進(jìn)出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法—ELISA編制說明

1、進(jìn)出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法 ELISA 法編制說明一、標(biāo)準(zhǔn)制定的任務(wù)來源及意義本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作是由中華人民共和國國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提 出并歸口，由北京出入境檢驗檢疫局研究起草，計劃編號為2008B184。本標(biāo)準(zhǔn)制定了進(jìn)出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法 ELISA 法。 三聚氰胺（英文名 Melamine，CAS:108-78-1，分子式 C3N6H6）是一種用途 廣泛的有機化工原料，禁止在食品和動物食品中添加，但因其結(jié)構(gòu)中含有多個 氨基氮而被一些不法商販添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源 于 2007 年 3 月美國發(fā)生的寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)美國

2、FDA 證實，貓、 狗死亡是寵物食品的原料受三聚氰胺污染， 并指出其中小麥蛋白原料來自中國， 由此引起了國內(nèi)外對三聚氰胺的高度關(guān)注。三聚氰胺一方面可能殘留于食用動 物組織，進(jìn)而污染畜產(chǎn)品食品；另一方面，三聚氰胺也可以直接污染小麥、大 米等谷物食品。無論何種污染途徑， 都可能危害人類健康、 甚至造成人類中毒、 死亡的危險。 2008年 9月16日，國家質(zhì)檢總局公布了全國嬰幼兒配方奶粉 22 家生產(chǎn)企業(yè)的 69 批次產(chǎn)品檢出了含量不同的三聚氰胺的檢查結(jié)果， 再次將三聚 氰胺聚焦為食品安全檢測中的重要檢測對象。三聚氰胺在食品中的限量值，目前僅針對乳和乳制品。對于嬰幼兒配方奶 粉限量值我國和香港地區(qū)、

3、澳大利亞、新西蘭、加拿大以及歐盟都制定在 1mg/kg，美國沒有對嬰幼兒配方奶粉制定一個控制的限量；我國對其他乳和含 乳 15%的食品限量值為 2.5mg/kg 。三聚氰胺傳統(tǒng)的檢測方法有重量法、 升華法， 但方法檢測限不能滿足要求。近來發(fā)展起了色譜法。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布飼料中 三聚氰胺的測定公告，確定了飼料中三聚氰胺測定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T1372-2007 ，該標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法 （HPLC）和氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法 （ GC/MS ），HPLC 法最低定量限為 2mg/kg，GC/MS 法最低定量限為 0.05mg/kg。 2008年 10月 7號，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)

4、化管理委員會批準(zhǔn) 發(fā)布了原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法 （GB/T 22388-2008）國家標(biāo)準(zhǔn)， 規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜 -質(zhì)譜 /質(zhì)譜法三種方 法為三聚氰胺的檢測方法，檢測定量限分別為 2 mg/kg 、0.05 mg/kg 和 0.01 mg/kg。2008年10月 15日，又發(fā)布了原料乳中三聚氰胺快速檢測 液相色譜法(GB/T22400-2008)國家標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的定量限為 0.3 mg/kg然而，盡管色譜法已經(jīng)很多，但不能完成現(xiàn)場大量樣本的檢測，而基于抗 原抗體反應(yīng)的免疫檢測方法是一項大樣本量現(xiàn)場快速的、準(zhǔn)確的、成熟的篩查 檢測技術(shù)。本項目是參照美

5、國 Abraxis LLC 公司建立的動物源性食品中三聚氰 胺快速檢測方法 -ELISA 法，制定相應(yīng)的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，作為 GB/T 22388-2008 和 GB/T22400-2008 方法的補充，為實驗室和現(xiàn)場針對動物源性食 品中三聚氰胺快速篩查提供檢測依據(jù)，更為保障我國人民食品安全及對外出口 貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。二、編制依據(jù)1. 本標(biāo)準(zhǔn)是按照 GB/T 1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編 寫的規(guī)則、/GN/T 20001.4-2001標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第 4 部分：化學(xué)分析方法 及 SN/T 0001-1995出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒

