兩株腫瘤細(xì)胞系HLAI類分子基因表達(dá)水平的鑒定及意義

1、兩株腫瘤細(xì)胞系hlai類分子基因表達(dá)水平的鑒定及意義作者：關(guān)德瑩，沈喑，邵紅偉，黃樹林【摘要】 目的探討兩株常見腫瘤細(xì)胞系hela細(xì)胞和 bel 7402細(xì)胞hla i類分子基因表達(dá)水平及其影響ctl 反應(yīng)性的可能意義。方法提取腫瘤細(xì)胞的基因組dna,利用 pcr反應(yīng)在基因組水平鑒定hla i類分子基因的拷貝數(shù)情 況；提取細(xì)胞總rna, rt pcr反應(yīng)合成cdna,利用pcr反 應(yīng)鑒定腫瘤細(xì)胞hla i類分子在rna水平的表達(dá)情況。結(jié) 果兩株腫瘤細(xì)胞的hla i類基因在基因組水平的拷貝數(shù)無 明顯下降；在rna水平上，held細(xì)胞的hla a、hla b 和hla c基因均有表達(dá)，表達(dá)水平無明

2、顯下降,bel 7402 細(xì)胞的hla a和hl a c基因有表達(dá)，但hla c基因表 達(dá)水平降低，而hla b基因未見明顯表達(dá)。結(jié)論rna水平 上，部分hla i類分子基因表達(dá)的降低或缺失推測(cè)可能是 導(dǎo)致bel 7402細(xì)胞比hela細(xì)胞出現(xiàn)ctl反應(yīng)性下降的原 因之一?！娟P(guān)鍵詞】hla細(xì)胞；mr naabstract：object eexpressionlevelofi類分子；hela細(xì)胞；bel 7402 ivetoinvestigatethhlaimoleculegenesndthepossiblesignidnawereextractedfresfordetectingthehere

3、judgedbypcrandagarosegel hlaimolficanceofctlgenomeomthesetwotumor1 inlaimoleculegeneslevelsbyrnafromtwo celllineswereextra ctedforrtpcr,hla imoleculegenes r exp ressiononrnalevelwecu1egenes1evelsdidnotdecreasesignificantlyongenomerna level,hla a,hla ba ndhlacallexpresse dnormal1ywithoutsi £nifi

4、cantdescentinhelacellline theexpressionofhlacwerebothdetectedinbeline,buttheexpressionofhlaaand hla7402celllcgeneshowedsignificantdecease,andnoexpressiono fhlabgeneweredete ctedonrna atrnalev el, reductionorabsencehlaimoleculege nesexpressionofhelacelllinewerenotfound,however,thepartialdescentandabs

5、 enceofhla imolecul egenes f expressioni nbel 7402celllinew asthepossiblereaso nforthereductionof ctlreaction.keywo rds：hla imolecule； helacellline； bel 7 402cellline； mrna人類主要組織相容性復(fù)合物，又稱為人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyt eantigen, hla)系統(tǒng),位于第6號(hào)染色體短 臂約1,按功能差別可大致分為hla i類分子和hla ii類分子兩大類，其中hlai類分子在機(jī)體的細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。研究

6、發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤免疫的核心是機(jī)體針對(duì)腫 瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中cd8+ctl細(xì)胞必需依靠腫瘤自身hlai類分子呈遞的腫瘤抗原才能得以活化發(fā)揮殺傷作用。但 由于腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，會(huì)導(dǎo)致hla i類分子的表 達(dá)下降或缺失，是引起腫瘤免疫耐受形成的重要原因2,3。 因此，了解腫瘤細(xì)胞的hla i類分子表達(dá)情況對(duì)研究如何 打破免疫耐受，開展過繼性細(xì)胞學(xué)治療十分必要。在前期通 過ctl殺傷實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，ctl對(duì)本室保藏的人宮頸癌 細(xì)胞he la的殺傷活性要高于人肝癌細(xì)胞株bel 7402(結(jié) 果未發(fā)表)，為探討此現(xiàn)象的發(fā)生是不是涉及到了腫瘤細(xì)胞 hla i類分子基因的表達(dá)變化，本文在基因組水平及r

7、na 水平對(duì)兩株腫瘤細(xì)胞的hla i類分子基因的表達(dá)情況進(jìn)行 了鑒定分析，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1. 1細(xì)胞he la細(xì)胞、bel 7402細(xì)胞均為廣東藥學(xué)院生物制藥 研究所保藏，健康人外周血由廣州市血液中心提供，用人淋 巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞。1. 2主要試劑與儀器rpm1640培養(yǎng)基、胎牛血清購置gibico公司；t4連接 酶、m mlv 反轉(zhuǎn)錄酶、taq 酶、dntp、rnaseinhibito r. oligodt 均購自 fermen tas 公 司；trizol0020 購 自 invitrogen 公司；depc 購自 sigma 公司；dnamarker dl2000

