木瓜中齊墩果酸的提取、分離及鑒定

1、木瓜中齊墩果酸的提取、分離及鑒定(作者:單位:郵編:)摘要:從木瓜中提取分離鑒定齊墩果酸方法:采取回流法索氏提取法和冷浸法從木瓜中提取齊墩果酸,然后采用酸堿沉降法氯仿萃取法分離純化，并用高效液相色譜法進行鑒定結(jié)果:結(jié)果顯示回流法提取效果最好結(jié)論:為齊墩果酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)關(guān)鍵詞:木瓜;齊墩果酸;提取;分離;高效液相色譜法0前言木瓜，又稱皺皮木瓜,鐵腳犁，酸木瓜等，為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的果實木瓜是具有食用，藥用觀賞的多用途植物，果實成熟 后，色澤金黃，氣味芳香,果實營養(yǎng)極為豐富齊墩果酸(oleanolic acid),分子式為c30h48o3,是木瓜的主要有效成分，別名土當(dāng)

2、歸酸,大部分 以游離酸或糖昔的形式存在，為五環(huán)三菇類化合物，是我國首次從植物 中發(fā)掘出來的，是治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎比較理想的藥物本實驗以干木瓜為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗,優(yōu)化提取齊墩果酸的最佳工藝條件通過酸堿沉降或氯仿萃取的 方法分離純化，最后經(jīng)高效液相色譜法對其進行鑒定該種方法準(zhǔn)確可 靠，為初步研究建始木瓜中齊墩果酸提供試驗基礎(chǔ)，為齊墩果酸的工業(yè) 化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)1材料與方法1.1材料1.1.1試驗原料干木瓜片，粉碎機粉碎1.1.2試驗的主要儀器和設(shè)備hhs型電熱恒溫水浴鍋,re52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,722可見 分光光度計，紫外分光光度計，電子天平，分

3、析天平，液相設(shè)備，分析 柱:hypersil ods25pm1.1.3試驗主要試劑95%工業(yè)酒精，分析醇的95%乙醇甲醇冰醋酸高氯酸濃硫 酸乙酸乙酯香草醛，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品1.2方法1.2.1齊墩果酸提取方法的比較回流提取法:稱取木瓜粉25g,分別用100ml,80ml,70ml的95%1業(yè)酒精在609下回流提取，時間依次為4,3,2小時,合并提取 液,用乙醇定容至250ml,作為供試樣(2) 索氏提取法:稱取木瓜粉25g,用95%工業(yè)酒精在索氏提取器中提取，在909下至虹吸下溶液近無色(約8小時),將提取液轉(zhuǎn)移 至250ml容量瓶，定容至刻度作為供試樣(3) 冷浸提取法:稱取木瓜粉25g,用9

4、5%1業(yè)酒精150ml浸提一周，再用100ml乙醇浸提5天，合并浸提液，將提取液轉(zhuǎn)移至250ml 容量瓶，定容至刻度作為供試樣1.2.2比色法測定齊墩果酸的含量精密稱取香草醛0.3g,用移液管加入6ml冰醋酸，配置成5%香草醛冰醋酸溶液分別取回流法，索氏提取法和冷浸法提取的樣品0.0伽1(每種做3個平行)加入試管中,加熱揮發(fā)溶劑，試劑空白為對照 精密加入新制的香草醛冰醋酸0.2ml和高氯酸0.8ml,在709恒溫水 浴加熱15分鐘流水冷卻至室溫，精密加入乙酸乙酯4ml,搖勻,在波長 560nm處測定吸光值，比較三種方法提取率1.2.3回流提取的單因素實驗(1) 溫度對提取率的影響:分別稱取10

5、g木瓜粉，以95%1業(yè)酒精，料液比為伯5,按40,50,60,70,809五個溫度梯度提取9h,提 取3次，合并提取液，定容至250ml分別取0.01ml提取液加入試管中, 通過比色法測定齊墩果酸的含量(每個樣品3個平行)(2) 時間對提取率的影響:分別稱取10g木瓜粉，以95%1業(yè) 酒精，料液比為伯5,按3h,5h,7h,9h,11h五個時間梯度，置于609水浴 鍋，提取 3 次，時間間隔分另！i為 1.5,1,0.5h;2.5,1.5,1h;3,2.5,1.5h;4,3,2h;4.5,3.5,3h 合并提取液，定容至250ml分別取0.01ml提取液加入試管中，通過比色法測定齊墩果酸 的含

6、量（每個樣品3個平行）料液比對提取率的影響：按料液比為1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,以 95%1 業(yè)酒精，置于 60°c水浴鍋中 9h,提取 3 次，每 次 的 溶劑 用 量 為 25,15,10ml;50,30,20ml;70,50,30ml;90,70,40ml;100,80,70ml 合并提 取液,定容至250ml分別取0.01ml提取液加入試管中,通過比色法測 定齊墩果酸的含量（每個樣品3個平行）1.2.4正交試驗優(yōu)化回流提取的工藝在單因素實驗基礎(chǔ)上，考察溫度（a）,提取時間但），料液比（c）3個因素，每個因素3個水平，進行正交實驗因素-水平表見表1-1所示

