菌落總數(shù)檢測中的注意要點(diǎn))

1、菌落總數(shù)檢測中的注意要點(diǎn)菌落總數(shù)測定一、菌落總數(shù)的概念和測定意義菌落（colo ny）是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上發(fā)育而形成的能被肉眼所識(shí)別的生長物，它是由數(shù)以萬計(jì)的相同細(xì)菌聚集而成的，故又有細(xì)菌集落之稱。菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（clni）內(nèi)，、所含能于某種周體培養(yǎng) 基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的細(xì)菌集落的總數(shù)。菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記，也可以使用這一方法觀察食一中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供科學(xué)依據(jù).二、茵落總數(shù)測定的幾項(xiàng)說明1. 菌落總數(shù)的測定。是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂混合后，每個(gè)細(xì)菌細(xì)

2、胞都能形成一個(gè)可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37C于有氧條件下培養(yǎng)（空氣中含氧約20%），因而并不能測出每g或ml檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生 長，有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂中 發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。2. 鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)，成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在營養(yǎng)瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個(gè)細(xì)胞，因此平板上所得需氧和兼 性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單 位數(shù)（colony

3、forming units， CFU）報(bào)告之。3. 每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)，使用不同的營養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件（如溫度、 培養(yǎng)時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等）去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。因此，要得到較 全面的細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)在不同條件下，如 溫度，氧氣供應(yīng)等。但國家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同食品的菌落總數(shù)的規(guī)定，都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行需氧培養(yǎng)所得的結(jié)果確定的，因此在食品的一般衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中并不要用幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。三、茵落總數(shù)的測定測定食品中菌落總數(shù)時(shí)，是將食品檢樣做成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個(gè)稀釋液中分

4、別取出一定量在平皿內(nèi)和營養(yǎng)瓊脂相混合，經(jīng)培養(yǎng)后，按一定要求計(jì)算出皿內(nèi)瓊脂平板上所 生成的細(xì)菌集落數(shù)，并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每g或ml樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。四、菌落總數(shù)測定中的一些要求和規(guī)定為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時(shí)必須遵循以下一些要求和規(guī) 定。（一）所用器皿及稀釋液1. 檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是完全火菌的，并在火菌前徹底洗滌 干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。2. 用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對(duì)照。如果在瓊脂對(duì)照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要 追加對(duì)照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的 污染。

5、3. 檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水， 但以用磷酸緩沖鹽水特別是 0.1%蛋白胨水為合 適，因蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會(huì)因?yàn)樵谙♂屵^程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對(duì)含鹽量較高的食品（如醬品等）進(jìn)行稀釋，則宣采用蒸餾水。（=）檢樣稀釋1. 檢樣稀釋時(shí)，應(yīng)以無菌手續(xù)稱取（或量?。┯写硇缘臉悠?5g（或 ml）剪碎放于含有225ml滅 菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠），經(jīng)充分振搖作成1: 10的稀釋液。 如系肉、魚等固體樣品，最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)和稀釋液研勻，或和稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯 中（國產(chǎn)均質(zhì)器，目前以江蘇武進(jìn)鄭陸醫(yī)學(xué)儀器廠產(chǎn)品較簡便而

6、實(shí)用），以8000 l OOOOrpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1: 10稀釋液。2. 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，將上述1: 10的檢樣稀釋液再做成幾個(gè)適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1: 10稀釋液1ml和9ml稀釋液混和做成1: 100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1:1 000、1: 10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換 1支l ml 滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。3 從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí)，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時(shí)，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手

7、或其他沾污物。4在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液砸2. 5cm；吸入液體時(shí)，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時(shí)不會(huì)有多余的液體粘附于管 外。5當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有 9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時(shí)，應(yīng)小心沿管壁加入，不 要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。（三）平板接種和培養(yǎng)1 將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時(shí)，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移Iml稀釋

8、液加入皿內(nèi)（從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋），最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖 將余液排出，而不要吹出。每個(gè)稀釋度應(yīng)作2個(gè)平皿。2 用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45±C恒溫水浴中待用。傾注平皿時(shí)，每皿內(nèi)傾入約1.5ml，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。3為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其和瓊脂混和均勻。4. 檢樣和瓊脂混和時(shí)，可將皿底在平面上先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn)，以 使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻，而不濺及皿 邊的上方，可使用江蘇

