淋巴細(xì)胞分離

1、淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞L093L0921.0751,0901.030-1.035淋巴細(xì)胞分離與計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞分離 原理:外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加 以分離。原理紅細(xì)胞外周血彳*粒細(xì)胞V單個(gè)核細(xì)胞 <PBMC）“血小板Ficoll： 1.077 + 0.001實(shí)驗(yàn)材料：淋巴細(xì)胞分離液肝素稀釋液（生理鹽水）RPMI1640 粉末實(shí)驗(yàn)設(shè)備 ： 1ml 移液器、移液管、 5ml 注射器、刻度吸管、 EP 管、離心機(jī)、顯微鏡操作流程：1. 在離心管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。2. 無菌采集靜脈血若

2、干毫升,注入盛有肝素的無菌小瓶中，（每 1ml 全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液）,加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝3. 稀釋（外周血：稀釋液=1 ： 2 取肝素抗凝血與等量生理鹽水充分混勻）4. 用刻度吸管沿傾斜的管壁，把稀釋血緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll:稀釋血=1: 2）5. 放入離心機(jī)1500r/min離心20min （注:緩慢加速1-4檔個(gè)3分鐘）6. 用吸管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一離心管中，加入 5 倍以上 體積的稀釋液（生理鹽水），1500rpmx 10分鐘離心，洗滌細(xì)胞。7. 重復(fù)洗滌一次，1500rpmX 10分鐘離心。8

3、. 末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重懸細(xì)胞9. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞置所需濃度.10. 取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。單個(gè)核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ 1毫升細(xì)胞懸液）=4 個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù) X 104 X 2隔釋彳數(shù)）411. 分離出的淋巴細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意事項(xiàng) :1. 每毫升外周血液大約可獲1 X 106單個(gè)核細(xì)胞2. Ficoll 應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋3. 溫度直接影響到 Ficoll 的比重和分離效果4. 在 Ficoll 上加入稀釋外周血時(shí)，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面5. 吸取單個(gè)

4、核細(xì)胞層時(shí)，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)：實(shí)驗(yàn)流程：1. 準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：2. 制備細(xì)胞懸液：收集細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液3. 加樣：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，4. 計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)5. 計(jì)算：將結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度胞數(shù) / 毫升原=（4大格細(xì)胞數(shù)之和/4 ） X 104編輯版 worddepth = 0.1 mmvofume = 1x10 4 n)iO = counted =not countedFigure 3 Grid paltH-rn <jf improv

5、ed Neubauer ruled1 haemocyfnmHr. inset shows cells (enlarged for clarity dfStrlbated over a primary squaro_ Cells that ar& witnlnr or that touch. the left or top boundary 日/白 counted, white those that touch, ar are Dutsidg, thie lower or right boundeay are not counted.注意事項(xiàng)：1 .取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液2 .加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡3 .細(xì)胞壓中線時(shí)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右4 .本法要求細(xì)胞密度不低于104細(xì)胞/ml5 .鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞數(shù)過