，用幾種不同的展開劑展開時都有相同的f 值時，那RR么就可以確定未知物與已知物相同。當(dāng)未知物的鑒定被限定到只是幾個已知物中的一個時, 利用 TL就可以確定，如圖 (a ）所示。T C也可以用于監(jiān)測某些化學(xué)反應(yīng)進行的情況，以尋找出該反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間和達到的最高反應(yīng)產(chǎn)率

12、。如圖1（ b）所示 , 反應(yīng)進行一段時間后，將反應(yīng)混合物、原料和產(chǎn)物的樣點分別點在同一塊薄層板上，展開后觀察反應(yīng)混合物斑點體積不斷減小體積不斷減小和產(chǎn)物斑點體積逐步增加了解反應(yīng)進行的情況。展開劑前沿A B CD E FD'EF（a）未知物鑒定1小時2小時（b）利用薄層監(jiān)測化學(xué)反應(yīng)圖1A ：已知物； B ：未知物； C：未知物D，D' ：反應(yīng)混合物； E：反應(yīng)物； F：產(chǎn)物板書 薄板層析結(jié)果記錄展開劑前沿碘苯二苯醚碘苯 反應(yīng)液二苯醚（ a）第一步：點樣（ b）展開以后圖2TLC 跟蹤反應(yīng)記錄 講述【菠菜色素的鑒定】取一塊硅膠板，分別點上色素提取液樣點, 胡蘿卜素樣點和葉黃素樣點，分別用石油醚- 丙酮 ( :2) 或石油醚- 乙酸乙酯 ( :4 ）兩種溶劑系統(tǒng)展開，觀察斑點的位置并排列出胡蘿卜素樣點和葉黃素f 值大小的次序。R板書【菠菜色素的提取與分離】研磨石油醚 - 乙醇菠菜菠菜汁萃取液過濾萃取層析色帶、溶液水洗滌柱石