8、100購自biotec h公司，基因組dna提取試劑盒購自p earl 公司；pcr儀；電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)。1. 3細(xì)胞基因組dna的提取收集傳代培養(yǎng)24h的he la細(xì)胞和bel 7402細(xì)胞，細(xì) 胞數(shù)約為2x106,按照基因組dna提取試劑盒的使用說明進(jìn) 行操作，將提取獲得的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按 相同方法，提取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組dna作為 對(duì)照。1. 4 pcr反應(yīng)鑒定基因組水平hla i基因的拷貝數(shù) 情況根據(jù)genban k中已公布的人hla i類基因hla a、 hla b和hla c核酸序列，共設(shè)計(jì)3對(duì)通用pcr反應(yīng)引 物，并設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)gapdh基因組序列

9、的內(nèi)參引物，委托廣州英駿公司合成，4對(duì)引物序列具體為:pga1：57 c ctctgyggggagaagcaa 3r , pga2:5' gactca gaagtgctggactc 3'；pgb1: 5 gggagga gcgaggggaccscag 3r ,pgb2: 5 ggaggccat ccccg£c£acctat3 ；pgc1: 5' agcgaggk gcccgcccggcga 3' , p gc2: 5r ggagatgggga aggctccccact3 ;pgg1:5f aaggtcggag tcaacgg 3' ,

10、 pgg2:5f atctcgggcgggaatag 3用50ul反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其參數(shù)為：95匸預(yù)變性3niin 后，按95°c25s、60°c30s、72 °c80s進(jìn)行8個(gè)循環(huán)反應(yīng)，然 后按照9 5°c20s. 55°c30s. 72°c90 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)， 最后延伸7min。pcr產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。1. 5 rt pcr反應(yīng)鑒定rna水平hla i基因的表達(dá) 情況分別收集3x106hela細(xì)胞、bel 7402細(xì)胞及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，按trizolreage nt使用說明進(jìn)行抽提細(xì) 胞總rna,以

11、rna為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系中 加入 10mmol/l 的 dnt ps2 u l. rnaseinhibit or20u. oligodt u g、rna 模板 6ul、5xbuffer8nl、m mlv 逆轉(zhuǎn)錄酶 200u,加無菌去離子水至終體積40nlo混勻后42 £反應(yīng) 60min,最后90°c5min滅活m mlv活性，4*保存合成的c dnao擴(kuò)增hla a、b. c 3個(gè)基因及內(nèi)參gapdh基因的引物 均由invitrogen公司合成。具體序列如下：pra1: 5'ga cgacacgcagttc£tgc 3f , pra2:

12、5fttggacc gcggcggacatg 3'prb1: 5f accagagcg aggccgggt 3f , prb2： 5r ctggaccgccgcgga cac 3f ；prc1: 5 cgccgcgagtccgagagg 3f , prc2： 5z ctggac cgccgcggacac 3 ；prg1: 5' aggtcggag tcaacggatttg 3r , pr g2： 5'用50 ul反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其參數(shù)為：9c預(yù)變性3min, 按94°c60s, 55 °c40s, 72°c60s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)。2 結(jié)

13、 果2. 1基因組dna的提取鑒定%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示試劑盒法提取的hela細(xì)胞、 bel 7402細(xì)胞及健康人pbmc基因組dna條帶明亮，無明 顯托尾，能滿足作為pcr反應(yīng)擴(kuò)增模板的需要，見圖1。marker； of heal t hypeople； cell；74 02cell圖1基因組dna凝膠電泳gelelectrophor esisanalysisofgeno medna2. 2 hla i類基因在基因組水平拷貝數(shù)情況的鑒定利用特異性pcr引物進(jìn)行pcr反應(yīng)檢測(cè)基因組水平hlai類基因的拷貝數(shù)情況，結(jié)果見圖2, hela細(xì)胞和bel 7402細(xì)胞的hla i類基因在基因組水平

14、的表達(dá)與健康人 pbmc無明顯差別。2. 3細(xì)胞總rna提取鑒定從hela細(xì)胞和bel 740 2細(xì)胞中，提取出總rna, 1% 瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果顯示提取的總rna有3條帶，從上至 下分別為28s, 18s, 5s,其中18s和28s這2條帶的rna 亮度明顯高于5s帶，證明rna降解較少，所提取rna質(zhì)量 較高，能滿足下一步rt pcr反應(yīng)的需要，見圖3。marker； age neo fhealthypeople；ag eneofhela；ageneof bel 7402； bgeneofheaithypeople； bgen eofhela； bgeneofbel 7402； cge

15、neofhea1thypeople；cgeneo fhela； cgeneofbel7402；geneofhealthypeople；geneofhela；geneofbel 7402.圖2 基因組水平hla i基因pcr結(jié)果pcrresuitsofhla igeneatgenomelevelcell 7402cell圖3腫瘤細(xì)胞rna凝膠電泳圖ge 1 electrophoresiso fthernaoftumorcell s2. 4 hlai類基因在rna水平上的表達(dá)情況2. 4. 1 he la細(xì)胞hla i類基因的表達(dá)以h ela 細(xì)胞cdna為模板，進(jìn)行hla i類基因的pcr擴(kuò)增，