9、省無錫縣衛(wèi)生防疫站童鶴泉設(shè)計(jì)制成的自動(dòng)平皿旋轉(zhuǎn)儀，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)儀上（可同時(shí)放4只平皿），加入瓊脂后，開動(dòng)電鈕，在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動(dòng)左右 旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣和瓊脂混合均勻。5 皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)；而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng) 將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時(shí)，可先將皿打開倒置（皿底向上）于溫箱內(nèi)經(jīng)1560分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動(dòng)性 強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。6為了控制污染，在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時(shí)，于工作臺(tái)上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時(shí)間， 應(yīng)和該

10、檢樣從制備、稀釋到加入平皿時(shí)所暴露的最長的時(shí)間相當(dāng)，然后和加有檢樣的平皿一并置 于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有 I無受到來自空氣的污染。7培養(yǎng)溫度，應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、，乳、蛋類食品用37C培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30C培養(yǎng)。 培養(yǎng)時(shí)間為48吃小時(shí)。其他食品，如清涼飲料，調(diào)味品，糖果、糕點(diǎn)果脯，酒類（主要為發(fā)酵酒）、豆制品和醬腌萊均系用 37C 24立小時(shí)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時(shí)間之所以有這種不同的區(qū)分，乃 是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時(shí)，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時(shí)間所 取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫摩較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo) 準(zhǔn)時(shí)，系用30r

11、作為培養(yǎng)的溫度。（四）對(duì)照試驗(yàn)1 加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液（特別是10_1的稀釋液），有肘帶有食品顆粒，在這種情況下，為了 避免和細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液和瓊脂混和的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4 C環(huán)境巾放置，以便在計(jì)數(shù)撿樣菌落時(shí)用作對(duì)照。2為了防止檢樣中食品顆粒和菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45C水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml 加Iml O . 5%氯化三苯四氮唑（2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC）水溶液之量加入適量的 TTC。培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，貝U生成紅色菌落.配好的TTC溶液，應(yīng)先用來和不加TTC的作對(duì)照，以觀察其對(duì)

12、計(jì)數(shù)是否有不利的作用 （TTC在一定濃度下對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制作用）。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱和光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan),使菌落呈現(xiàn)紅色，其反應(yīng)式如圖 2-1:(五) 菌落計(jì)數(shù)1 從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個(gè)平皿和不同稀釋度的 幾個(gè)平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗(yàn)的2個(gè)平板和菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個(gè)平板上菌落數(shù)則應(yīng)和檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌 落數(shù)越咼。2. 計(jì)數(shù)菌落時(shí)，

13、應(yīng)選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。1個(gè)稀釋度使 用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)；如其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而 應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中 菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個(gè)稀釋度的兩個(gè)平板中， 一個(gè)平板的菌落數(shù)在30 一 300之間，另一個(gè)大于300或小于30時(shí)，則以菌落數(shù)在30 300間的 平板作為計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。3. 菌落計(jì)數(shù)所得結(jié)果，可分別按以下幾種不同情況作報(bào)告。(1) 若1個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30300之間，則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之，如表2-1

14、中例 1,報(bào)告為 164X102=16400,或 1. 6X104。(2) 若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30 300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，如表 2-1中例2: 46000/29500=1. 6<2,故報(bào)告為：(46000+29500) /2=37750或3.8X04。若大于2,則報(bào)告其中較小的數(shù)字，如表2-1中例3: 60000/27100=2.2>2, 故報(bào)告為：27lOO或2. 7X04。若等于2,亦報(bào)告其中較小的數(shù)字，如表2-1中例4: 3000/1500=2, 故報(bào)告為：1500或1. 5XO3.(3) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)

15、均大于 300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之，如表 2-1 中例 5,報(bào)告為：313X108=313000或 3. 1X105。選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式稀釋液及菌落數(shù)例次10-1 10-2 10-3兩稀釋液 之比 菌落總數(shù)(個(gè)/g或ml)報(bào)告方式 (個(gè)/ g或ml)l 2345678多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)150多不可計(jì)270多不可計(jì)164295 27130多不可計(jì)1l0 30520466083135012-一一1.62.2 2-一一-一一一-一一16400377502710015003l3000270'V| X10305001,6000 或1.6 10438000 或3