7、1.2.5齊墩果酸的分離純化酸堿沉降法:準(zhǔn)確稱取4gnaoh固體，加入100ml水，配成1mol/ml的naoh溶液量取10ml濃硫酸，將其緩慢倒入90ml水中, 配成10%硫酸溶液取一份回流供試樣將其旋轉(zhuǎn)真空濃縮，濃縮成浸膏 狀物，回收乙醇,浸膏狀物質(zhì)用1mol/inaoh溶液煮40分鐘，趁熱過濾, 重復(fù)3次，合并濾液用10%硫酸溶液調(diào)ph=1，沸水浴4小時,氯仿萃取蒸館回收氯仿，得固體齊墩果酸用甲醇定容至100ml(2)氯仿萃取法:取一份回流供試樣將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮成浸膏狀物，回收乙醇，所得浸膏狀物質(zhì)先后用水和氯仿洗滌,合并洗滌液, 去水層，有機層用水洗滌6次,去水層，蒸憎氯仿,所得齊墩果

8、酸用甲醇 定容至100ml1.2.6齊墩果酸的hplc鑒定(1)色譜條件:色譜柱為odsc18色譜柱，柱溫25°c,流速1ml/min,紫外檢測波長215nm,流動相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制灘確稱取10mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，加 甲醇溶解，置于10ml帶刻度的試管中，配成1mg/ml的對照品溶液(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用取樣槍準(zhǔn)確吸取 0.1 ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml對照品溶液,加甲醇補充至10ml,混合 均勻，得到濃度為 o.oimg/inl, 0.02mg/ml, 0.03mg/ml, 0.04mg/ml, 0.05mg/

9、ml的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液每次取20pl進樣，測定其峰面積以齊 墩果酸濃度(x)和峰面積(y)求回歸方程(4) 精密度測定:取上述對照品20pl,重復(fù)5次進樣，測定各自 峰面積(5) 重復(fù)性實驗:取同一樣品平行制備5份供試品溶液，在 上述同樣色譜條件下分別進樣20pl,測定其峰面積(6) 加樣回收實驗:準(zhǔn)確量取已知含量的齊墩果酸樣品溶液 1ml,加入0.2mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，做5個平行，在上述色譜條件下分 別進樣20pl,測定其峰面積2結(jié)果與分析2.1提取方法的比較木瓜中齊墩果酸的提取法主要有回流提取法,索氏提取法,冷浸提取法等方法，三種提取方法中，回流提取的效果明顯好于其他兩種方法，索氏提取所

10、需溫度在809以上,可能會對齊墩果酸的結(jié)構(gòu)造成破壞，而冷浸則提取溫度相對較低，提取不完全，故而這兩種方法的 提取率低于回流法提取因此，本研究采用回流提取法進行下一步試驗, 并在單因素試驗基礎(chǔ)上,通過正交試驗優(yōu)化提取工藝2.2單因素實驗2.2.1溫度對提取率的影響為了選擇正交試驗合適的溫度條件，用95%的工業(yè)酒精，在 相同的提取時間，料液比的條件下，對溫度進行單因素試驗，其提取率 的變化情況在40°c-70°c范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，分子的活性增大，擴 散速度加快，浸出速度也加快，因此提取率升高，在709處為最大值，但 是80紇時提取率有所下降,一方面可能是由于溫度過高對齊墩

11、果酸的 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，另一方面則可能是因為溫度過高引起乙醇的揮發(fā)，造成 溶劑損失因此選定50oc,60oc,70°c作為正交試驗的溫度因素的三個 水平2.2.2時間對提取率的影響在相同的提取溫度，料液比的條件下分別控制不同的提取時間，考察提取時間對提取效果的影響其提取率的變化情況顯示:提取 時間短則齊墩果酸來不及溶出，提取率較低，隨著時間的延長,木瓜中 齊墩果酸的提取率逐漸增高，其增長率分別為 94.9%,9.5%,8.4%,1.7%由此可以看出,5h以后提取率的增長逐漸趨 于緩和提取時間的延長雖然可以提高提取率，但是長時間的提取雜質(zhì) 的溶出率也會相應(yīng)升高因此從經(jīng)濟高效等原因考慮，為

12、節(jié)約時間降低 能耗，選擇5h,7h,9h作為正交試驗中時間因素的三個水平2.2.3料液比對提取率的影響在相同的提取溫度,時間的條件下，分別選取不同的料液比,考察其對提取效果的影響其提取率的變化情況顯示隨著料液比的升高,由于溶劑的量的增加，其提取率也相應(yīng)的不斷增加,增長率分別為73.9%,37.7%,60.4%,4.9%由此可以看出, 當(dāng)料液比達到仁20以后，提取率的上升趨勢逐漸趨于平緩在實驗條件 范圍之內(nèi),料液比1:25時為最大提取率但是料液比不宜過多,否則不 僅浪費溶劑，而且增加濃縮工作量因此選擇1:5,1:20,1:25作為正交 試驗料液比因素的三個水平2.3正交實驗優(yōu)化提取工藝以乙醇為溶