6、素檢驗方法標(biāo)準(zhǔn) 編寫的基本規(guī)定(簡稱基本規(guī)定)的要求編寫的。2. 本標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)大量實驗研究、評估和驗證后制定的。三、方法概述基于競爭性 ELISA 的原理。先用甲醇 -磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)溶液將三聚氰 胺從樣品中萃取出來，再將所獲得的樣品萃取液與三聚氰胺辣根過氧化物酶 ( HRP)耦合物和標(biāo)準(zhǔn)品一起加入包備有三聚氰胺抗體的多孔試劑板的微孔中 發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過 30 分鐘的培養(yǎng)，樣品中的三聚氰胺和三聚氰胺 HRP 酶耦合物 與三聚氰胺抗體競爭性結(jié)合。 經(jīng)過這 30 分鐘的培養(yǎng)， 任何沒有結(jié)合的三聚氰胺 和三聚氰胺 HRP 酶耦合物將被沖洗掉， 顯色酶底物加入微孔中， 任何結(jié)合的酶 耦合物都會使

7、液體呈現(xiàn)藍(lán)色。經(jīng)過 10-20 分鐘的培養(yǎng)，反應(yīng)結(jié)束，用酶標(biāo)儀讀 數(shù)。將未知樣品的讀數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)比較就能得出樣品中的三聚氰胺濃度。四、主要實驗技術(shù)論證酶聯(lián)免疫法之所以能夠方便快捷地應(yīng)用在食品分析中主要是由于其不需 要經(jīng)過繁瑣的凈化步驟， 從而大大縮短了時間。 實驗比較了超純水、 PBS、PBST 等幾種常用的掩蔽劑對于消除基質(zhì)影響的作用情況。 結(jié)果顯示采用 PBS 作為基 質(zhì)掩蔽劑可較好地消除基質(zhì)影響。五、方法的主要技術(shù)指標(biāo)1、方法檢測限研究建立的三聚氰胺直接競爭 ELISA 檢測方法，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍 為 20500 g/L 。經(jīng)加標(biāo)回收試驗，針對嬰兒奶粉和嬰兒豆奶粉的檢測限 1.0

8、mg/kg，液態(tài)奶及含乳巧克力、乳清粉、酸奶等含乳食品樣品經(jīng)前處理及掩 蔽劑稀釋后的檢測限 2.5mg/kg，均滿足目前三聚氰胺的安全限量標(biāo)準(zhǔn) （MRLs ） 的要求， 即針對嬰幼兒為 1.0mg/kg 和其他乳品和含乳制品為 2.5mg/kg 。同時 本方法還使用于肉類（雞、魚肉） 、雞蛋和醬油。2、方法精密度 嚴(yán)格按本標(biāo)準(zhǔn)所確定的操作程序，對三聚氰胺檢測進(jìn)行了精密度的測試， 分別以板內(nèi)變異和板間變異表示。取六個含不同三聚氰胺濃度的實驗樣品，進(jìn) 行 ELISA 分析，每個濃度實驗樣品作 10 個復(fù)孔，對測得抑制率（ IC ）進(jìn)行分 析，變異系數(shù)均 10 %。取六個不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，

9、進(jìn)行 ELISA 分 析，每個濃度每天作兩次分析，綜合 5 天測得的抑制率（ IC ）吸光度值進(jìn)行分 析，變異系數(shù)均 10 %。3、方法準(zhǔn)確度選擇 10種不含三聚氰胺的樣品， 分別添加三聚氰胺至樣品中 3 個不同含 量水平，提取后采用直接競爭 ELISA 方法檢測，計算樣品加標(biāo)回收率，以加標(biāo) 回收率表示檢測方法的準(zhǔn)確度。 結(jié)果顯示， 回收率均在 81-128%之間（見表 1）。表 1 不同樣品中三聚氰胺的加標(biāo)回收率（ n6）樣品加標(biāo)水平 （mg/kg）平均回收率（ %）雞蛋1.81005841088冰激淋2.410451021098巧克力2.5965941088液態(tài)奶0.061170.2512