16、.8lO427000或2.7 X041500 或 1.5 X03 310000或 3.1 沐05 270 或 2.7。<1031000 或 3. I X 10'釋倍數(shù)報(bào)告之，如表2-1中例6,報(bào)告為：27X10=270或2. 7X102。(5) 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1(<1)乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之，如表2-1中例7,報(bào)告為：<1 >10,或<10。(6) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在 30 300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以 最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之，如表 2-1中例8,報(bào)告為：305X10。=305

17、 或 3. 1X104。4. 注意事項(xiàng)(1) 如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高，則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差 錯(cuò)，屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。(2) 如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂和檢樣混合時(shí)，一個(gè)細(xì) 菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)， 不要把鏈上生長的各個(gè)菌落分開來數(shù)。此外，如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入， 在昆蟲爬過的地方也會(huì)出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開來數(shù)。(3) 如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計(jì)作報(bào)告，而應(yīng)在稀釋度最大的平

18、板上，任意數(shù)其中2cm2個(gè)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm2數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)作報(bào)告。例如10-110-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀釋的平板上任數(shù)2個(gè)cm2。 內(nèi)的菌落數(shù)是 60個(gè)，皿底直徑為 9cm，則該檢樣每 g（或ml）中 估計(jì)”菌落數(shù)為：60/ 2 03. 6X1000=1908000或 1. 9X106。63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時(shí)計(jì)算而得，即：（9/2）2 X. 14=63. 6;如所用平皿的皿底直徑不是9cm,則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。（4）菌落計(jì)數(shù)中，如能使用國產(chǎn)JLQS。型菌落計(jì)數(shù)器（江蘇武進(jìn)鄭陸醫(yī)學(xué)儀器廠產(chǎn)

19、品），則比較方 便，燈光由側(cè)面射向平板，菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號(hào)，用特制金屬探筆點(diǎn)數(shù)中， 在發(fā)出音響之下始顯示數(shù)字增加，不會(huì)發(fā)生差錯(cuò)。且燈光和平板之間夾有多用方格玻質(zhì)規(guī)板（方格 面積為lcm2），也有助于對(duì)菌落密布的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。（5）檢樣如系微生物類制劑（如酸牛乳、酵母制酸性飲料），則平板計(jì)數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物（乳 酸桿菌、酵母菌）排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報(bào)告。一般在校正檢樣的 pH7. 6后，再進(jìn) 行稀釋和培養(yǎng)，此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時(shí)，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對(duì)照，以資辨別。酵

20、 母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為 25X530 m，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在 24小時(shí)內(nèi)，于 普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。（六）報(bào)告方式1.當(dāng)檢樣的菌落數(shù)為I 一 100時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，只記錄左面頭兩位數(shù)字（用兩位 有效數(shù)字作報(bào)告，可避免產(chǎn)生虛假的精確概念），左面第三位數(shù)字則用四舍五入法計(jì)算，從第二位 數(shù)字之后都記為o,為了縮短數(shù)字后面的0數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示，例如菌落數(shù)為37750時(shí), 即可寫成3. 8X05（見表2-1中 報(bào)告方式”欄）。2檢樣的菌落數(shù)如系從菌落密布的平板上按比例計(jì)算而求得，報(bào)告結(jié)果時(shí)，應(yīng)在菌落數(shù)前加上 估計(jì)”二字（見上述菌落計(jì)數(shù)注意事項(xiàng) “ （3）中所舉之例）。3. 檢樣為固體，用重量法取樣檢驗(yàn)時(shí)，以g為單位報(bào)告其菌落數(shù)；檢樣為液體，用容量法取樣檢 驗(yàn)時(shí)，以ml為單位報(bào)告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應(yīng)以cm2為單位報(bào)告其菌落4 如檢樣為液體，在兩個(gè)平皿內(nèi)所加Iml未經(jīng)稀釋的檢樣（原液）培養(yǎng)中，均無細(xì)菌集落生成，則 報(bào)告為Iml檢樣內(nèi)未有菌落生長，或1m1檢樣內(nèi)菌落數(shù)1。五、特殊的方法（一） 平板表面涂布法將營養(yǎng)瓊脂制成平板，經(jīng)50C I 一2小時(shí)或35C