13、劑的三因素三水平正交實驗結(jié)果見表2，對表中齊墩果酸的提取率進行方差分析和顯著性檢驗結(jié)果見表2-2正交 實驗和數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明，溫度，時間，料液比對提取率影響的大小 為溫度時間料液比木瓜中齊墩果酸的最佳提取條件為a3b3c3即:溫 度70°c,提取時間9h,料液比1:252.4高效液相色譜法鑒定齊墩果酸用外標(biāo)法對進行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品與回流提取純化樣品對比的hplc圖譜分別見圖123經(jīng)計算得木瓜中齊墩果酸的 含量為1.28mg/g色譜條件:0dsc18色譜柱，柱溫25°c,流速1ml/min,紫外檢測波長215nm,流動相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1色譜條件:

14、odsc18色譜柱，柱溫259,流速1ml/min,紫外檢測波長215nm,流動相為甲醸水：乙酸=90:10:0.11:齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2:氯仿萃取純化樣品色譜條件:odsc18色譜柱，柱溫259,流速1ml/min,紫外檢測波長215nm,流動相為甲醸水:乙酸=90:10:0.1齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2:酸堿沉降純化樣品2.4.1線性關(guān)系考察如圖4所示，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程y二4099733x + 22375,r2=0.9918,結(jié)果表明齊墩果酸在0.01-0.05mglml與峰面積呈良好的線性關(guān)系色譜條件:0dsc18色譜柱，柱溫259,流速1ml/min,紫外檢測波

15、長215nm流動相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.12.4.2精密度實驗用標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣5次，每次進樣20il,齊墩果酸峰面積值rsd為2.23%5%,精密度良好2.4.3重復(fù)性實驗取同一樣品平行制備5份供試品溶液，在上述同樣色譜條 件下分別進樣20兒測定其峰面積，所得rsd值為345%5%,靈敏度良 好2.4.4加樣回收實驗準(zhǔn)確量取1.28mg/g的齊墩果酸樣品溶液1ml,加入0.2mg 的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，做5個平行，測定其峰面積，經(jīng)計算其平均加樣回收 率為97.8%,準(zhǔn)確度良好3討論3.1關(guān)于提取有報道用氯仿，甲醇作為提取溶劑，本實驗所選用的溶劑為95%工業(yè)酒精在這三種提取方法中，索

16、氏提取與回流法都需要加熱，實驗結(jié)果也相差不大，但回流法的實驗條件更易于控制，冷浸法不需要加 熱，但是花費時間長3.2關(guān)于比色法測含量可以與齊墩果酸發(fā)生顯色反應(yīng)的試劑有十余種，資料表明用這些試劑顯色，都可進行齊墩果酸比色測定但經(jīng)本實驗發(fā)現(xiàn),用香草主要的是穩(wěn)定性差，甚至同時做的平行試樣，時間稍有不同吸光值就有 變化因此，本實驗選用香草醛高氯酸為顯色劑用此方法顯色時應(yīng)注意 以下幾個問題:水分對測定有干擾，因此容器必須充分干燥;提取 的樣品在揮去溶劑時不能過熱，否則齊墩果酸的結(jié)構(gòu)會被破壞,這樣會 影響測定結(jié)果;5%香草醛冰醋酸溶液必須臨用前新鮮配制，否則顯 色靈敏度會下降，這可能與香草醛易于被空氣中的

17、氧氧化有關(guān);香草 醛和冰醋酸都容易揮發(fā)，因此加樣時動作要迅速3.3關(guān)于高效液相色譜法鑒定齊墩果酸在色譜條件的建立過程中,開始使選擇了 80%的甲醇作為流動相，但是實驗圖譜顯示并沒有將齊墩果酸分離出來，之后在甲醇中 添加了 1%的冰醋酸,取得了較好的分離效果在進一步實驗的基礎(chǔ)上,最終確定了甲醇:水:冰醋酸=90:10:0.1為流動相，保留時間在7min 左右需要注意的是，流動相配制好后應(yīng)混合均勻,否則會對保留時間有所影響經(jīng)過對齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的紫外掃描,確定了 215nm為檢測波3.4關(guān)于發(fā)展前景齊墩果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成步驟繁多，目前仍依賴從植物中提取得到，雖然借助越來越先進的技術(shù)和越來越精密的儀器,今后人 工合成的比例會越來越大,但由于從植物中提取得到的齊墩果酸為天 然藥物，對人體無任何毒副作用，加之齊墩果酸在植物中分布較廣，藥 源比較豐富，在天然藥物開發(fā)利用已成為世界潮流的今天，齊墩果酸提 取的前景仍很廣闊4結(jié)論(1) 通過不同提取方法的比較,選定回流提取為本研究的提 取方法(2) 木瓜中齊墩果酸的回流提取最佳工藝條件為溫度70°c, 提取時間9h,料液比1:25(3) 分離純化后進行hplc鑒定，建立的色譜條件為 0dsc18色譜柱，柱溫25°c,流速1ml/min,紫外檢測波長215nm,流動 相為甲