16、2%的瓊 脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示hela細(xì)胞hla a、hla b和hlac3基因都擴(kuò)增出比較明亮的dna條帶，對(duì)照組健康人pbmc 無明顯差異，見圖4中2,5 ,8,11泳道。2. 4. 2 bel 7402細(xì)胞hla i類基因的表達(dá) 利 用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)bel 7402細(xì)胞hla i類基因 擴(kuò)增情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示hla a基因的擴(kuò)增條帶較明 亮與對(duì)照組無明顯差別，hla c基因的擴(kuò)增條帶亮度較對(duì) 照組有明顯的降低，而hla b基因未見dna條帶擴(kuò)增出來， 見圖4中3, 6, 9, 1 2泳道。3討論人類主要組織相容性復(fù)合物，又稱為人類白細(xì)胞抗原( humanleukocytean

17、ti gen, hla)系統(tǒng)是一個(gè)很大的基因家族, 在脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。在機(jī)體的腫瘤免 疫應(yīng)答過程中，hla i類分子限制的cd8+細(xì)胞毒性t淋巴 細(xì)胞(ctl)發(fā)揮著重要作用，腫瘤免疫應(yīng)答刺激信號(hào)的產(chǎn)生 主要涉及到mhc 抗原肽 tcr三原體結(jié)構(gòu)的生成4。marker； a geneofhealthypeopl e； ageneofhela； ag eneofbel7402； bge neofhealthypeople；bgeneofhela； bgen eofbel 7402； cgene ofhealthypeople； c geneofhela； cgeneo fbe

18、l 7402； geneofhe althypeople； geneof hela； geneofbel 740 2.圖4 rna水平hla i基因pcr結(jié)果pcrresultso fhla igeneatrnalev elhlai類分子的表達(dá)異常是發(fā)生腫瘤免疫逃逸，形成免疫耐受的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤細(xì)胞中都存在 著hla基因丟失或表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。有研究利用免疫組化檢 測(cè)證實(shí)，25%7 5%的惡性腫瘤細(xì)胞有不同形式的hlai類 分子表型改變，從hu i類分子陽性上皮細(xì)胞衍生的腫瘤 細(xì)胞中，39%88%存在hlai類分子的表達(dá)下降或丟失， 而正常細(xì)胞均表現(xiàn)為hlai類分子陽性。以上數(shù)據(jù)

19、證明腫瘤細(xì)胞的hla i類分子的表達(dá)降低或缺失是惡性腫瘤的一 個(gè)較為普遍的病理性改變，是腫瘤區(qū)別正常組織的一項(xiàng)重要 指標(biāo)5 。在前期研究中，我們利用ctl對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株hela 細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞株bel 7402細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞殺傷活性實(shí) 驗(yàn)，mtt及細(xì)胞因子釋放等結(jié)果證實(shí)hela細(xì)胞表現(xiàn)出比bel740 2細(xì)胞更高的clt反應(yīng)性，為了證實(shí)腫瘤細(xì)胞hla i 類分子基因表達(dá)的下降或缺失是否是導(dǎo)致這種ctl反應(yīng)差異 性的原因，本研究主要從基因組和rna兩個(gè)水平，探討這兩 株腫瘤細(xì)胞hla i類分子基因的表達(dá)情況。利用特異性引 物pcr反應(yīng)的方法，證實(shí)在基因組水平上，hela細(xì)胞和bel7402細(xì)胞

20、的hla i類分子基因的拷貝數(shù)與健康人pbmc 無明顯差別。在rna水平上，hela細(xì)胞hla i類基因的轉(zhuǎn) 錄水平與健康人細(xì)胞相比無明顯下降；bel 7402細(xì)胞hlaa基因的轉(zhuǎn)錄水平也無明顯降低，但其hla b和hlac基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，hla c基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì) 照組明顯降低，而hla b基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能用rt pcr 的方法檢測(cè)到，表現(xiàn)為表達(dá)的完全缺失。以上研究結(jié)果證實(shí), rna水平上bel 7402細(xì)胞的hla c基因表達(dá)降低和hlab基因表達(dá)缺失，而hela細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的hla i類分 子表達(dá)降低和缺失，這可能是bel 7402細(xì)胞發(fā)生免疫逃 逸，引起clt反應(yīng)性下降的

21、原因之一 6。本研究從基因組和rna兩個(gè)水平驗(yàn)證了 2株細(xì)胞的hlai類基因表達(dá)情況，有些腫瘤發(fā)生的hla表達(dá)異常可能存 在于hla i類分子蛋白合成階段7 ,因此，要更全面地 了解腫瘤細(xì)胞hl a i類基因的表達(dá)情況，還需要在hla 分子蛋白表達(dá)水平上進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 campoli m,changcc,ferroneclasslantigenloss,tumorimmuneescapeandimmuneselection j vaccine,2002,20：40.2 kassr,bello nes,palmierim,etof tumor specifichlac lasslrestrictedcyt otoxicityintumorin f i1trat i nglymphocytesofadvancedbreas tcancerpatientsbyi nvitrostimulationw ithtumorantigen pu lsedautologousdend riticcells j brea stca