10、00.5102酸奶0.161060.251120.5105肉類（雞肉）1.25812.592590乳糖0.021200.051120.1122嬰兒豆奶粉0.81242.51255128嬰兒奶粉0.11100.259611164、方法特異性抗三聚氰胺抗體與三嗪類似物的交叉反應(yīng)可用最低檢測劑量（ LLD ，約為 90%B/Bo）或用抑制 50%的吸光值所需的劑量（ 50%B/Bo）表示。表2 抗三聚氰胺抗體交叉反應(yīng)化合物L(fēng)LD ( ng/mL )50%B/Bo (ng/mL)三聚氰胺10400三聚氰酸400>10,000三嗪>10,000>10,000三嗪二銨0.12由表 2 可

11、以看出所制備的抗三聚氰胺抗體與三嗪二銨有交叉反應(yīng)， 與三聚 氰酸和三嗪的交叉反應(yīng)性則很低。5、三聚氰胺檢測的液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法驗證及實際應(yīng)用依據(jù) GB/T 22388-2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法中的液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ UPLC-MS/MS ）驗證本研究建立的 ELISA 方法，結(jié)果見表 3 結(jié)果表明，三聚氰胺直接競爭 ELISA 檢測與儀器分析結(jié)果一致，但儀器方法回 收率偏低。表 3 三聚氰胺直接競爭 ELISA 檢測與儀器分析結(jié)果對照（ n=3）樣品加標(biāo)水平ELISAUPLC-MS/MS(mg/kg)回收率 （%）回收率 （%）冰激淋2.410479.3液態(tài)奶0.

12、0611789.4酸奶0.1610674.7嬰兒奶粉0.111079.4應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)方法對約 40 個實際樣品進(jìn)行了三聚氰胺的定量分析，并隨機 抽取了陰性檢出結(jié)果樣品（ n=20），再以液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法分析，均未檢出 三聚氰胺殘留，表明陰性檢出準(zhǔn)確率為 100%，即假陰性為 0%；進(jìn)一步對陰性 樣品（ n=20）進(jìn)行三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)添加實驗，添加水平為 0.1 mg/kg 2.4 mg/kg 以本標(biāo)準(zhǔn)所建立的 ELISA 方法與液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行比對分析，添加樣 品的測定結(jié)果均為陽性，且回收率分布在 70% 110% 之間。6、實驗室間驗證試驗 分別對液態(tài)奶和雞肉樣品添加三聚氰胺，針對

13、液態(tài)奶添加水平分別為 0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0mg/kg，針對雞肉樣品添加水平分別為 1.8、5.0 mg/kg、 10.0 mg/kg。上述樣品經(jīng)北京化工大學(xué)分析測試中心、中國疾控中心、河北局、天津 局、北京生命科學(xué)研究所等五個實驗室的有關(guān)技術(shù)人員運用該測定方法進(jìn)行驗 證，檢測結(jié)果如表 4。表 4 驗證實驗結(jié)果及實驗室間精密度樣品名稱液態(tài)奶雞肉添加水平 mg/kg0.51.02.01.85.010.0參 加 單 位北京化工大學(xué)分析測試中心0.4571.011.831.454.529.250.4120.921.791.574.388.15中國疾控 中心0.4470.891

14、.781.694.817.970.4340.931.881.594.278.13河北出入 境檢驗檢 疫局0.4010.871.661.474.118.280.3950.971.611.784.368.69天津出入 境檢驗檢 疫局0.4110.831.731.834.339.010.3980.891.851.514.098.73北京生命 科學(xué)研究 所0.3881.051.881.884.028.110.4490.941.831.624.168.51平均回收率 (%)0.420.931.781.644.318.48RSD (%)5.76.65.39.05.15.8六、結(jié)論本標(biāo)準(zhǔn)簡便易行， 可快速、準(zhǔn)確地對食品及農(nóng)產(chǎn)品中的三聚氰胺殘留進(jìn)行篩選檢驗。方法的準(zhǔn)確度、精確度、檢測限均符合殘留物檢測的定量要求。參考文獻(xiàn)主