淋巴細胞分離

1、淋巴細胞單核細胞L093L0921.0751,0901.030-1.035淋巴細胞分離與計數(shù)淋巴細胞分離 原理:外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加 以分離。原理紅細胞外周血彳*粒細胞V單個核細胞 <PBMC）“血小板Ficoll： 1.077 + 0.001實驗材料：淋巴細胞分離液肝素稀釋液（生理鹽水）RPMI1640 粉末實驗設備 ： 1ml 移液器、移液管、 5ml 注射器、刻度吸管、 EP 管、離心機、顯微鏡操作流程：1. 在離心管中加入適量淋巴細胞分離液。2. 無菌采集靜脈血若

2、干毫升,注入盛有肝素的無菌小瓶中，（每 1ml 全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液）,加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝3. 稀釋（外周血：稀釋液=1 ： 2 取肝素抗凝血與等量生理鹽水充分混勻）4. 用刻度吸管沿傾斜的管壁，把稀釋血緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll:稀釋血=1: 2）5. 放入離心機1500r/min離心20min （注:緩慢加速1-4檔個3分鐘）6. 用吸管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一離心管中，加入 5 倍以上 體積的稀釋液（生理鹽水），1500rpmx 10分鐘離心，洗滌細胞。7. 重復洗滌一次，1500rpmX 10分鐘離心。8

3、. 末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重懸細胞9. 計數(shù)細胞后再調(diào)整細胞置所需濃度.10. 取一滴細胞懸液與一滴0.2臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。單個核細胞濃度（細胞數(shù)/ 1毫升細胞懸液）=4 個大方格內(nèi)細胞總數(shù) X 104 X 2隔釋彳數(shù)）411. 分離出的淋巴細胞置于培養(yǎng)瓶中二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意事項 :1. 每毫升外周血液大約可獲1 X 106單個核細胞2. Ficoll 應適量，外周血應充分稀釋3. 溫度直接影響到 Ficoll 的比重和分離效果4. 在 Ficoll 上加入稀釋外周血時，應緩慢加，以免沖散界面5. 吸取單個

4、核細胞層時，應避免吸出過多的上清液或分層液而導致血小板污染淋巴細胞計數(shù)：實驗流程：1. 準備計數(shù)板：2. 制備細胞懸液：收集細胞，制成單個細胞懸液3. 加樣：用吸管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液，4. 計數(shù)：在顯微鏡下，用10X物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)5. 計算：將結果代入下式，得出細胞密度胞數(shù) / 毫升原=（4大格細胞數(shù)之和/4 ） X 104編輯版 worddepth = 0.1 mmvofume = 1x10 4 n)iO = counted =not countedFigure 3 Grid paltH-rn <jf improv

5、ed Neubauer ruled1 haemocyfnmHr. inset shows cells (enlarged for clarity dfStrlbated over a primary squaro_ Cells that ar& witnlnr or that touch. the left or top boundary 日/白 counted, white those that touch, ar are Dutsidg, thie lower or right boundeay are not counted.注意事項：1 .取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液2 .加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡3 .細胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右4 .本法要求細胞密度不低于104細胞/ml5 .鏡下計數(shù)時，細胞數(shù)過